HRMA技术在检测线粒体DNA单核苷酸多态性中的应用

目的 高分辨熔解曲线分析（high-resolution melting analysis,HRMA）方法是通过检测和分析不同基因型DNA分子在解链时随荧光信号变化而产生的不同熔解曲线,进行SNPs分型的技术。探索HRMA技术在检测线粒体DNA分子基因多态性中的应用。方法 利用未标记探针（unlabled probe）HRMA技术,进行人线粒体DNA 单核苷酸多态性(mtSNPs)分型,并经限制性片段长度多态(restriction fragment length polymorphism, RFLP)分型技术和测序验证。结果 结果显示,未标记探针HRMA分型与RFLP分型和测序验证结果完全相符。结论 本研究表明未标记探针HRMA技术方法准确率较高,是一种适合mtSNPs分型的方法。     

线粒体肌病患者线粒体DNA的突变分析

目的分析线粒体肌病患者线粒体DNA的突变情况，为疾病诊断提供依据。方法用常规HE、酶组化染色和电镜检查等病理形态学方法对3例线粒体肌病疑似患者进行诊断，并用聚合酶链反应-单链构象多态和DNA测序等方法对患者线粒体DNA中全部22个tRNA基因进行突变筛查。结果3例患者均被确诊为线粒体肌病，其中例1tRNA—VaI基因发生A1627G纯合突变，例2tRNA—Val基因发生A1627G／A杂合突变，例3tRNA—Trp基因发生T5554C突变、tRNA—Arg基因发生A10412C／A杂合突变。结论线粒体DNA中的tRNA基因突变是线粒体肌病的重要病因之一。     

应用mAPLP方法对湖南地区苗族人群进行mtDNA多态性研究

摘要：目的 应用多重扩增产物片段长度多态性分析方法（multiplex-amplified product-length polymorphism，mAPLP）建立线粒体DNA编码区单核苷酸多态（single nucleotide polymorphism, SNP）快速、准确、有效的分型方法. 方法 根据线粒体DNA SNP 位点（11969A 、10398A、 10400T、12811C、4580A 、14979C）设计两条不同的正向或反向引物（使PCR扩增片段长度不同）和一条共用的反向或正向引物，运用多重PCR方法扩增，扩增产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析. 结果 SNP基因座为片段大小不同的单一谱带，在湖南地区40名无血缘关系苗族个体中，6个SNP基因座的分布频率分别为 0.025/0.975、0.2/0.8、0.2/0.8、0.25/0.75、1.00/0、1.00/0、0.025/0.975.共检出7种单倍型，单倍型分布频率为0.025、0.05、0.125、0.175、0.025、0.05、0.55. 结论 此方法是一种简单、快速、准确、有效的SNP 分型方法，对建立mtDNA编码区SNP数据库，研究人类群体遗传学，进行法医学个体识别等具有很大的应用价值.     

单核苷酸多态性遗传标记(SNP)的检测及其应用

单核苷酸多态性遗传标记(SNP)作为第三代遗传标记,成为人类遗传学、基础医学、药物遗传学、医学遗传学及法医学等多学科的研究热点和重要工具,并在这些学科发挥重要作用。     

致病性耶尔森氏菌PCR扩增多态性的研究

目的为了解不同来源的鼠疫耶尔森氏菌和不同血清型的小肠结肠炎耶尔森氏菌及假结核耶尔森氏菌（ＰＴＢ３）的遗传学差异。方法使用随机引物扩增多态ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）技术。结果鼠疫耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌的扩增主带型相似，而与小肠结肠炎耶尔森氏菌的差异较大；不同来源的鼠疫耶尔森氏菌株ＲＡＰＤ图谱亦有细微差别。小肠结肠炎耶尔森氏菌不同血清型的菌株以及同一血清型不同来源株的ＲＡＰＤ亦有较大差异。这为耶尔森氏菌更进一步的分型提供了一种新方法。此外，还根据小肠结肠炎耶尔森氏菌肠毒素基因设计了一对引物，将７个血清型６６株小肠结肠炎耶尔氏菌分成两组，一组的扩增为预期的２８９ｂｐ片段，另一组为约２００ｂｐ的片段。结论实验表明，鼠疫菌和假结核菌可以通过ＲＡＰＤ和其它生物学技术相结合加以区分。使用ＲＡＰＤ技术可对同一血清型不同来源的小肠结肠炎耶尔森氏菌进行更进一步分型。上述方法可用于分子流行病学调查。     

多色荧光PCR法检测HBV耐药位点突变

目的 利用多色荧光PCR技术,建立一套快速检测HBV耐药位点突变的方法 ,并对临床收集的服药患者血清进行耐药位点检测.方法 建立2个反应体系,每个反应体系包含4个耐药位点.对新建的多色荧光PCR法进行灵敏度和特异性分析,并对30例临床收集的服药患者血清进行耐药检测.结果 构建了多色荧光PCR检测HBV耐药位点的体系,其特异性较好,分析灵敏度可达1×103拷贝/ml.30例样本中检测到YVDD 2例（占6.67%）,YIDD 1例（占3.33%）;1896位点变异5例,占总数的16.67%.其他位点未检测到耐药突变.结论 所构建的多色荧光PCR检测体系为临床医院提供快速、简便的HBV耐药位点突变检测手段.HBV基因前C区的1896位点变异率较高.     

PCR／SSCP技术在检测HLA基因点突变中的应用

聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ／ＳＳＣＰ）是根据核苷酸序列不同的单链ＤＮＡ，可形成不同构象，从而在不含变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中泳动速度不同的原理，分离鉴定等长ＤＮＡ单链的方法，本文应用ＰＣＲ／ＳＳＣＰ方法检测了６０例无亲属关系个体白细胞抗原Ⅱ类基因（ＨＬＡ－ＤＱＡ１）５－上游调控区的等位基因多态性，并以ＰＣＲ直接测序证明每种ＳＳＣＰ带型都与不同位置单个碱基取代相关联。     

应用间接法原位PCR检测石蜡切片中HPV DNA

应用间接法原位ＰＣＲ检测石蜡切片中ＨＰＶＤＮＡ王剑波王伯马福成陈万录杨莉胡沛臻聚合酶链式反应（ＰＣＲ）是一种对特定的ＤＮＡ片段在体外经酶促反应进行快速扩增的技术。它是一种极其敏感的技术。间接法原位ＰＣＲ是先将待检基因在原位进行ＰＣＲ扩增，然后再用原...     

应用PCR—SSCP法检测LDL受体基因多态性

利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）从人白细胞ＤＮＡ中扩增到一条长为１７２碱基的ＬＤＬ受体基因外显子２ＤＮＡ片段，对３０个ＰＣＲ扩增产物进行了单链构象多态性分析（ＳＳＣＰ），其中２个图谱出现异常，序列证实是由ＬＤＬ受体基因外显子２第１４位碱基因Ｔ置换由Ｃ，形成多态性，建立的这种方法可以快速，简便地分析了ＬＤＬ受体因外显子２的多态性。     

延边地区汉族群体线粒体DNA编码区五个部分序列多态性

目的 了解中国汉族群体线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)5个编码区3954～4506nt、5218～5974nt、7942～8711nt、10296～10653nt及14496～14867nt的序列多态性.方法 采用PCR产物直接测序方法,对200名吉林省延边地区汉族无关个体进行序列多态性变化和单倍型分布调查.结果 在200名无关个体中,共分出110种单体型.遗传变异度为0.9879,偶合概率为0.0171.测序结果与Anderson标准序列比较,共检测出81个变异位点,其中66个与MITOMAP收录的基因突变相同,15个未见收录.结论 mtDNA编码区多态性位点作为mtDNA控制区多态性位点的补充,联合应用可以提高mtDNA的个体识别能力.而且可为中国汉族群体的法医学个人识别、亲权鉴定及民族遗传学研究提供宝贵的基础数据资料.     

中国云南怒族群体线粒体DNA D环区SNP遗传多态性研究

目的观察怒族群体线粒体DNA单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）的群体遗传特点,为法医学鉴定提供线粒体DNA序列多态性的基础数据,并为研究少数民族起源提供科学依据。方法应用ABI3730型遗传分析仪,PCR产物直接测序法,对87名中国云南怒族无关个体线粒体DNAD环Ⅰ区进行序列分析。结果在mtDNA高变区SNP16028～16362之间与Anderson序列比较,怒族87名无关个体中共检出62个碱基突变SNP位点,突变点492个,59个SNP单倍型。怒族mtDNA两个高变区SNP基因差异度为0.9675,偶合概率为0.0437。结论怒族线粒体DNAD环Ⅰ区SNP具有高度多态性,是对怒族群体的个体识别、亲权鉴定以及民族起源的分子研究有用的遗传标记。     

中国朝鲜族群体mtDNA编码区3954-4506nt序列多态性

目的 了解中国朝鲜族群体线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)编码区3954-4506nt的序列多态性.方法 采用PCR产物直接测序方法 对198名吉林省延边朝鲜族自治州朝鲜族无关个体进行单倍型分布调查.结果 在198名无关个体中,共分出21种单倍型.遗传变异度为0.5906,偶合概率为0.4124.测序结果 与Anderson序列比较,共检测出19个变异位点,14个与MITOMAP收录的基因突变相同,5个未见收录.结论 mtDNA编码区多态性位点作为mtDNA控制区多态性位点的补充,联合应用可以提高mtDNA的个体识别能力,为mtDNA在中国朝鲜族法医学鉴定提供了基础数据.     

河北汉族群体mtDNA HV1、HV2重叠片段及编码区8430-8673nt序列多态性

目的了解河北汉族群体线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)HV1、HV2区重叠片段及编码区8430-8673nt的序列多态性。方法采用聚合酶链反应-单链构象多态性结合测序方法对100名河北汉族个体进行单倍型分布调查。结果在河北汉族100名健康无关个体中，共分出91种单倍型。遗传变异度为0．9985．耦合概率为0．0115。测序结果与Anderson序列比较，共检测出65个变异位点，44个与MITOMAP收录的基因突变相同，9个与所收录的不同，12个未见收录。结论线粒体DNA在河北汉族群体中有较好的多态性分布，是法医学个人识别和母系亲属认定良好的遗传标记，为mtDNA在河北法医学鉴定提供了基础数据。     

Multiplex mutagenically separated polymerase chain reaction assay for rapid detection of human mitochondrial DNA variations in coding area

Recently, it has been recognized that information in the mitochondrial DNA (mtDNA) coding region can provide additional forensic discrimination with respect to the standard typing of the D-loop region, increasing the forensic power of mtDNA testing, which is sometimes rather limited. In the present study, we simultaneously typed ten single nucleotide polymorphisms (SNP) in the coding region by use of mutagenically separated polymerase chain reaction (MS-PCR) in the Chinese Chengdu population. This technique, in which different-size allele-specific primers were used, specifically amplified both alleles of mtDNA in the same reaction. Subsequent gel electrophoresis showed ten of the allelic products of different loci. Using multiplex MS-PCR, 30 primers were added simultaneously into one reaction tube to identify ten SNPs. The mtDNA variations of 160 individuals from the Chinese Chengdu population were examined and classified into 18 haplotypes. The multiplex MS-PCR method is suitable for large-scale screening studies of mtDNA variability because it is both rapid and economical.     

单管双向等位基因专一性扩增的单核苷酸多态分型的新方法

目的：建立一种基于等位基因专一性PCR原理的单核苷酸多态（single nucleotidepolymorphism,SNP)分型新方法：单管双向等位基因专一性扩增（single-tube bi-directional allele specificamplification,SB－ASA）,并考察专一性引物的3’端第3位碱基不配对对特异延伸的影响。方法：一个PCR反应体系包含两个3’末端分别与SNP两个等位基因特异结合的引物,它们延伸方向相反,产生长度不同的等位基因专一扩增产物,同时在两个等位基因特异性引物的3’端第3位碱基引入不配对以增加特异性。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后分析确定样本的基因型。观察在不同的温度条件下,近3’末端引入与不引入碱基不配对时两种引物特异延伸的情况,比较两种引物能特异延伸的退火温度（annealingtemperature,Ta)范围。结果：对于4个不同类型的SNP位点,SB－ASA都成功地分型了36个样本,与直接测序的结果完全一致。两条专一性引物3’物第3位碱基引入不配对后,能特异延伸的退火温度Ta范围分别从64℃～69℃、60℃～62℃扩大到46℃～66℃、56℃～61℃。结论：SB－ASA是一种简单快速而有效的SNP分型新方法;在等位基因专一性PCR体系中,专一性引物3’端第3位碱基引入不配对能增加引物对两个等位基因的区分能力。     

Development of a quantitative PCR (TaqMan) assay for relative mitochondrial DNA copy number and the common mitochondrial DNA deletion in the rat

Changes in mitochondrial DNA copy number and increases in mitochondrial DNA mutations, especially deletions, have been associated with exposure to mutagens and with aging. Common deletions that are the result of recombination between direct repeats in human and rat (4,977 and 4,834, bp, respectively) are known to increase in tissues of aged individuals. Previous studies have used long-distance PCR and Southern blot or quantitative PCR to determine the frequency of deleted mitochondrial DNA. A quantitative PCR (TaqMan) assay was developed to detect both mitochondrial DNA copy number and deletion frequency in the rat. This methodology allows not only the determination of changes in the amount of mitochondrial DNA deletion relative to total mitochondrial DNA but also to determine changes in total mitochondrial DNA relative to genomic DNA. As a validation of the assay in rat liver, the frequency of the common 4,834 bp deletion is shown to increase with age, while the relative mitochondrial DNA copy number rises at a young age (3-60 days), then decreases and holds fairly steady to 2 years of age.     

中国成都汉族群体线粒体DNA控制区序列多态性研究

目的　检测并分析中国成都汉族群体线粒体 DNA控制区多态性 ,为法医学应用提供基础数据。方法　应用 PCR扩增和直接测序方法检测 10 0个不相关中国成都汉族群体线粒体 DNA控制区中高变区 、 的序列多态性。结果　检测高变区 中 4 0 4个核苷酸和高变区 中 379个核苷酸的序列 ,在 区和 区分别检测到 92和 5 0个变异点 ,与 Anderson标准序列比较 ,共检测到 97种单倍型。偶合概率分别为1.84 %与 1.94 % ,两者合并后为 1.18%。结论　提示线粒体 DNA控制区 DNA序列多态性在法医学领域中具有较高的应用价值。     

消化后片段长度差异等位基因特异性PCR技术--印记SNP rs220028多态性和甲基化模式研究

目的建立一种能同时分析甲基化和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)的新方法。方法以印记SNP rs220028(A／G)为例，基因组DNA经甲基化敏感限制酶消化后用片段长度差异等位基因特异性PCR(fragment length discrepant allele—specific PCR，FLDAS—PCR)分型；用扩增产物酶消化法来排除酶切位点序列变异，证实检出的是甲基化等位基因。结果消化后FLDAS—PCR可选择性检出甲基化等位基因，家系分析表明其来自母亲。等位基因频率A=0．5085．G=0．4915，多态信息含量为0．3749。结论消化后FLDAS—PCR技术可以实现甲基化和SNP的复合分析；印记SNP rs220028在Prader—Willi／Angelman综合征诊断中有潜在意义。     

中国布依族、苗族人群线粒体DNA Region V区的遗传多态性

目的 研究中国布依族、苗族人群线粒体DNA Region V区的遗传多态性。方法 采用PCR直接测序法对布依族（96份）及苗族人（90份）样本线粒体DNA Region V区进行序列分析。结果 在布依族及苗族样本中只发现标准型和短型两种多态，短型多态（即9bp缺失）频率在布依族、苗族人群中分别为31．1％和33．3％。结论 中国布依族、苗族人群线粒体DNA Region V区有相似的多态性，而与其他民族或人种有一定差异。