新疆南部维吾尔族妇女宫颈癌及癌前病变HPV16 E6/E7基因突变序列分析

目的:探讨新疆南部地区维吾尔族妇女HPV16E6/E7基因突变与宫颈病变及宫颈癌发生的关系。方法:提取上述地区40例宫颈癌及80例CINⅠ～Ⅲ组织的HPV16DNA,用PCR扩增其E6/E7基因并对产物测序,然后以德国标准株HPV16DNA为原型进行对比,分析其突变情况。结果:HPV16E6突变中L83V占80.6%(25/31),D25E占16.1%(5/31),E7突变中R77C占33.3%(5/15),N29S占26.7%(4/15)。结论:新疆宫颈病变及其癌变组织中HPV16E6/E7以L83V,D25E,R77C,N29S为主要突变株,欧洲型突变为主,与亚洲型突变同时出现是该地区的主要突变特点。     

反义HPV16 E6/E7-EGFP重组质粒的构建及其对宫颈癌SiHa细胞的促凋亡作用

目的:构建HPV16早期基因E6/E7的反义重组质粒,探讨其对SiHa细胞的促凋亡作用。方法:将HPV16E6/E7基因片段反向克隆于真核表达载体pEGFP-C1并转染SiHa细胞,用RT-PCR方法检测转染后SiHa细胞E6、E7基因mRNA的表达,West-ernblot方法检测转染后E6/E7蛋白的表达,流式细胞仪检测转染后细胞的凋亡率。结果:成功构建携带HPV16E6/E7基因反义片段的真核表达载体,转染该质粒后,SiHa细胞E6、E7基因的mRNA和蛋白均明显下调;转染后细胞凋亡率为(59.3±11.3)%,明显高于转染空载体组[(9.4±1.8)%]和未转染组[(2.1±0.4)%](P<0.05)。结论:反义HPV16E6/E7基因可下调宫颈癌细胞中E6/E7癌基因的表达,诱导宫颈癌细胞凋亡,为宫颈癌的基因治疗提供了实验依据。     

全酿酒酵母HPV16-E7疫苗的构建及免疫原性研究

目的构建人乳头状瘤病毒16型（HPV16）E7重组全酿酒酵母疫苗,评价疫苗的免疫效应。方法将HPV16 E7 cDNA亚克隆人酵母表达载体pYES2／NT,重组质粒转化酿酒酵母,经诱导表达、热灭活制备全酵母HPV16-E7疫苗,免疫C57BL／6小鼠。ELISA、MTT、LDH法分别检测疫苗诱导的细胞因子、脾淋巴细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答水平。结果全酵母疫苗能够有效表达HPV16-E7蛋白;疫苗小鼠免疫,能够刺激脾淋巴细胞增殖,并诱导出Th1型细胞因子和特异性CTL杀伤效应;免疫效果优于单纯HPV16-E7蛋白免疫（P〈0．01）。结论全酵母疫苗既能表达HPV16-E7蛋白,又能有效诱导特异性CTL免疫应答。研究结果为进一步进行疫苗抗肿瘤疗效研究,提供了实验基础。     

HPV16 E7 siRNA表达载体对宫颈癌CaSki细胞增殖及成瘤性的影响

目的:通过载体介导的RNA干扰技术干扰E7癌基因的表达,探讨HPV16E7小干扰RNA(siRNA)表达载体对宫颈癌CaSki细胞增殖及成瘤性的影响,以及成为宫颈癌基因治疗新策略的可行性。方法:利用脂质体将HPV16E7特异性siRNA表达载体、空载体转染CaSki细胞,分别命名为CaSki-S、CaSki-P。通过荧光定量RT-PCR及流式细胞仪检测CaSki、CaSki-S、CaSki-P3种细胞E7mRNA和蛋白的变化,通过流式细胞仪及MTT法检测3种细胞的细胞周期及生长曲线变化,并检测3种细胞在裸鼠体内成瘤性及生长活性的差异。结果:荧光定量RT-PCR及流式细胞仪检测显示,CaSki-S细胞E7基因mRNA和蛋白的表达明显低于CaSki细胞,抑制率分别为92.86%、84.21%。MTT法检测显示,CaSki-S细胞生长明显慢于CaSki细胞。流式细胞仪检测细胞周期显示,CaSki-S细胞与未转染组CaSki细胞比较,G1期细胞比例明显增加,S期细胞比例则明显减少。裸鼠体内成瘤性及生长活性显示CaSki-S细胞显著低于CaSki细胞。而CaSki-P细胞无论是在E7mRNA和蛋白的表达,还是在肿瘤细胞生长、细胞周期的改变及成瘤性方面都与CaSki细胞无明显差异。结论:HPV16E7siRNA表达载体能有效地抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达,部分逆转其恶性表型。因此它有望成为宫颈癌基因治疗的新策略之一。     

TSLC1基因异常甲基化及与HPV的关系在宫颈癌发生发展中的意义

目的:探讨TSLC1基因启动子甲基化状态以及与HPV感染的关系在子宫颈癌发生发展中的意义。方法:用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)法检测68例原发性宫颈癌,67例CIN及29例慢性宫颈炎症石蜡包埋组织中TSLC1基因甲基化状态。用聚合酶链反应(PCR)法检测人乳头瘤病毒(HPV)DNA的感染状况。结果:宫颈癌组织中45例异常甲基化(66.2%),其中鳞癌67.8%(40/59),腺癌55.5%(5/9);67例宫颈上皮内瘤变组织中29例可见异常甲基化(43.3%);29例慢性炎症组织中2例甲基化(6.9%);将鳞癌、腺癌、CIN与慢性炎症比较,鳞癌与CIN比较,CINⅡ～Ⅲ与CINⅠ比较均显示差异有统计学意义(P<0.05),腺癌与CIN比较,鳞癌分化程度之间的差异无统计学意义(P>0.05)。HPV感染率宫颈癌组51.5%(35/68),CINⅠ23.1%(6/26),CINⅡ～Ⅲ41.5%(17/41),慢性炎症组17.2%(5/29);TSLC1甲基化与HPV感染相关性比较,CIN组之间差异有统计学意义(P<0.05),宫颈癌组之间的差异则无统计学意义(P>0.05)。结论:TSLE1基因启动子区CPG岛的高甲基化是导致TSLC1基因失活的重要机制,可能参与宫颈癌的发生;它与HPV之间的关系提示TSLC1基因可能是宫颈细胞癌变过程中的早期事件。     

人乳头状瘤病毒16型E6、E7基因转染的人宫颈上皮永生化细胞系的建立及鉴定

目的 建立HPV16 E6、E7基因转染的胎儿宫颈上皮永生化细胞系，为体外研究宫颈上皮HPV感染及其癌变机制提供模型。方法 探索胎儿宫颈上皮细胞原代培养的方法，用逆转录病毒法将HPVl6E6、E7基因转染原代培养的胎儿宫颈上皮细胞，筛选出稳定表达的细胞系，进行传代培养；应用RT-PCR检测细胞中HPV16E6、E7基因的表达，用绘制细胞生长曲线、形态学观察、软琼脂集落形成实验、流式细胞术、Transwell Insert体外侵袭实验和裸鼠成瘤实验等方法对永生化的胎儿宫颈上皮细胞进行鉴定。结果 采用组织块培养法。选用Ker-SFM无血清培养基培养出纯度和生长状态良好的胎儿宫颈上皮原代细胞，可以利用高滴度的逆转录病毒作为载体，感染原代细胞，成功地建立一株永生化的胎儿宫颈上皮细胞系。永生化的细胞仍呈多边形，角蛋白阳性，仍维持上皮细胞表型，雌、孕激素受体阴性，染色体核型发生明显变化，但目前尚无软琼脂集落形成能力、不能穿过Matrigel基底膜，不能在裸鼠体内形成肿瘤。结论 转染HPV16E6、E7基因能使胎儿宫颈上皮细胞永生化，永生化细胞仍维持上皮细胞表型，染色体核型发生明显变化，但尚未完全恶性转化。     

人乳头状瘤病毒16型E7基因重组腺相关病毒载体的构建及E7 mRNA和蛋白在真核细胞中的表达

目的构建含人乳头状瘤病毒16型E7(HPV16E7)基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体,并验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞中的表达。方法将含腺相关病毒(AAV)末端反向重复序列及HPV16E7基因的重组质粒pAAVMCSE7、含rep/cap基因的质粒pAAVRC及辅助质粒pAAVhelper共同转染胚胎肾细胞系HEK293细胞,回收、纯化病毒颗粒并鉴定,斑点杂交法测定病毒滴度,RTPCR技术、蛋白印迹法验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞中的表达。结果电镜鉴定结果显示真核细胞中有病毒颗粒存在,斑点杂交法测定病毒滴度为1×1011/ml。含HPV16E7基因的rAAV载体转染真核细胞后,在细胞内可检测到HPV16E7mRNA和蛋白的表达。结论本实验成功构建了含HPV16E7基因的rAAV载体,经验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞内有表达。     

腺病毒伴随病毒表达载体表达人乳头状瘤病毒16型E6/E7基因的构建及应用

目的　为了了解人乳头状瘤病毒 (Humanpapillomavirus ,HPV) 1 6型的E6 /E7基因在细胞恶性转化中所起的作用 ,利用腺病毒伴随病毒载体 (AAVHelper -FreeSystem)构建和表达人乳头状瘤病毒 1 6型E6 /E7基因。方法　在pLXSN1 6E6E7质粒中经PCR扩增回收HPV 1 6E6E7基因片段 ,连接于T载体上进行测序 ,将正确的HPV 1 6E6E7插入pAAV -IRES -hrGFP质粒 ,协同pAAV -RC质粒和pHelper质粒共转染HEK 2 93细胞 ,包装表达HPV 1 6E6E7基因的重组腺病毒伴随病毒 ,收获病毒 ,并检测病毒的感染效率。结果　在包装细胞系HEK 2 93细胞中能形成较高感染效率的腺病毒伴随病毒 ,激光共聚焦检测可发现HEK 2 93细胞内有绿色荧光蛋白表达 ,HEK 2 93细胞经PCR可扩增出特异性的HPV 1 6E6E7基因片段 ,经流式细胞仪检测重组病毒的感染效率为71 3%。结论　携带人乳头状瘤病毒 1 6型E6E7基因的腺病毒伴随病毒可感染细胞 ,并在细胞内表达 ,可望用于宫颈癌病因学的研究     

人类疱疹病毒6型及人乳头瘤病毒16型感染与宫颈癌发生、发展关系的研究

目的 :研究人类疱疹病毒 6型 (hHV 6 )及人乳头瘤病毒 16型 (hPV 16 )感染与宫颈癌发生、发展的关系。方法 :应用巢式多聚酶链反应 (nested PCR)检测hHV 6及多聚酶链反应 (PCR)检测hPV 16在 16份正常宫颈、2 0份宫颈炎症、6份宫颈上皮内瘤样病变 (CIN)Ⅰ～Ⅱ级及 34份宫颈癌组织中的感染情况。结果 :宫颈癌组织中hHV 6DNA阳性率为 6 1.76 % (2 1/34) ,明显高于正常组、炎症组及CINⅠ～Ⅱ级组 (P <0 .0 1)。宫颈癌组织中hPV 16DNA阳性率为 76 .4 7% (2 6 /34) ,明显高于正常组的 12 .5 0 %和炎症组的15 .0 0 % (P <0 .0 1)。 2 1份hHV 6DNA阳性组织中的hPV 16DNA也全部阳性 ,二者在宫颈癌组织中呈高度一致性。随着宫颈癌临床期别的增加 ,hHV 6和hPV 16DNA阳性率均呈递减趋势 ,但差异不显著 (P >0 .0 5 )。结论 :hHV 6感染与宫颈癌的发生密切相关 ,可能是宫颈癌的致病因子 ,作为“促进子”(promoter)与hPV 16协同促使宫颈癌进展。     

HPV16 E2基因各区域缺失与宫颈病变相关性的研究

目的:检测湖北地区HPV16阳性宫颈标本E2基因碳端(C)、铰链区(H)、氮端(N)的缺失状态,探讨其与CIN及宫颈癌的关系。方法:将122例宫颈标本按病变程度分为宫颈癌组、CINⅡ~Ⅲ组、对照组。应用多重聚合酶链反应(PCR)将各组HPV16感染标本E2基因的C、H、N分别与E6基因同时扩增,检测E2基因各区域的缺失状态,并应用Scion Image4.0软件半定量分析E2、E6基因条带灰度值,判断HPV DNA的整合状态。结果:宫颈癌组E2基因C、H、N缺失率分别是22.5%,50%,77.5%;CIN组为30.77%,69.23%,92.31%;对照组为9.09%,27.27%,27.27%。E2基因C、H缺失率在3组的任两组间比较无统计学差异(P0.05),而E2基因N端缺失率在宫颈癌组与对照组之间及CIN组与对照组之间差异有统计学意义(P均0.01)。结论:HPV16病毒E2基因N端缺失状态与CIN及宫颈癌有内在关系。在检测HPV感染同时检测E2基因N端缺失状态,对间接判断预后及指导后续治疗有重要意义。     

HPV_(16)L1-E7重组病毒及其重组质粒免疫后小鼠抗体水平动态变化的研究

目的 :研究人乳头瘤病毒 16型L1 E7重组腺病毒 (rAd5HPV16 L1 E7virus)及其重组质粒 (rAd5HPV16 L1 E7plasmid)经不同途径免疫后小鼠抗体水平的动态变化。方法 :用 2 93细胞扩增rAd5HPV16 L1 E7重组病毒 ,同时制备rAd5HPV16 L1 E7重组质粒 ,分别以肌肉注射、腹腔注射、滴鼻和灌胃途径免疫小鼠 ,采用ELISA法测定其血清IgG抗体水平。结果 :rAd5HPV16 L1 E7重组病毒及其重组质粒采用不同途径免疫的BALB/c小鼠血清IgG抗体水平均高于对照组 (P <0 .0 5 ) ,其中以肌注组产生抗体量最多 ,并且出现最早。结论 :rAd5HPV16 L1 E7重组病毒及其重组质粒均能刺激B细胞产生抗体介导的免疫应答 ,免疫途径不同 ,抗体峰值的出现时间亦不同 ,测定抗体的最佳时间亦不同。     

外源性人乳头状瘤病毒16型E7基因对子宫颈癌细胞周期的影响

目的了解外源性人乳头状瘤病毒16型(HPV16)E7基因对子宫颈癌细胞周期的影响。方法从宫颈癌标本中经 PCR 扩增回收 HPV16 E7基因片段,将正确的 E7基因片段插入到穿梭质粒 pAdrTrack-CMV 中,与骨架质粒 pAdEasy-1在大肠埃希菌 Bj5183中同源重组,重组腺病毒质粒转染人胚肾细胞株 HEK-293细胞,包装表达 E7基因的腺病毒,然后转染 HPV18阳性的宫颈癌细胞株HeLa 细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测转染后 HeLa 细胞的增殖情况,以吸光度(A)值表示;流式细胞仪检测转染前后 HeLa 细胞的细胞周期和细胞周期蛋白 D1表达的变化。结果在 HEK-293细胞中,可以收获高转染效率的腺病毒。在荧光显微镜下,可以观察到 HEK-293细胞和 HeLa 细胞中均有绿色荧光蛋白的表达。提取 HEK-293细胞 RNA,RT-PCR 技术可以检测到 E7基因的表达。MTT 比色法检测结果显示,转染后 HeLa 细胞的 A 值最低为0.38±0.02,最高为0.96±0.01,分别与转染前的0.27±0.03比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。流式细胞仪检测结果显示,转染12h后,S 期细胞占(36.0±2.0)%,转染24h 后为(49.9±4.2)%,分别与转染前的(26.0±0.4)%比较,差异均有统计学意义(P<0.05);转染前、后细胞周期蛋白 D1阳性表达率分别为22.4%、55.2%,两者比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论携带 HPV16 E7基因的腺病毒可转染子宫颈癌 HeLa细胞,并在 HeLa 细胞内表达,HPV16 E7基因的表达进一步影响 HeLa 细胞的细胞周期蛋白的表达,促进 HeLa 细胞增殖,可望用于治疗宫颈癌。     

HPV亚型在宫颈疾病中的分布特点

目的:探讨HPV亚型在宫颈疾病谱中,即从正常宫颈(慢性宫颈炎)、宫颈上皮内瘤变(CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ)到宫颈癌连续发展中的分布特点。方法:回顾分析2005年6月～2008年6月在我院妇科因宫颈疾病就诊的189例患者HPV亚型检测的结果。结果:HPV总感染率56.1%(106/189),复合感染率22.6%(24/106)。正常者HPV感染率19.1%(12/63),检测到的HPV亚型主要是HPV52,58,53,16和33。CINⅠ者HPV感染率57.9%(22/38),最常见的HPV亚型是HPV52,其次是HPV58,16,33和18。CINⅡ者HPV感染率70.5%(31/44),HPV52,16,58,33和18等亚型最常见。CINⅢ者HPV感染率89.3%(25/28),HPV亚型以HPV16,52,58,31,33为主。宫颈癌患者,HPV阳性率100%(16/16),HPV16检测率最高,其次是HPV18,52,58和33。结论:宫颈疾病谱中最常见的高危型HPV亚型是HPV16。不同宫颈病变中HPV亚型感染的差异可能反映了其潜在转归能力,同时提示临床医师应关注宫颈疾病患者高危HPV亚型情况。     

人免疫重建荷人HPV16阳性宫颈癌SCID鼠模型的建立及其生物学特征研究

目的 :建立人免疫重建荷人HPV16阳性宫颈癌 -严重联合免疫缺陷小鼠模型并研究其生物学特征。方法 :向严重联合免疫缺陷 (SCID)鼠腹腔注射人外周血淋巴细胞 (PBL)后 2 4h ,皮下接种HPV16阳性的人宫颈癌细胞株SiHa细胞建立人免疫重建荷人HPV16阳性宫颈癌SCID鼠模型 ,观察荷瘤鼠成瘤、一般特征和移植瘤生长、转移情况及组织学特征 ,检测外周血、肿瘤组织和肺脾等其它组织中HPV16DNA、血清中人IgG含量和移植物抗宿主情况。结果 :SCID小鼠成瘤率为 10 0 % ,移植瘤生长以局部浸润为主 ,未见转移瘤。免疫重建荷瘤组生存期 (136 .2± 6 .3d)显著长于未重建荷瘤组 (97.8± 3.7d) ;组织学检查示移植前后肿瘤细胞形态相似 ;所有肿瘤组织中HPV16DNA呈阳性 ,而外周血和肺脾等其它组织均为阴性。未发现移植物抗宿主情况。结论 :成功建立的人免疫重建荷人HPV16阳性宫颈癌SCID小鼠模型能较好地模拟人自发宫颈癌的生物学特征     

HPV16E7肽疫苗对人免疫重建荷人宫颈癌细胞株SiHa细胞SCID鼠免疫功能的影响

目的:观察HPV16E7多肽疫苗对人免疫重建荷人宫颈癌细胞株SiHa细胞严重联合免疫缺陷(SCID)鼠移植瘤的影响。方法:对SCID鼠腹腔注射人外周血淋巴细胞(PBL)后24小时,皮下接种HPV16阳性的人宫颈癌细胞株SiHa细胞,建立人免疫重建荷SiHa细胞的SCID鼠模型,当移植瘤最小体积达100mm3时,三次背部皮下接种疫苗,每次接种间隔二周,观察荷瘤鼠一般生物学特性,检测血浆中人IgG含量、外周血中人CD3+、CD4+、CD8+T细胞、脾重、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)以及脾细胞毒杀伤功能。实验设立空白组,仅为腹腔内注射PBL,疫苗成份仅为不完全佐剂(IFA);随机多肽组,为腹腔内注射PBL,皮下接种SiHa细胞,疫苗成份仅为随机多肽+T辅助多肽+IFA;T辅助多肽组,为腹腔内注射PBL,皮下接种SiHa细胞,疫苗成份仅为T辅助多肽+IFA;多肽治疗组,为腹腔内注射PBL,皮下接种SiHa细胞,疫苗成份为HPV16E711-20(YMLDLQ-PETT),HPV16E786-93(TLGIVCPI)+T辅助多肽+IFA。结果:各组SCID鼠血浆中人IgG水平,8周内随重建时间延长而升高(P<0.05),多肽治疗组达2957.85μg/m l,但各组间无显著性差异;外周血中均可检测到人CD3+、CD4+、CD8+T细胞,但各组间无显著性差异(P>0.05);与空白组比较,其他三组SCID鼠脾重均显著增加(P<0.05)。组织学观察到移植瘤局部TIL浸润及明显的出血和坏死,但经免疫组化未检测到人CD8+T细胞。与空白组比较,多肽治疗组、随机多肽组、辅助多肽组的脾细胞毒杀伤功能均显著降低(P<0.05)。结论:人免疫功能重建的荷SiHa细胞的SCID鼠体内重建的人免疫功能随荷瘤时间的延长受到抑制,多肽疫苗在一定程度上能减轻免疫抑制状态。