fat-1转基因小鼠的构建与鉴定

目的构建和鉴定携带有外源fat-1基因的转基因小鼠。方法将fat-1基因的cDNA与动物表达载体pEF—neo连接,构建pEF-fat-1重组质粒,酶切、测序鉴定正确后,以显微注射法把线性化重组质粒注射到小鼠受精卵的雄原核中,并将受精卵移植到受体鼠的输卵管中产出转基因小鼠,通过PCR、Southern blot杂交等方法确立阳性整合有目的基因的G0代小鼠。结果成功构建了pEF-fat-1重组质粒,将其显微注射到小鼠受精卵中,得到G0代小鼠,PCR、Southern blot杂交确立了4只整合有fat-1基因的首建鼠。结论fat-1基因可整合到小鼠体内,得到的转基因小鼠为研究fat-1基因的生物学功能提供了动物模型。     

同时沉默Livin基因和MTA1基因的siRNA载体的构建

目的:构建同时沉默Livin基因和MTA1基因的小干扰RNA(siRNA)载体.方法:设计Livin和MTA1的siRNA靶序列,合成它们互补的寡核苷酸链,分别退火后重组入pRNAT-U6.2载体,得到pRNAT-U6.2-Livin和pRNAT-U6.2-MTA1.AccⅡ和XhoⅠ酶切pRNAT-U6.2-MTA1,回收475 bp的MTA1 siRNA单元,然后与XhoⅠ和PmeⅠ酶切线形化的pRNAT-U6.2-Livin重组,得到pRNAT-U6.2-Livin-MTA1,后者用脂质体包被转染人食管癌细胞EC9706,采用RT-PCR法分别检测转染细胞Livin和MTA1基因mRNA的表达情况.结果:针对Livin基因和MTA1基因的siRNA的双链寡核苷酸片段分别克隆入pRNAT-U6.2载体,经测序分析插入片段正确.PCR扩增证实MTA1 siRNA单元重组入pRNAT-U6.2-Livin.RT-PCR检测显示,转染pRNAT-U6.2-Livin-MTA1的EC9706细胞Livin基因和MTA1基因mRNA表达水平皆明显降低.结论:同时沉默Livin基因和MTA1基因表达的siRNA载体构建成功.     

Cramp转基因小鼠的构建及鉴定

目的建立系统性表达Cramp转基因模型小鼠,为研究Cramp在衰老中的作用提供模型动物。方法把Cramp cDNA插入系统性表达CMV启动子下游,构建转基因表达载体,显微注射法建立Cramp转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因型,用RT-PCR和Western blotting方法筛选高表达品系。结果成功构建Cramp cDNA转基因载体,建立了Cramp转基因小鼠,通过RT-PCR和Western blotting方法筛选出3个高表达品系。结论建立了系统表达Cramp转基因小鼠,转入的Cramp基因在骨髓、脾脏、肝脏等组织高表达,为研究Cramp基因在衰老中的作用及机制提供了动物模型。     

针对MTA1基因siRNA载体构建和沉默效应

目的 构建针对人MTA1基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,观察RNA干扰对食管癌细胞MTA1基因表达的抑制作用.方法 设计MTA1的siRNA靶序列,分别合成两条互补的寡核苷酸链,退火后重组入pRNAT-U6.2载体,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染人食管癌细胞EC9706,采用RT-PCR和Western blotting分别检测MTA1基因mRNA和蛋白表达的变化.结果 把针对MTA1基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆入pRNAT-U6.2载体,经测序分析,插入片段正确;RT-PCR和Western blotting检测显示,MTA1基因的表达水平明显降低,其中以481-499(GACCCT GCTGGCAGATAAA)为靶序列的siRNA沉默作用最强,MTA1蛋白几乎完全不表达.结论 成功构建出沉默食管癌细胞MTA1基因表达的siRNA载体,为通过沉默MTA1基因的表达来减少恶性肿瘤侵袭转移提供了实验基础.     

MTA1与KISS-1在胃癌中的表达及临床病理意义

目的:研究肿瘤转移相关基因1(MTA1)与肿瘤转移抑制基因KISS-1蛋白在胃癌的表达及临床意义。方法:采用免疫组化的方法检测20例胃正常组织和82例胃癌组织中MTA1和KISS-1的表达。结果:MTA1与KISS-1蛋白在胃癌组织中阳性表达率分别为52.44%和40.24%,在正常胃组织的阳性表达率分别为5.00%和90.00%;MTA1蛋白高表达与胃癌浸润深度、组织学分级、临床分期、淋巴结转移和远隔转移的发生比较差异有统计学意义(P<0.01);KISS-1蛋白低表达与胃癌浸润深度、临床分期、淋巴结转移和远隔转移的发生比较差异有统计学意义(P<0.05);胃癌组织中MTA1与KISS-1蛋白表达呈负相关(γs=-0.364,P<0.01)。结论:MTA1蛋白水平高表达和KISS-1蛋白水平低表达与胃癌的浸润、转移密切相关,可作为诊断胃癌患者转移、复发和判断预后的参考指标,有望成为胃癌基因治疗新的靶点。     

MTA1与肿瘤的浸润转移

肿瘤的浸润转移是导致患者死亡的主要原因,探索肿瘤的浸润转移机制已经成为当今国内外研究的热点之一。随着对肿瘤发生、发展和浸润转移的细胞及分子机理的深入研究,人们对肿瘤浸润转移这一极为复杂的过程有了更进一步的认识,发现并证实许多与肿瘤浸润转移过程高度相关的基因,己经成为肿瘤研究领域的热点。通过这些基因,可以更加深入的了解肿瘤浸润转移的机制,更为重要的是,这些基因及其产物有可能成为抗肿瘤浸润转移的治疗靶点及评价患者预后、转移等的指标。MTA1是近年来发现的一个肿瘤转移相关基因,在许多恶性肿瘤中表达增高,并与肿瘤的浸润转移密切相关。     

MTA1蛋白在肝癌组织中的表达及意义

目的研究MTA1蛋白在肝癌组织中的表达及意义。方法用Western Blot法检测57例肝癌组织及23例肝硬化组织的MTA1蛋白表达水平,并结合相关指标进行分析。结果 MTA1蛋白在有转移肝癌组织中的表达明显高于无转移肝癌组织和肝硬化组织(P<0.01)。MTA1蛋白在肝癌组织中的表达与Edmondson分级不相关(P>0.01)。结论 MTA1蛋白在肝癌组织中的表达与肝癌细胞的转移相关。     

MTA1蛋白在卵巢癌中的表达及意义

目的检测MTA1在卵巢癌中的蛋白表达,探讨其病理意义。方法研究运用免疫组化SP法检测46例卵巢癌、19例交界性肿瘤及13例良性肿瘤组织中肿瘤转移相关基因MTA1蛋白的表达情况,分析其与卵巢癌发生发展及浸润转移的关系。结果在卵巢癌、交界性肿瘤和良性肿瘤中MTA1蛋白阳性表达率依次降低,组间比较差异有统计学意义（P〈0.05）;MTA1蛋白表达与卵巢癌FIGO分期及大网膜转移密切相关（P〈0.05）,与分化及性别无关（P〉0.05）。结论MTA1的高表达与卵巢癌的发生发展及浸润转移密切相关。     

甘丙肽过表达转基因小鼠的制作和鉴定

目的 建立甘丙肽（galanin,GAL）过表达转基因小鼠,为后续研究甘丙肽基因功能提供动物模型. 方法 重组质粒PDGFβ-GAL经XbaⅠ、HindⅢ双酶切后,将连接有启动子的甘丙肽基因片段回收纯化,用显微注射法将甘丙肽基因注入400枚受精卵的雄原核中,选取发育正常的受精卵移植到假孕母鼠的输卵管壶腹部,待其产仔.用PCR方法鉴定子代小鼠基因型,蛋白印迹分析（Western blot）鉴定子代小鼠体内GAL蛋白表达情况. 结果 获得子代小鼠50只,有8只小鼠在基因组上整合有GAL基因,整合率为16％：Western blot显示转入的基因片段PDGF β-GAL在脑组织中的表达水平比肝组织高.结论 通过显微注射法成功建立了GAL过表达转基因小鼠模型.     

家族性肌萎缩侧索硬化症转基因鼠的繁殖和鉴定

目的 建立家族性肌萎缩侧索硬化症（FALS）转基因模型鼠的繁育方法,并对其子代鼠进行基因鉴定。方法 （1）以6只B6SJLSOD1G93～＋半合子雄鼠与6只B6SJLFIJ＋／＋雌鼠（1：1）交配;（2）由鼠尾血提取基因组DNA,PCR扩增hmSOD1基因的片段,电泳后观察结果;（3）对PCR产物进行纯化测序,并通过BLAST验证。结果 6对种鼠交配产鼠仔53只,存活率为98％（52／53）;G93AhmSODl阳性鼠约占44．2％（23／52）;PCR扩增产物分别为内对照（IL-2）：324bp;Tg（hmSOD1）：236bp;测序证实PCR产物的基因序列和hmSODl基因片段中的序列一致．并存在G93A突变。结论 B6SJL-Tg（SOD1-G93A）1Gur／J雄鼠与B6SJLFI／J雌鼠配种能成功繁育出Tg（hmSOD1）阳性的ALS半合子子代鼠：本实验的PCR法能准确鉴定hmSOD1基因阳性鼠,并证实该转人的基因按近似孟德尔方式遗传,为ALS实验研究奠定了基础。     

高表达人源Her2乳腺癌小鼠模型的建立及鉴定

目的 构建并鉴定高表达人源Her2乳腺癌转基因小鼠模型.方法 构建pMD18T-MMTV-huHER2-EGFP转基因构件,通过原核显微注射方法将线性化、纯化后的外源质粒pMD18T-MMTV-huHER2-EGFP注射入C57BL/6J小鼠受精卵中,胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内,获得子代小鼠.采用PCR鉴定子代小鼠尾部组织基因组DNA,用蛋白质免疫印迹法检测乳腺组织Her2蛋白的表达,通过组织病理学切片观察转基因小鼠乳腺组织的病理学变化.结果 经PCR方法检测得到转基因阳性小鼠.蛋白质免疫印迹结果显示,与野生型小鼠相比,F2代阳性小鼠的乳腺组织中Her2蛋白高表达.病理组织切片表明25周龄阳性小鼠的乳腺组织已经出现明显的癌变倾向.结论 高表达人源Her2乳腺癌小鼠模型成功建立并能稳定遗传,可自发形成乳腺癌,其生物学特性和病理学改变与人乳腺癌相近,可作为研究乳腺癌发生发展的动物模型.     

MTA1与肿瘤的侵袭转移

MTA1基因是最近发现的一个肿瘤转移相关基因,与许多肿瘤的浸润和淋巴结转移程度有关。MTA1蛋白可能是通过参与信号转导及基因表达,调控一系列有关浸润、转移的蛋白而起重要作用。对MTA1基因结构与功能的深入研究,为肿瘤的治疗提供了一定的指导意义。     

RNAi干扰食管癌EC9706细胞MTA1基因表达对侵袭和迁移的影响

目的 采用RNAi抑制食管癌EC9706细胞株MTA1基因的表达,观察对食管癌细胞侵袭和迁移的影响.方法 用脂质体包裹转染沉默MTA1表达的siRNA表达载体人食管癌细胞EC9706.定量RT-PCR和免疫印迹分别检测MTAl mRNA和蛋白表达情况;划痕损伤实验和细胞体外侵袭实验分别测定迁移和侵袭的影响.结果 定量RT-PCR检测显示,MTA1基因的表达水平明显降低;转染沉默MTA1的siRNA表达载体组的食管癌细胞划痕未愈合,穿透Matrigel的细胞数量明显减少,与未转染组、转染空载体组和转染无关序列siRNA载体组比较差异有显著性(P<0.05).结论 RNA干扰介导的MTA1基因表达沉寂可有效降低食管癌细胞侵袭和迁移;MTA1基因可能成为肿瘤治疗上有前途的分子靶点.     

一种红色荧光蛋白转基因小鼠的建立

目的:建立广泛表达红色荧光蛋白(RFP)的转基因小鼠,便于组织和细胞移植研究.方法:把DsRed基因片段插入到pCAGGS载体的强启动子下游构建转基因载体pCAG-DsRed.经细胞转染验证,受精卵原核注射,建立红色荧光蛋白转基因C57BL/6小鼠.PCR鉴定转基因小鼠的基因型;红色荧光蛋白在组织中的表达情况,则通过荧光显微镜检测小鼠各组织器官冰冻切片.结果:pCAG-DsRed载体可以在真核细胞中表达RFP,经基因型分析和表型观察,得到两只红色荧光蛋白的首建鼠.经荧光显微镜观察各组织冰冻切片发现红色荧光蛋白在多个组织器官中表达,其中在神经系统和肌肉组织中表达量较高.结论:成功建立了一种红色荧光蛋白转基因小鼠,红色荧光蛋白在转基因小鼠的神经系统和肌肉组织等中高表达.     

PS1/APP双转基因阿尔茨海默病模型传代小鼠的基因型鉴定及其组织学分析

目的对所获的PS1/APP双转基因阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)模型小鼠进行基因鉴定,进一步对其进行组织学分析,检测老年斑(senile plaque,SP)的形成情况.方法设计特定的引物,PCR扩增转入基因组DNA中的APP基因,对转入PS1/APP的小鼠应用刚果红染色结合免疫组化观察Aβ沉积、小胶质细胞和星型胶质细胞的活化.结果与未转入的阴性对照相比,在PS1/APP双转基因的AD小鼠皮质和海马内可见Aβ斑块形成,围绕在Aβ斑块周围的小胶质细胞和星形胶质细胞处于活化状态,形成典型的SP结构.结论我们获得的PS1/APP双转基因小鼠能够模拟AD患者脑内的主要病理过程,提供有效的实验动物模型.     

Plunc序列启动子转基因小鼠模型的建立

目的利用携带有鼻咽组织相对特异性启动子plunc构建的载体建立转基因动物模型。方法将plunc-EGFP质粒用XhoⅠ酶切线性化,胶回收线性化片段,稀释浓度4 μg/ml。采用显微注射法将外源基因注射入小鼠受精卵细胞内。结果产13只小鼠。PCR检测基因整合,其中阳性12只,阳性率92.30%;Southern blot检测阳性3只,阳性率23%。结论鼻咽组织相对特异性启动子plunc可有效地将外源基因整合入小鼠体内。