PCR方法快速检测炭疽芽孢杆菌

目的：快速检测炭疽芽孢杆菌。方法：质粒提取及PCR扩增。结果：用两对引物扩增，阳性样本可分别扩出两条877bp和1089bp左右的条带，阴林样本未扩增出。结论：所采用的方法可快速检测出环境中的炭疽芽孢杆菌，并可对其致病性进行评价。     

PCR检测炭疽杆菌芽孢的原理及其应用

炭疽杆菌是一种人畜共患的致病菌。经消化道、呼吸道或皮肤接触而使人致病。其中皮肤炭疽是最常见的形式,易发生于接触污染的动物或动物制品的工业或农业部门中。建立一种检测动物制品或环境中发生炭疽和确定危险地区。目前许多传统的检验方法,包括细菌分离培养,溶血性实验,荚膜染色,噬菌体裂解实验,串珠实验等虽较为特异,但完成需要时间长,且必需大量纯化细菌。而近年来发展起来的PCR技术提供了一个快速鉴定标本中存在炭疽杆菌芽孢的可靠方法。本综述了PCR检测炭疽杆菌芽孢的原理及其技术应用。     

多重PCR方法快速检测血流感染10种常见病原菌方法的建立与应用

目的应用多重聚合酶链式反应(PCR)技术,建立肺炎克雷伯菌、鲍氏不动杆菌、肺炎链球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌等临床常见病原菌的快速、高效检测方法,并应用于血培养后病原菌的检测。方法以肺炎克雷伯菌khe基因、鲍氏不动杆菌OXA基因、肺炎链球菌LytA基因、屎肠球菌和粪肠球菌ddl基因、大肠埃希菌phoA基因、表皮葡萄球菌2312基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、铜绿假单胞菌ecfX基因、奇异变形杆菌ure基因序列为模板,分别设计特异性引物,建立多重PCR扩增体系并优化。收集临床血培养报阳标本200份,应用所建立的多重PCR法鉴定,并与传统血培养方法比较。结果多重PCR法可特异性扩增出10种病原菌目标DNA条带,200份报阳样本目标菌阳性预测值为60.5%,除传统血培养有1份漏检外,多重PCR与血培养法结果符合率为100%。结论多重PCR方法与传统鉴定方法相比,可大幅度缩短临床培养报阳后鉴定时间,其多种病原菌同时检测的优势,具有良好的临床应用前景。     

污蝇杆菌荧光定量PCR快速检测方法建立

目的 污蝇杆菌(Wohlfahrtiimonas chitiniclastica bacilli)是近年新发现的条件致病菌,临床上曾引起爆发性脓毒血症,本文拟建立污蝇杆菌荧光定量PCR的快速检测方法。方法 根据污蝇杆菌W.chitiniclastica SH04的全基因组DNA序列,采用Primer Express 3.0设计引物和Taqman荧光探针,建立实时荧光定量PCR的快速检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行验证。结果 污蝇杆菌荧光定量PCR快速检测方法具有良好的特异性,重复性试验的变异系数均<2%,灵敏度为19 CFU/反应(20μL反应体系),使用该方法检测6份人为污染的样品,结果均为阳性,6份阴性对照及空白对照均为阴性。结论 本研究建立的荧光定量PCR方法可以快速、准确地检测污蝇杆菌。     

二株多杀巴斯德菌的致病性及耐药性分析

目的 了解多杀巴斯德茵的致病性及耐药性.方法 分别取伤口分泌物和肺深部痰液接种,经DNP - 9162BS - Ⅲ热恒温培养箱35.5℃培养24h,后经法国生物梅里埃全自动细菌鉴定仪鉴定细菌的生化及药敏反应.结果 伤口分泌物和深部痰中均检出多杀巴斯德茵.结论 多杀巴斯德茵可引起伤口和肺部感染耐药性有个体差异.     

食品中单增李斯特菌PCR检测方法建立与评价

目的建立单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）快速、敏感、特异的PCR诊断方法。方法采用聚合酶链式反应技术（PCR）特异性扩增单核细胞增生李斯特菌溶血素基因（hlyA），并评价该方法的特异性与敏感性。结果在706bp处出现nuc基因的目的片断，只有单增李斯特菌的目的片段获得扩增，其他菌种扩增均呈阴性；该方法可以检测到3．3ng／L的DNA。结论PCR方法比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏和简便。为食品中单增李斯特菌的快速检测提供了新的手段。     

3种不同方法对入境旧书中携带蜡样芽孢杆菌的检测分析

目的对一株从美国入境旧书中分离的菌株进行鉴定。方法从旧书表面采集样本分离获得一株菌株,分别采用VITEK生化鉴定、16s rDNA序列分析法及特异性引物PCR 3种方法进行鉴定。结果VITEK生化鉴定判定可能属于蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌的一种。16s rDNA通用引物PCR检测结果显示该菌株与芽孢杆属同源性最高达99%。特异性引物PCR检测结果判定为蜡样芽孢杆菌。结论初筛和特异性检测方法相结合,可以有效的对入境货物携带的致病微生物进行鉴定。     

凝结芽孢杆菌PCR快速检测方法研究

目的:建立一种特异、灵敏的凝结芽孢杆菌快速检测方法。方法:根据凝结芽孢杆菌寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因设计一对PCR引物,进行了引物的特异性和灵敏度试验。结果:PCR得到了较好的特异性扩增,其它干扰菌都无扩增,灵敏度达5×103cfu/ml。结论:该方法能够实现凝结芽孢杆菌的快速检测,具有灵敏度高、特异性好的特点。     

实时荧光定量PCR法检测人粪便中艰难梭状芽孢杆菌

目的摸索并明确实时荧光定量PCR技术检测人体肠道粪便中艰难梭状芽孢杆菌的方法。方法用16S rRNA real-time PCR方法检测喘息患儿与正常儿童肠道内梭状芽孢杆菌的数量。结果常规PCR扩增出艰难梭状芽孢杆菌16S rRNA部分基因片段长度为500 bp~750 bp,测序结果正确,符合预期,成功构建了艰难梭状芽孢杆菌实时荧光定量PCR中的标准品,生成的标准曲线r20.995;实时荧光定量PCR产物的溶解曲线为单峰,表明实时荧光定量PCR的特异性强。对待测80份样本分批进行荧光定量PCR检测,各组间标准品Ct值的变异系数(CV)为4.96%、3.45%、2.46%、2.43%和2.75%。80份儿童粪便样本中艰难梭状芽孢杆菌含量的对数值为3.70±2.71(copy/g湿便)。结论本研究表明,实时荧光定量PCR方法操作简便、灵敏度高、特异性强、自动化程度高,适用于人体粪便中艰难梭状芽孢杆菌含量的检测。     

耐药鲍曼不动杆菌耐药基因检测及同源性分析

目的了解南京市某医院鲍曼不动杆菌的感染和耐药情况。方法对2011年2月至2013年4月临床检出的56例鲍曼不动杆菌标本进行药敏试验;采用聚合酶链式反应(PCR)进行OXA-51、OXA-23、OXA-24、OXA-58、VIM、SHV、GES、IMP和TEM共9种耐药基因的检测;从中选择44株应用脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行同源性分析。结果 56株检出泛耐药株38株,不同病区泛耐药与非泛耐药株的阳性率差异有统计学意义。菌株对常用抗生素除阿米卡星和妥布霉素外,耐药率均大于60.00%。56株经PCR检出OXA-51 49例(87.50%)、OXA-23 46例(82.14%)、OXA-58 1例(1.79%)、TEM 56例(100.00%)、VIM 45例(80.36%)、GES 16例(28.57%)及SHV 4例(7.14%);未检出OXA-24和IMP。44株经PFGE共分为14个型,其中A型20株,为主要流行株;B型5株,C型8株,剩余菌株为互不相同型。结论该院鲍曼不动杆菌感染以ICU和呼吸科居多,对常用抗生素高度耐药,OXA-51,OXA-23,TEM和VIM为主要耐药基因。近半数菌株以同源形式传播,交叉感染现象严重,应引起重视和采取改进措施。     

结核分枝杆菌的优化PCR检测方法的研究

〔目的〕的建立了检测结核分枝杆菌的高灵敏度和高特异性PCR扩增体系。[方法]以国内结核病人常见病原菌-结核分枝杆菌、牛分枝杆菌特异性抗原Pab编码基因上的419bp段作为扩增靶序列,扩增引物序列为5’-ACC、ACC、GAG、CGG、TTC、CCC、TGA-3’、5’-GAT、CTG、CCG、GTC、GTC、CCA、GGT-3’。〔结果〕变性温度选择69℃-70℃。PCR扩增体系的成份经优化,选择引物浓度为0.30μmol/L,dNTP浓度为150μmol/L,MgC12浓度为3.5mmol/L。〔结果〕该体系对11株标准菌株和12株临床分离菌株提纯的染色体进行扩增,其中卡介苗、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌的扩增为阳性,其他分枝杆菌为阴性。〔结论〕以提纯的染色体DNA作模板,该体系可检出5fg结核杆菌染色体DNA,相当于一个结核分枝杆菌。     

嗜酸氧化亚铁硫杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

〔目的〕建立一种检测进出境环保用微生物菌剂中嗜酸氧化亚铁硫杆菌(acidithiobacillus ferrooxidans,A.ferrooxidans)的实时荧光定量PCR方法。〔方法〕用9K培养基培养A.ferrooxidans标准菌株A.ferrooxidans ATCC23270,并提取基因组DNA作模板;根据GenBank中嗜酸氧化亚铁硫杆菌的16S基因序列设计合成引物和探针,用含有101 bp扩增目标产物的pGEM誖-T Easy载体质粒为阳性对照,构建标准曲线,建立荧光定量PCR检测方法,并进行方法学的评估。〔结果〕成功建立了嗜酸氧化亚铁硫杆菌的荧光定量PCR检测方法,该方法对嗜酸硫杆菌属中嗜酸氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans,A.thiooxidans)和嗜酸喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus,A.caldus)无交叉反应;最少可检测到100个阳性质粒,说明有很好的敏感性;试验内变异系数为0.32%,具有很好的重复性。〔结论〕建立的嗜酸氧化亚铁硫杆菌的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法特异性和灵敏度高、重复性好,可作为嗜酸氧化亚铁硫杆菌高通量的快速检测方法。     

鲍氏不动杆菌快速检测方法的建立与应用

目的建立鲍氏不动杆菌快速检测方法并应用于临床,为预防控制鲍氏不动杆菌医院感染提供依据。方法以鲍氏不动杆菌recA基因和16S-23SrRNA基因间区序列为目的基因,建立一种快速检测鲍氏不动杆菌的多重聚合酶链反应(PCR)方法。结果该方法对1株鲍氏不动杆菌标准株和12株临床株进行快速检测,结果准确可靠;用该方法直接对临床环境采样标本进行检测,能够检出鲍氏不动杆菌。结论建立鲍氏不动杆菌的快速检测方法,可为控制鲍氏不动杆菌医院感染提供有力工具。     

福氏志贺菌血清型单重PCR鉴定方法的建立及应用

目的 建立基于O抗修饰基因的福氏志贺菌血清型PCR鉴定方法.方法 根据福氏志贺菌O抗原合成及修饰特异基因设计引物,以常见的14种福氏志贺菌血清型(包括1a、1b、1c、2a、2b、3a、3b、4a、4b、5a、Y、X、Xv和F6)为标准菌株,建立福氏志贺菌血清型单重PCR鉴定方法;并以痢疾志贺菌、宋内志贺菌、鲍氏志贺菌和腹泻相关的其他菌属菌株验证特异性;应用该方法对106株福氏志贺菌临床分离株进行PCR血清分型.结果 建立一种福氏志贺菌血清型单重PCR鉴定方法,通过8个PCR反应,能够鉴定目前已知的15种血清型中的14种(Xv除外).检测灵敏度在10 pg至1 ng DNA(20μl反应体系).对106株福氏志贺菌临床分离株的检测结果提示,PCR分型方法与玻片凝集法具有很高的一致性.结论 本研究建立的福氏志贺菌血清型单重PCR鉴定方法具有特异性、灵敏性,可用于临床检测.     

福氏志贺菌血清型单重PCR鉴定方法的建立及应用

目的 建立基于O抗修饰基因的福氏志贺菌血清型PCR鉴定方法.方法 根据福氏志贺菌O抗原合成及修饰特异基因设计引物,以常见的14种福氏志贺菌血清型(包括1a、1b、1c、2a、2b、3a、3b、4a、4b、5a、Y、X、Xv和F6)为标准菌株,建立福氏志贺菌血清型单重PCR鉴定方法;并以痢疾志贺菌、宋内志贺菌、鲍氏志贺菌和腹泻相关的其他菌属菌株验证特异性;应用该方法对106株福氏志贺菌临床分离株进行PCR血清分型.结果 建立一种福氏志贺菌血清型单重PCR鉴定方法,通过8个PCR反应,能够鉴定目前已知的15种血清型中的14种(Xv除外).检测灵敏度在10 pg至1 ng DNA(20μl反应体系).对106株福氏志贺菌临床分离株的检测结果提示,PCR分型方法与玻片凝集法具有很高的一致性.结论 本研究建立的福氏志贺菌血清型单重PCR鉴定方法具有特异性、灵敏性,可用于临床检测.     

沈阳市2012—2021年食源性致病菌监测蜡样芽孢杆菌多位点可变数量串联重复序列的分型分析

目的 利用多位点可变数量串联重复序列分型(MLVA)技术,对沈阳市在各类食品检出的蜡样芽孢杆菌进行分子分型,为预防预警食物中毒提供技术支持。方法 采集2012—2021年沈阳市食源监测样品中蜡样芽孢杆菌阳性菌株61株,利用PCR方法,结合毛细管电泳,对样品选择Bcms-08、Bcms-17、Bcms-18、Bcms-19、Bcms-20共5个位点进行蜡样芽孢杆菌MLVA分子分型。结果 61株的蜡样芽孢杆菌有24个基因分型,共分为3个聚类群,其中食物来源相同的菌株基因分型基本一致,但相同食物来源的菌株又处在不同聚类群的基因分型中。结论 蜡样芽孢杆菌MLVA分型呈较好的多态性,大部分菌株亲缘关系较近,相似度较高,无明显的聚集性。由于研究中缺少食物中毒爆发菌株及食品外环境分离株,样本数量有限,所以对致病菌的基因分布尚有局限性。     

多药耐药纹带棒杆菌的重复序列PCR分型与耐药机制的研究

目的对引起医院感染暴发的多药耐药纹带棒杆菌(MDRCs)进行重复序列PCR研究,为MDRCs的亲缘性分析提供可靠的方法,并对MDRCs的耐药机制进行初步研究。方法用基因外重复回文序列-PCR(REPPCR)和肠细菌基因间共有重复序列-PCR(ERIC-PCR)技术对临床分离的32株MDRCs进行分型研究,根据细菌的耐药表型选择对应的耐药基因进行检测。结果 REP-PCR和改良ERIC-PCR分型技术分别将32株MDRCs分为6型和8型,两种方法的分辨指数分别为0.585和0.696;所有菌株中与大环内酯类抗菌药物相关的核糖体甲基化酶基因(ermX)检出率为90.6%,与四环素耐药相关的核糖体保护蛋白基因(tetW)的检出率为100.0%,菌株耐药基因的检出与耐药表型完全相符。结论重复序列PCR(rep-PCR)分型方法可用于纹带棒杆菌的分型研究及医院感染MDRCs的亲缘性分析,ERIC-PCR的分辨能力优于REP-PCR;中国重庆地区的MDRCs分别介导ermX和tet(W)基因对大环内酯类和四环素类抗菌药物高水平耐药。     

PCR法检测结核杆菌

结核分枝杆菌,俗称结核杆菌,是引起结核病的病原菌。可侵犯全身各器官,但以肺结核为最多见。结核病的症状和体征往往不典型,虽可借助X线摄片诊断,但确诊仍有赖于细菌学检查。一般涂片检查菌数需5x103～4/ml,培养需1x102/ml,标本中菌数少于此数时不易获得阳性结果,且培养需时较长。目前已将多聚酶链反应（PCR）扩增技术应用于结核分枝杆菌DNA鉴定,每ml中只需含几个细菌即可获得阳性。PCR是聚合酶链式反应的简称,是一种酶促化学反应,可以在试管里将待测的目的基因在很短的时间内扩增几十万倍乃至上百万倍,大大提高了基因诊断的灵敏度,降低了分析的难度。操作中需注意实验器材的污染问题,以免出现假阳性。现将荧光定量PCR法检测结核杆菌结果,报告如下。     

双歧杆菌检测方法进展研究

双歧杆菌是一类无芽孢、不运动、厌氧、不产CO2、产生乙酸和乳酸的多型性革兰阳性杆菌，它具有维持微生态平衡．生物拮抗．提高免疫水平．营养．防病治病等诸多功能，因而被广泛开发应用于医疗、保健、食品等方面。目前，市场上有大量含双歧杆菌的微生态制品出售，有报道，只有当双歧杆菌活菌数达到10^6cfu／ml以上，才能发挥正常的生理功能．因此，此类产品质量的关键是双歧杆菌的含量，而有些产品质量的关键是双歧杆菌的含量，而有些产品竟查不出双歧杆菌活菌。可见．微生态制品中双歧杆菌的选择性检出与计数就成为一项重要的工作。但是微生态制品中各种菌．特别是乳酸杆菌，其生理、生化特性和双歧杆菌非常相似，给双歧杆菌的选择性检出与计数带来一定的困难，对此，国内外进行了大量研究，提出了一些解决办法，本文就此做一综述。