大鼠骨髓基质干细胞的神经分化以及神经生长因子的表达

目的 探讨大鼠骨髓基质干细胞神经分化以及神经生长因子的表达.方法 体外培养大鼠骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cell,BMSC),传代至第6代,进行神经诱导分化.先以bFGF (10 ng/ml)预诱导24 h,然后以胶质细胞源神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)10 ng/ml在胎肠培养基(fetal gut condition midium,FGCM)条件下诱导10 d.免疫荧光法检测神经元标志神经特异性烯醇化酶(NSE)和神经丝蛋白(NF)的表达.RT-PCR法检测神经营养因子GDNF和神经生长因子(nerve growth factor,NGF) mRNA的表达.结果 流式细胞检测BMSC高表达CD90(99.7%), 而CD45表达阴性.诱导10 d后,部分细胞在形态上表现出神经元样改变,免疫荧光染色神经元标志NSE和NF阳性,而胶质细胞标志GFAP阴性.RT-PCR检测显示,BMSC诱导前低表达神经营养因子NGF和GDNF mRNA,而诱导后表达水平显著增加.结论 GDNF不仅能在体外诱导BMSC分化为神经样细胞,而且能促进神经营养因子表达显著增加.     

兔骨髓基质细胞诱导分化成神经元样细胞的研究

目的检测由骨髓基质细胞诱导分化而成的神经元样细胞能否分泌氨基酸类神经生物活性物质成分,从而推断是否具有神经元的生化特征。方法无菌条件下抽取新西兰大白兔骨髓,梯度密度离心分离获取兔骨髓基质细胞(BMSCs),在神经干细胞培养基及细胞因子0.5 μg/ml维甲酸(RA)、20 ng/ml胶质源性神经营养因子(GDNF)于体外诱导分化为神经干细胞及神经元样细胞,采用免疫细胞化学方法进行鉴定,并应用高效液相色谱法(HPLC)检测其氨基酸类生物活性物质的含量。结果BMSCs培养10 d可见细胞大而圆,免疫细胞化学检测Nestin抗原阳性;培养20 d可见具有长突起的神经元样细胞形成,神经元特异烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学检查阳性,高效液相检测骨髓源性神经元样细胞含有高浓度的天冬氨基酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)。方差分析显示:随着BMSC培养天数的增加,其所含的Asp、Glu浓度也渐增加,RA GDNF组所含Asp生物活性物质与其余各组比较有显著性差异(P<0.01)。结论兔BMSCs在体外条件下可以增殖分化,增殖细胞表达Nestin,分化的细胞则可表达NSE特异性抗原,并含有高浓度的兴奋性和抑制性氨基酸类神经递质成分;RA和GDNF作为BMSCs的诱导剂,在BMSCs向神经干细胞分化中起有重要的促进作用。     

阿魏酸钠诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的初步研究

目的 探讨阿魏酸钠诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的可能作用。方法 分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，采用阿魏酸钠对其进行诱导培养，倒置显微镜下观察诱导培养不同时间后细胞的形态变化，并应用免疫细胞化学方法鉴定诱导培养后细胞表面神经细胞特异性标志物神经丝蛋白(NF)及神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达。结果 阿魏酸钠诱导培养6h后即可见细胞形态发生明显变化，24h后表现为典型的神经细胞样形态，NF和NSE神经细胞特异性标志物呈阳性表达。结论 初步证实阿魏酸钠具有诱导体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用。     

人骨髓干细胞分离及其向神经细胞诱导分化的实验研究

目的研究骨髓间充质细胞向神经样细胞诱导分化的能力,探讨利用其治疗神经损伤疾病的可行性。方法采用直接分离培养法从人骨髓中分离培养骨髓间充质干细胞,流式细胞术对其细胞特性进行鉴定,化学诱导法诱导其向神经样细胞分化,免疫组化技术验证诱导细胞特性。结果成功获得骨髓间充质干细胞,免疫表型鉴定结果为CD73、CD90、CD105表达阳性,CD14、CD34、CD45表达阴性;免疫组化染色显示诱导分化的细胞表达神经前体细胞标志物Nestin、GFAP和成熟神经元标志物NSE等。结论骨髓间充质细胞在特定诱导因子作用下能向神经细胞表型转化,并能稳定表达神经细胞因子,可以作为神经损伤疾病组织工程的种子细胞来源。     

诱导兔骨髓基质细胞向神经干细胞分化的初步实验研究

目的：观察兔骨髓基质细胞体外培养的生长行为及增殖、分化情况，探讨由骨髓分离培养神经干细胞的可行性和有效性。方法：无菌条件下行骨穿术，密度梯度离心分离获取骨髓基质细胞，利用多种增殖、分化诱导因子和神经干细胞培养液进行培养、分化诱导，用免疫细胞化学方法进行鉴定。结朵：骨髓基质细胞在体外培养中能形成NESTIN抗原阳性的细胞克隆团，进一步分化，部分细胞胞体增大并出芽，逐渐发育成为较成熟的长突起细胞，长突起相互连接、交织成网并建立纤维联系。结论：骨髓基质细胞具有较强的自我更新能力和多向分化潜能，易于取材、体外培养和增殖，在一定诱导条件下可以生成神经干细胞。     

新生大鼠海马区神经干细胞分离培养和单细胞克隆系建立及鉴定

目的:分离培养新生大鼠海马区神经干细胞(Neural stem cells,NSCs),建立NSCs单细胞克隆系。方法:取新生SD大鼠海马组织分离NSCs后无血清技术培养,建立其克隆系并行单细胞传代克隆培养。采用细胞免疫荧光和RT-PCR等技术对NSCs进行鉴定,分子标志物选择Nestin和Sox2。NSCs诱导分化的神经元的鉴定,标示物选择早期神经元特异性微管蛋白(β-tubulin),星形胶质细胞标示物为特异性胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP),少突胶质细胞特异性标记蛋白为髓鞘相关蛋白(cyclic nucleotide phosphodiesterase,CNP)。结果:无血清培养法可维持NSCs生长和促进其增殖。成功建立NSCs单细胞克隆系,传代可获得大量亚克隆NSCs株团。单细胞克隆NSCs球团经早期酶消化结合后期机械吹打法传代,分散为单细胞或类单细胞后,增殖及分化能力依然存在。单细胞克隆系株经Nestin和Sox2细胞免疫荧光或RT-PCR检测均为阳性表达。在加有胎牛血清培养基条件下进行诱导分化,来自单细胞克隆系的细胞株同样可分化为神经元样、星形胶质细胞样和少突胶质细胞样3种神经细胞,即β-tubulin、GFAP、CNP免疫荧光染色分别呈阳性。结论:无血清培养可成功建立新生SD大鼠海马区NSCs单细胞克隆系,并可稳定传代增殖,并在一定条件下可诱导分化为成熟的神经元和神经胶质细胞。     

黄芪诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞.方法通过贴壁法分离大鼠MSC,体外扩增培养.中药黄芪定向诱导MSC分化为类神经元样细胞.光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志.结果大鼠骨髓间质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增.黄芪诱导90 min后大部分MSC转变为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE、Nestin呈阳性、GFAP阴性.结论大鼠骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞.     

成人骨髓间充质干细胞体外诱导向神经细胞分化

目的:探讨成人骨髓间充质干细胞(MSC)向神经细胞体外定向诱导分化的条件. 方法:从正常成人志愿者髂骨中分离获取MSCs,体外培养扩增纯化后传代于塑料培养皿中,采用2-巯基乙醇(BME)和二甲亚砜(DMSO)对传至3～5代的细胞进行体外诱导分化,采用免疫细胞化学法对诱导后的细胞鉴定. 结果:诱导1 h有部分细胞表达神经干细胞标志巢蛋白nestin,4 h后大部分细胞具有典型神经元形态,表达晚期神经元标志物-中间神经丝蛋白(NF-M),部分具有神经元形态的细胞表达微管相关蛋白-2 (MAP-2). 结论:成人骨髓间充质干细胞可以在体外培养扩增并诱导成为神经元样细胞.     

人骨髓间充质干细胞分离培养及其向神经细胞分化的研究

目的探讨人骨髓间充质干细胞(BMMSCs)向神经细胞分化的潜能。方法体外培养人BMMSCs,并诱导其向神经细胞分化。诱导前后观察细胞形态变化,免疫细胞化学法检测细胞神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达以鉴定细胞类型,流式细胞术检测细胞周期以确定细胞增殖活性。结果分离培养的BMMSCs有克隆增殖能力。诱导后,分化细胞呈现典型神经元的表型,且免疫荧光染色呈NSE阳性。流式细胞术分析显示诱导前BMMSCs的增殖指数(PI)较高,细胞增殖活跃。与诱导前比较,诱导分化细胞的PI显著降低(P<0.01),细胞增殖发生抑制,而分化阶段各期细胞比例差异无统计学意义(P>0.05)。结论 BMMSCs可以在体外增殖扩增,并能分化为神经元样细胞,且分化的神经元样细胞能较长时间存活。     

人骨髓源性神经样细胞的形态及超微结构

目的:探讨人骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSC)分化形成的神经样细胞的形态及结构特征。方法:采用密度梯度离心法和贴壁培养的方法分离纯化人BMSC,流式细胞仪检测CD34、CD45、CD44等细胞表面抗原在BMSC上的表达。联合应用碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growthfactor,bFGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、二甲基亚枫(di methyl sulphoxide,DMSO)和丁羟基茴香醚(butylhydroxy anisol,BHA)诱导人BMSC向神经细胞分化。光学显微镜下观察细胞的形态变化;甲苯胺蓝染色法对分化后细胞进行尼氏体染色;透射电子显微镜观察分化后细胞的超微结构特点。结果:分离纯化的人BMSC经流式细胞仪检测显示间充质干细胞相对特异性抗原CD44表达阳性,造血干细胞特异性抗原CD34、CD45表达阴性;加入诱导培养基培养2周后,细胞胞体变圆,折光性增强,有突起形成;甲苯胺蓝染色法显示分化后的细胞尼氏体染色阳性;透射电镜下细胞胞浆中有大量密集的呈扁平囊状的粗面内质网及其间的一些游离核糖体和多聚核糖体所组成的尼氏体的超微结构,并有神经微丝的形成。结论:EGF/bFGF/DMSO/BHA诱导人BMSC分化形成的神经样细胞能够表达成熟神经细胞典型的形态及超微结构特征。     

兔骨髓基质细胞的体外培养

目的 :比较用全骨髓法和离心法培养兔原代骨髓基质细胞 (BMSC)的差异 ,同时观察BMSC在体外培养时的生长特征及体外诱导为成骨细胞的可能性。方法 :抽取新西兰大白兔骨髓 ,分别用全骨髓法和密度梯度离心法进行原代培养 ,比较第 12d收获细胞的数量。传代后观察 1～ 6代细胞的生长特征 ,绘制生长曲线 ,测定分裂指数和贴壁率 ;同时将部分第 3代细胞进行诱导培养 ,第 16d计算碱性磷酸酶 (ALP)阳性细胞率。结果 :全骨髓法较离心法收获细胞数量少 (P <0 .0 5 ) ,1～ 6代细胞的生长特征相似 ,增殖能力强。第 3代细胞被成功地诱导为成骨细胞 ,第 16dALP阳性细胞率为 80 %。结论 :离心法较全骨髓法培养BMSC可得到较多的细胞 ,两种方法得到的细胞前 6代细胞均有较强的增殖能力 ,并可以诱导为成骨细胞 ,可作为骨组织工程用的种子细胞     

新型快速成形的三维多孔支架材料构建组织工程软骨

目的:探讨以骨髓基质细胞(BMSC)为种子细胞,以快速成形的生物相容性材料为支架构建组织工程软骨的可行性.方法:成年兔BMSC在成软骨培养液中诱导培养,使之具有软骨细胞表型后,接种于快速成形的生物相容性三维支架材料聚乳酸/聚羟乙酸共聚物(poly-lactic-co-glycolic acid,PLGA),经体外培养扩增2 wk后植入自体肌袋,术后8 wk取材,进行组织学、甲苯胺蓝染色及II型胶原免疫组织化学观察.结果:成年兔BMSC在体外可诱导为软骨细胞,接种于三维支架材料培养后,扫描电境观察见细胞在支架上可大量扩增;接种细胞的支架植入自体肌袋8 wk,可形成软骨样组织,甲苯胺蓝染色及II型胶原免疫组化染色阳性.结论:具有软骨细胞表型的BMSC接种于快速成形的三维支架材料在体内非关节环境可形成软骨样组织.     

大鼠全骨髓细胞诱导分化神经细胞的实验方法研究

目的：摸索从全骨髓诱导培养分化神经细胞的方法，并从形态学上观察其演变规律。方法：抽取SD大鼠骨髓做全骨髓细胞培养．用光镜观察不同阶段的形态，荧光激活细胞计数仪(FACS)追踪由骨髓到神经元样细胞不同阶段nestin和Neuronal nuclei(NeuN)的表达趋势，给予定性、定量，以及免疫细胞化学鉴定。结果：骨髓细胞至10天开始分化，逐渐发育成为神经元样细胞。Nestin在15天时达到高峰为22．7％，NeuN于30天达到高峰为41．2％，而此时nestin阳性细胞为5．9％。免疫细胞化学鉴定出神经干细胞、神经元和胶质细胞，结论：建立了全骨髓细胞体外分离、培养的条件，具有简捷和高效的价值。     

非诱导条件下犬骨髓基质细胞的生物学特性

目的 研究体外培养骨髓基质细胞(BMSC)的生长特点和非诱导条件下的成骨特性。方法 采用犬来源BMSC体外扩增培养，观察非诱导条件下BMSC生长变化和成骨分化。结果 形态学观察表明，BMSC贴壁细胞呈集落生长，有成纤维细胞样外观，未加入成骨诱导剂，细胞形态发生变化，钙沉积出现，碱性磷酸酶(ALP)表达。3代内扩增的BMSC有成骨活性，但原代细胞成骨活性优于传代后细胞。结论 体外培养BMSC能大量扩增，具有自然向成骨细胞分化的能力，是骨组织工程理想的种子细胞。本实验所培养的BMSC具有骨祖细胞特性。     

体外诱导的神经元样细胞对大鼠脑损伤模型修复的影响

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) 诱导为神经元样细胞后对大鼠脑损伤模型修复的影响。方法:骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs并采用流式细胞术进行鉴定,川芎嗪诱导其分化,将诱导24h的细胞直接注射移植到大鼠脑缺血模型海马区组织, 检测分化的神经元样细胞在神经系统微环境中存活及病理变化。结果:细胞移植组病理变化与脑损伤模型组相比, 神经细胞变性、坏死数量明显减少, 间质水肿较轻。结论:骨髓间充质干细胞诱导为神经元样细胞后移植入对大鼠脑缺损伤的修复有一定的作用。     

米诺环素微环境对体内外骨髓间充质干细胞的影响

 目的研究米诺环素在体内外干扰骨髓间充质干细胞后对其生长的影响。方法大鼠脊髓损伤后,经口给予米诺环素,并将带有GFP基因的SD大鼠骨髓间充质干细胞局部移植到损伤脊髓,在体外培养大鼠骨髓间充质干细胞并给予不同剂量的米诺环素进行干预。利用荧光显微镜计数细胞,采用MTT法描绘细胞生长曲线来观察干细胞的生长状况。结果米诺环素联合骨髓间充质干细胞治疗实验性脊髓损伤,在损伤中心可以观察到更多的移植细胞,体外培养的骨髓间充质干细胞在合适剂量米诺环素的干预下呈现出更加旺盛的生长趋势。结论合适剂量的米诺环素可以促进体内移植的骨髓间充质干细胞在损伤脊髓内更多地迁移到损伤中心,而对于体外培养的骨髓间充质干细胞米诺环素会促进其增殖。     

体外诱导骨髓基质干细胞向内皮细胞分化的实验研究

目的：探讨成体骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为内皮细胞的可行性，为心血管组织工程提供新的种子细胞来源。方法：骨髓穿刺抽取绵羊骨髓液，密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞，通过贴壁培养纯化骨髓基质干细胞。以含EGF、bFGF、IGF和肝素的M199培养液培养原代细胞，并以VEGF诱导骨髓基质干细胞向内皮细胞分化。通过CD34、CD31流式细胞仪分析，免疫组化CD34、CD31、Ⅷ因子相关抗原染色鉴定内皮细胞，UEA结合实验及NO含量测定评价内皮细胞功能。结果：骨髓基质干细胞表达α-SMA，不表达CD34和CD31。体外定向诱导2周后分化为内皮细胞。呈梭形，表达CD34和CD31及Ⅷ因子相关抗原，UEA结合试验阳性，并具有分泌NO的功能。结论：体外培养条件下骨髓基质干细胞能够分化为内皮细胞，并具有成熟内皮细胞的生物学特性和功能。     

人骨髓间充质干细胞体外向软骨细胞分化的实验研究

目的创伤等因素造成的关节软骨的损伤和退变是骨科常见和难以解决的问题之一。干细胞尤其是骨髓来源干细胞的研究促进了组织工程在骨关节领域的发展。文中研究体外单层培养条件下,成人骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC）经诱导定向分化软骨细胞可行性。方法用全血贴壁法分离培养BMSC,并传代扩增后,用单层培养法在软骨诱导剂下进行诱导培养21d,以常规培养液培养的BMSC作为阴性对照。光镜下观察诱导细胞形态学的改变,苏木素-伊红（HE）染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原蛋白免疫组化等方法检测诱导细胞的分泌功能。结果BMSC经21d的单层诱导培养后,细胞形态由长梭形向多角形类圆形转变,细胞爬片甲苯胺蓝染色呈明显异染,Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学检测阳性,对照组阴性。结论成人BMSC在单层培养条件下可成功诱导分化为软骨细胞。