NG-硝基-L-精氨酸对脂多糖诱导大鼠肺损伤时肺表面活性物质和细胞凋亡的影响

目的 探讨NG-硝基-L-精氨酸(L-NA)对内毒素性肺损伤大鼠肺表面活性物质(PS)和细胞凋亡的影响.方法 雄性SD大鼠24只,按随机数字表法均分为对照组、模型组、L-NA治疗组.模型组、L-NA治疗组舌下静脉注射脂多糖(LPS)复制内毒素性肺损伤模型;对照组给予等量生理盐水.L-NA治疗组于注射LPS 3 h后给予L-NA 20 mg/kg;对照组和模型组给予等量生理盐水.6 h后处死动物,取肺组织,用原位杂交法测定肺组织表面活性物质相关蛋白A(SP-A)mRNA表达;用流式细胞术检测肺组织细胞凋亡率;用蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)蛋白表达;用免疫组化法测定Bcl-2和Bax蛋白表达.结果 与对照组比较,模型组SP-A mRNA表达[吸光度(A)值]明显下降(0.071±0.017比0.113±0.021),细胞凋亡率[(25.04±4.57)%比(11.37±3.08)%]、caspase-3蛋白表达(A值:298.64±37.11比110.24±14.35)、Bax蛋白表达(A值:0.145±0.011比0.076±0.010)明显升高,Bcl-2蛋白表达(A值:0.064±0.011比0.073±0.009)和Bcl-2/Bax比值(0.447±0.086比0.976±0.157)明显下降(均P<0.01).与模型组比较,L-NA治疗组SP-A mRNA表达(A值:0.085±0.015)和Bcl-2蛋白表达(A值:0.070±0.087)明显增强(P<0.01和P<0.05),但细胞凋亡率[(20.67±1.35)%]、caspase-3蛋白表达(A值:268.75±42.56)、Bax蛋白表达(A值:0.142±0.012)和Bcl-2/Bax比值(0.498±0.069)均无明显变化(均P>0.05).结论 L-NA不通过抑制肺细胞凋亡来减轻内毒素性肺损伤的程度,对调节凋亡相关基因caspase-3和Bax也无明显影响;而是可通过增强PS表达减轻内毒素性肺损伤.     

肝细胞生长因子激活剂的抑制剂-1基因对宫颈癌细胞自噬及凋亡调控的影响

目的探讨肝细胞生长因子激活剂的抑制剂-1(hepatocyte growth factor activator inhibitor-1, HAI-1)基因对宫颈癌细胞自噬及凋亡调控的机制。方法对数生长期HeLa细胞分为转染组和对照组,转染组转染HAI-1质粒,对照组细胞正常培养。采用实时荧光定量PCR法检测2组细胞HAI-1 mRNA表达情况,采用AO染色和流式细胞术检测2组细胞自噬情况,采用ELISA检测2组细胞自噬相关因子LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ和Beclin-1蛋白水平,应用流式细胞仪检测2组细胞凋亡率,采用Western blot法检测细胞Bax和Bcl-2蛋白相对表达量。结果转染组细胞HAI-1 mRNA相对表达量(1.57±0.26)、AO细胞荧光强度(52.14±3.88)、LC3-Ⅱ蛋白[(3.42±0.85)μg/L]、Beclin-1蛋白[(14.69±1.96)μg/L]水平、细胞凋亡率[(86.75±6.42)%]、Bax蛋白相对表达量(1.24±0.13)和Bax/Bcl-2(7.75±0.83)高于对照组[0.48±0.09、5.47±0.32、(1.10±0.22)μg/L、(10.12±0.53)μg/L、(12.64±1.33)%、0.25±0.06、0.17±0.05)](P0.05),LC3-Ⅰ蛋白水平[(0.59±0.11)μg/L]、Bcl-2蛋白相对表达量(0.16±0.04)低于对照组[(3.26±0.82)μg/L、1.47±0.15](P0.05)。结论 HAI-1转染通过增加HeLa细胞中LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达,降低LC3-Ⅰ蛋白表达,提高Bax/Bcl-2来调节宫颈癌细胞的自噬和凋亡。     

胰岛素强化治疗拮抗烫伤大鼠心肌细胞凋亡的机制研究

目的 探讨大鼠重度烫伤后胰岛素强化治疗拮抗心肌细胞凋亡的作用及机制.方法 将18只SD大鼠按随机数字表法分为假伤组、烫伤组和胰岛素强化治疗组(强化治疗组),每组6只.制作30％总体表面积(TBSA)Ⅱ度烫伤模型及胰岛素强化治疗模型.伤后6h取大鼠左室心肌组织,采用原位末端缺刻标记法(TUNEL)检测心肌细胞凋亡,用免疫组化和蛋白质免疫印迹法(Western blotting)分别观察3种凋亡相关基因天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)、Bax和Bcl-2的蛋白表达.结果 与假伤组比较,烫伤后心肌凋亡细胞明显增多[(13.1±3.4)％比(0.6±0.4)％,P＜0.01];caspase-3、Bax的蛋白表达明显增高(免疫组化caspase-3:13.72±4.13比1.36±0.95,Bax:29.64±5.42比2.24±1.04; Western blotting caspase-3:5.72±2.13比1,Bax:4.64±1.42比1),而Bcl-2表达水平显著降低(免疫组化:3.39±1.52比8.01±2.56;Western blotting:0.69±0.42比1,均P＜0.01).经胰岛素强化治疗后,心肌细胞的凋亡率较烫伤组明显降低[(6.7±1.8)％比(13.1±3.4)％,P＜0.01],3种凋亡相关基因的蛋白表达水平正好与烫伤组的变化相反(免疫组化caspase-3:8.88±3.36比13.72±4.13,Bax:14.43±3.69比29.64±5.42,Bcl-2:8.61±3.72比3.39±1.52;Western blotting caspase-3:2.18±0.86比5.72±2.13,Bax:2.87±1.35比4.64±1.42,Bcl-2:3.57±1.70比0.69±0.42,P＜0.05或P＜0.01).结论胰岛素强化治疗可能通过调节caspase-3、Bax和Bcl-2 3种细胞凋亡相关基因的表达,对烫伤后心肌细胞发挥抗凋亡作用.     

过表达DACT1通过调节凋亡相关蛋白对人白血病细胞增殖的抑制作用研究

目的研究过表达DACT1通过调节凋亡相关蛋白对人白血病细胞增殖的抑制作用。方法在人白血病K562细胞中,通过基因转染试剂对空载质粒vector与DACT1质粒分别进行转染,分别作为阴性对照组与观察组,并使DACT1呈现过表达。另设置一组未经任何处理的细胞为空白对照组。通过流式细胞术、CCK-8法对DACT1过表达后K562细胞周期、增殖、凋亡的影响进行检测。并采用Western blot法对DACT1过表达后调节凋亡相关蛋白的表达进行检测。结果观察组克隆形成率为(6. 33±0. 98)%,较空白对照组(20. 74±3. 12)%、阴性对照组(20. 43±3. 32)%均明显降低(P 0. 05)。细胞增殖实验结果发现,观察组细胞增殖活性较空白对照组、阴性对照组均显著降低。观察组细胞凋亡率为(28. 97±3. 04)%,较空白对照组(0. 85±0. 12)%、阴性对照组(0. 83±0. 09)%均显著升高(P 0. 05)。观察组细胞G0/G1期比例较空白对照组、阴性对照组显著增加(P 0. 05)。观察组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(caspase-9)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)等促凋亡蛋白表达较空白对照组和阴性对照组均显著上调,而B淋巴细胞癌-2(Bcl-2)等抗凋亡蛋白的表达较空白对照组和阴性对照组均显著降低。结论在人白血病K562细胞中,DACT1过表达可阻滞细胞增殖,促使细胞凋亡,亦会影响细胞周期,使得细胞出现G0/G1期阻滞。分析其原因,可能与DACT1过表达具有潜在的抗肿瘤作用,其作用机制可能与上调促凋亡蛋白(caspase-3、caspase-9、Bcl-2)表达和抑制抗凋亡蛋白(Bcl-2)表达密切相关。     

沉默Bax基因对TNF-α诱导肺泡上皮细胞凋亡的影响

目的探讨沉默Bcl-2相关X蛋白(Bax)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导肺泡上皮细胞凋亡的影响。方法用0 ng/ml、10 ng/ml的TNF-α作用于人A549细胞,RT-PCR和Western blot检测细胞中Bax表达水平。A549细胞转染Bax小干扰RNA(Bax siRNA)、小干扰RNA阴性对照(siRNA control),RT-PCR和Western blot检测细胞中Bax表达水平。细胞分为空白对照组(未转染细胞)、TNF-α组(未转染细胞,培养液中含有10 ng/ml的TNF-α)、阴性对照组(转染siRNA control后的细胞,培养液中含有10 ng/ml的TNF-α)、干扰组(转染Bax siRNA后的细胞,培养液中含有10 ng/ml的TNF-α)。流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,Western blot检测细胞中p38、磷酸化的p38(p-p38)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)的表达。结果 10 ng/ml的TNF-α作用后的细胞中Bax mRNA和蛋白表达水平升高。转染Bax siRNA后细胞中Bax mRNA和蛋白水平均降低。空白对照组、TNF-α组、阴性对照组、干扰组细胞凋亡率依次为:(0.92±0.01)%、(7.94±0.19)%、(7.93±0.17)%、(4.62±0.13)%。TNF-α组、阴性对照组、干扰组细胞中p-p38、Cleaved Caspase-3表达水平均明显高于空白对照组(P0.01)。干扰组细胞中p-p38、Cleaved Caspase-3表达水平均明显低于TNF-α组(P0.01)。结论 TNF-α能够诱导肺泡上皮细胞凋亡,而沉默Bax能够部分逆转TNF-α促凋亡作用,作用机制可能与p38信号通路有关。     

补阳还五汤对大鼠心肺复苏后脑水肿和细胞凋亡的影响

目的 探讨补阳还五汤(BHD)对心肺复苏(CPR)后脑水肿和细胞凋亡的影响.方法 雄性SD大鼠24只按随机数字表法均分为假手术组、复苏组、BHD组.采用窒息法建立大鼠CPR模型,分别于自主循环恢复(ROSC)时和ROSC 12 h灌胃生理盐水或BHD.各组于ROSC 24 h取左侧大脑,采用干湿比重法计算脑组织含水量,原位末端缺刻标记法检测凋亡细胞,免疫组化法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Fas蛋白表达.结果 与假手术组比较,复苏组在ROSC后24 h脑含水量增加[(80.99±0.83)%比(78.60±0.46)%,P<0.05],脑凋亡相关蛋白Bax[(32.1±6.4)个/HP比(5.6±3.0)个/HP]、Bcl-2[(15.0±6.0)个/HP比(6.9±2.9)个/HP]、Fas[(17.3±7.7)个/HP比(3.9±2.0)个/HP]以及脑细胞凋亡[(47.5±8.5)个/HP比(10.6±4.7)个/HP]的表达增加(均P<0.01);与复苏组比较,BHD组脑含水量[(79.09±0.97)%]减少,Bax[(17.1±6.2)个/HP]、Fas蛋白[(10.9±4.3)个/HP]表达和细胞凋亡[(33.4±6.6)个/HP]明显降低, Bcl-2蛋白表达[(35.5±7.0)个/HP]明显增加(P<0.05或P<0.01).结论 BHD能够减轻脑水肿,减少细胞凋亡,具有脑保护作用.     

牛磺酸上调基因1对人绒毛膜癌JEG-3细胞增殖及迁移和凋亡的影响

目的探讨牛磺酸上调基因1(taurine-upregulated gene 1,TUG1)在人绒毛膜癌JEG-3细胞增殖、迁移和凋亡中的作用。方法采用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)技术构建TUG1慢病毒载体。将对数生长期人绒毛膜癌JEG-3细胞随机分为空白对照组(不作任何处理)、阴性对照组(转染阴性对照靶序列慢病毒载体)和转染组(转染siRNA-TUG1慢病毒载体)。采用实时荧光定量PCR法检测3组TUG1mRNA、caspase-3mRNA、caspase-9mRNA相对表达量,采用Western blot法检测3组TUG1、caspase-3、caspase-9蛋白相对表达量,采用Transwell小室试验检测3组培养24h细胞侵袭能力,采用CCK-8法检测3组细胞培养72h吸光度值,采用流式细胞术检测3组培养72h细胞凋亡率。结果构建siRNA-TUG1载体的慢病毒滴度为3×108 TU/mL;转染72 h,转染组TUG1 mRNA、caspase-3mRNA、caspase-9mRNA相对表达量(0.42±0.02、0.31±0.01、0.21±0.01)低于阴性对照组(1.09±0.03、1.29±0.03、1.02±0.01)和空白对照组(1.01±0.01、1.02±0.02、1.00±0.01)(P0.05),TUG1、caspase-3、caspase-9蛋白相对表达量(0.24±0.07、0.49±0.23、0.11±0.02)低于阴性对照组(7.32±0.05、10.12±1.47、9.98±2.78)和空白对照组(6.08±0.19、9.88±0.93、9.91±1.44)(P0.05);培养24h,转染组迁移细胞数[(52.11±4.09)个]较阴性对照组[(142.11±14.02)个]和空白对照组[(131.32±18.39)个]少(P0.05);培养72h,转染组细胞吸光度值(24.27±3.11)较阴性对照组(51.12±2.47)和空白对照组(60.34±1.24)低(P0.05),细胞凋亡率[(35.21±13.31)%]较阴性对照组[(3.09±1.13)%]和空白对照组[(4.21±1.24)%]高(P0.05);阴性对照组各观察指标与空白对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论 TUG1沉默表达慢病毒载体可明显抑制人绒毛膜癌JEG-3细胞增殖和侵袭,促进细胞凋亡。     

下调STC2基因表达对前列腺癌细胞增殖及凋亡的影响研究

目的探讨抑制斯钙素-2(stanniocalcin-2,STC2)基因表达对前列腺癌细胞增殖及凋亡的影响。方法通过Lipofectamine TM2000脂质体介导法将siRNA阴性对照组和STC2-siRNA组转染人前列腺癌PC-3细胞,未转染的细胞作为空白对照组,48 h后收集细胞,Western bloting检测各组细胞中STC2的蛋白表达;CCK8及流式细胞仪分别检测细胞的增殖及凋亡情况;Western bloting检测增殖相关蛋白ki67、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)家族Bcl-2和Bcl-2相关X蛋白(Bax)及PI3K/AKT信号通路磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和磷酸化的丝氨酸苏氨酸激酶(pAKT)的蛋白表达。结果 STC2-siRNA转染PC-3细胞后STC2的蛋白表达显著低于空白对照组(P0.05);阴性对照组细胞OD值及细胞凋亡率与空白对照组差异无统计学意义(P0.05),而STC2-siRNA组细胞OD值显著低于空白对照组,凋亡率显著高于空白对照组(P0.05);阴性对照组ki67、Bcl-2、Bax、PI3K和p-AKT蛋白表达与空白对照组差异无统计学意义(P0.05),STC2-siRNA组ki67、Bcl-2、PI3K和p-AKT蛋白表达均显著低于空白对照组,Bax蛋白表达显著高于空白对照组(P0.05)。结论 STC2基因表达的抑制可降低前列腺癌细胞的增殖,并诱导细胞凋亡,其机制与调节ki67、Bcl-2、Bax及PI3K/AKT信号通路表达有关。     

鸦胆子油乳对戈舍瑞林去势抵抗性前列腺癌PC3细胞株化疗敏感性的影响

目的探讨质量分数10%鸦胆子油乳(Brucea javanica oil emulsion, BJOE)对戈舍瑞林去势抵抗性前列腺癌PC3细胞株化疗敏感性的影响及机制。方法对数生长期戈舍瑞林去势抵抗性前列腺癌PC3细胞株分为空白组、BJOE组、多西他赛组、多西他赛+BJOE组,细胞培养液中分别加入磷酸盐缓冲液、质量分数10%BJOE、0.6μg/L多西他赛、质量分数10%BJOE+0.6μg/L多西他赛进行干预。培养24、48、72 h时,采用MTT法检测4组细胞增殖抑制率;培养48 h时,采用流式细胞术检测4组细胞凋亡率,采用Hoechst 33258染色观察细胞形态学变化,采用实时荧光定量PCR法检测4组细胞B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)、caspase-3 mRNA相对表达量,采用Western blot法检测4组细胞Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白相对表达量。结果培养24、48、72 h时,多西他赛+BJOE组、多西他赛组、BJOE组细胞增殖抑制率依次降低(P0.05),3组细胞增殖抑制率均随时间延长而增高(P0.05);培养48 h时,空白组细胞核圆形或椭圆形,细胞质分布均匀;BJOE组、多西他赛组、多西他赛+BJOE组部分细胞呈不规则状态,染色质固缩、体积缩小,部分出现蓝色凋亡小体,其中多西他赛+BJOE组凋亡现象最明显;培养48 h时,多西他赛+BJOE组、多西他赛组、BJOE组、空白组细胞凋亡率[(28.71±3.15)%、(18.85±2.03)%、(14.62±1.57)%、(9.10±1.02)%]依次降低(P0.05),Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量依次增高(P0.05),Bax、caspase-3 mRNA和蛋白相对表达量依次降低(P0.05)。结论质量分数10%BJOE与多西他赛联用可抑制戈舍瑞林去势抵抗性前列腺癌细胞增殖,促进细胞凋亡,增强细胞对多西他赛化疗敏感性,可能与下调Bcl-2 mRNA和蛋白表达,上调Bax、caspase-3 mRNA和蛋白表达有关。     

胆红素对脑缺血再灌注大鼠半暗带区神经保护作用实验研究

目的探讨胆红素对脑缺血再灌注大鼠半暗带区神经保护作用及其潜在机制。方法 48只SD大鼠随机分为假手术组、胆红素干预组和生理盐水对照组各16只。假手术组大鼠仅分离血管,不结扎不插入线栓;胆红素干预组和对照组采用线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型,再灌注2h后,胆红素干预组经腹腔注入2 mmol/L胆红素2.5mL,对照组经腹腔注入2.5mL生理盐水。再灌注24h后,各组采用TNUEL检测缺血半暗带区域细胞凋亡率,采用Western blot检测缺血半暗带区组织凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和caspase-3含量,采用ELISA法检测缺血半暗带区域氧化应激分子超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)和8-羟脱氧鸟苷(8-hydroxydeoxyguanosine,8-OHdG)含量。结果再灌注24h后,胆红素干预组和对照组半暗带区细胞凋亡率[(27.8±2.6)%、(47.8±7.0)%]、半暗带组织Bcl-2相对灰度值(1.9±0.3、1.4±0.3)、Bax相对灰度值(2.0±0.1、2.8±0.2)、caspase-3相对灰度值(1.9±0.2、3.0±0.1)、MDA[(4.9±0.3)、(11.3±0.2)μmol/g]和8-OHdG[(3.5±0.1)、(5.3±0.2)μg/L]水平明显高于假手术组[(4.7±2.5)%、0.8±0.3、1.2±0.1、1.2±0.1、(2.7±0.2)μmol/g、(2.1±0.1)μg/L](P0.05),SOD和GSH水平明显低于假手术组;胆红素干预组细胞凋亡率、Bax、caspase-3、MDA和8-OHdG水平明显低于对照组,Bcl-2、SOD和GSH水平明显高于对照组(P0.05)。结论胆红素可降低缺血半暗带区域细胞凋亡率,其机制可能与上调Bcl-2、下调Bax和caspase-3表达,并提高脑组织抗氧化应激能力相关。     

衰老关键蛋白3对人结直肠癌SW480细胞增殖及转移的影响

目的探讨衰老关键蛋白3(fibulin 3,FBLN3)在人结直肠癌SW480细胞增殖及转移中的作用。方法人结直肠癌SW480细胞株分为空白组(培养液2mL)、空载组(FBLN3阴性慢病毒+培养液2mL)和FBLN3过表达组(FBLN3过表达慢病毒+培养液2 mL);采用MTT法观察FBLN3对SW480细胞增殖的影响;流式细胞技术检测FBLN3对SW480细胞周期的影响;Transwell实验观察FBLN3对SW480细胞侵袭、转移的影响;Western blot法检测FBLN3对相关蛋白表达的影响。结果 FBLN3过表达组转染后24h(0.386±0.008)、48h(0.535±0.011)、72h(0.467±0.012)吸光度值均低于空白组(0.460±0.011、0.787±0.009、1.031±0.005)和空载组(0.445±0.009、0.750±0.004、0.949±0.014)(P0.05),空白组与空载组比较差异无统计学意义(P0.05);转染48h后FBLN3过表达组G1期细胞比率[(65.02±1.05)%]高于空白组[(47.01±0.90)%]和空载组[(48.25±1.41)%],S期细胞比例[(15.41±1.70)%]低于空白组[(34.90±1.28)%]和空载组[(28.82±2.40)%](P0.05);转染48h后FBLN3过表达组侵袭细胞计数(47±5)和迁移细胞计数(64±10)均低于空白组(106±7、144±9)及空载组(105±12、145±6)(P0.05),空白组与空载组比较差异无统计学意义(P0.05);FBLN3过表达组p-AKT、p-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2、MMP-9、Bcl-2及细胞周期蛋白D1(cyclinD1)蛋白表达水平均低于空白组和空载组,凋亡诱导分子Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2associated X protein,Bax)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P21蛋白表达均高于空白组和空载组(P0.05)。结论 FBLN3过表达可抑制AKT/mTOR信号通路活化,抑制侵袭转移因子MMP-2、-9,凋亡抑制因子Bcl-2及细胞周期蛋白cyclinD1表达,促进凋亡诱导分子Bax和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P21蛋白的表达,导致肿瘤细胞周期G_1期阻滞,抑制SW480细胞的增殖、侵袭及转移,从而抑制结直肠癌发生、发展。     

电刺激对大鼠背根神经节细胞机械力损伤的保护作用

目的探讨电刺激对机械力损伤大鼠背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)细胞活性、凋亡、衰老的影响及机制。方法对数生长期SD大鼠DRG细胞随机分为空白对照组、机械力损伤组和电刺激治疗组,3组细胞均应用DMEM高糖培养基培养,机械力损伤组和电刺激治疗组细胞应用细胞应变培养板系统制备机械力损伤模型后,电刺激治疗组给予电刺激(100 mV/mm)1 h,机械力损伤组和空白对照组不作处理。电刺激1 h后,采用CCK-8法检测3组细胞活性,β-半乳糖苷酶染色法检测衰老细胞率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot法检测caspase-3蛋白表达。结果机械力损伤组、电刺激治疗组细胞活性吸光度(optical density, OD)值(0.969±0.004、1.278±0.001)低于空白对照组(1.429±0.005),细胞凋亡率[(25.887±2.669)%、(15.183±1.114)%]高于空白对照组[(7.053±3.613)%](P0.05),电刺激治疗组细胞活性OD值高于机械力损伤组,细胞凋亡率低于机械力损伤组(P0.05);机械力损伤组、电刺激治疗组和空白对照组衰老细胞率[(30.213±23.597)%、(10.140±1.369)%、(4.223±1.953)%]依次降低(P0.05);机械力损伤组、空白对照组和电刺激治疗组caspase-3蛋白相对表达量(0.459±0.001、0.262±0.003、0.163±0.001)依次降低(P0.05)。结论电刺激可增强机械力损伤诱导的DRG细胞活性,减少细胞凋亡、细胞衰老,其机制可能与抑制凋亡相关蛋白caspase-3表达有关。     

薯蓣皂苷元对三阴乳腺癌细胞系HCC1937增殖及凋亡的影响

目的探讨薯蓣皂苷元对人三阴乳腺癌细胞系HCC1937增殖及凋亡的影响。方法对数生长期人三阴乳腺癌HCC1937细胞株分为空白组(培养液)、实验1组(培养液+10mg/L薯蓣皂苷元)、实验2组(培养液+25mg/L薯蓣皂苷元)。采用MTT法观察薯蓣皂苷元培养24、48、72h时HCC1937细胞生长抑制率;流式细胞仪检测薯蓣皂苷元培养48h时HCC1937细胞周期及细胞凋亡;Western blot法检测薯蓣皂苷元培养48h时Bcl-2、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2associated X protein,Bax)、P53、caspase3蛋白表达;Transwell实验观察薯蓣皂苷元培养24h时HCC1937细胞侵袭能力。结果薯蓣皂苷元培养24、48、72h,HCC1937细胞生长抑制率在实验1组分别为(6.86±2.56)%、(15.57±1.86)%、(14.84±4.64)%,在实验2组分别为(11.78±2.16)%、(24.48±3.70)%、(31.38±3.76)%,均高于空白组[(3.34±2.56)%、(8.47±1.86)%、(7.73±4.64)%](P0.05),且实验2组高于实验1组(P0.05);薯蓣皂苷元培养48h,实验1组G_1期细胞比例、细胞凋亡率分别为(36.21±3.12)%、(21.99±2.36)%,实验2组分别为(50.26±2.36)%、(26.17±3.46)%,均高于空白组[(28.35±2.54)%、(17.25±1.23)%](P0.05),实验2组高于实验1组(P0.05);薯蓣皂苷元培养24h,实验1组、实验2组HCC1937侵袭细胞数目[(64.00±11.01)%、(30.33±6.11)%]低于空白组[(146.00±9.16)%](P0.05),实验2组低于实验1组(P0.05);薯蓣皂苷元培养48h时,实验1组、实验2组HCC1937细胞Bcl-2表达量低于空白组,Bax、caspase3表达量高于空白组(P0.05),实验1组Bcl-2表达量低于实验2组,Bax、caspase3表达量高于实验2组(P0.05),3组P53蛋白表达量比较差异无统计学意义(P0.05)。结论薯蓣皂苷元可抑制人三阴乳腺癌细胞系HCC1937增殖与侵袭,可能机制为使肿瘤细胞G_1期阻滞,下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达,上调促凋亡蛋白Bax、caspase3表达。     

调强放射治疗对鼠骨包虫生发细胞周期及caspase-9的影响

目的探讨三维适形调强放疗(intensity-modulated radiation therapy, IMRT)的放射线对鼠骨包虫生发细胞的细胞周期及凋亡因子caspase-9的影响。方法骨包虫病子午沙鼠20只,将鼠骨包虫内囊中的生发细胞分离并进行体外培养,将体外培养成功的骨包虫生发细胞分为IMRT组和对照组。IMRT组给予总剂量为40 Gy的IMRT放疗,对照组给予假照射。放疗结束24 h后,采用流式细胞仪检测2组骨包虫生发细胞的细胞周期,采用ELISA法检测骨包虫生发细胞中凋亡相关蛋白caspase-9蛋白水平,采用实时荧光定量PCR法检测骨包虫生发细胞caspase-9 mRNA相对表达量。结果放疗结束24 h后,IMRT组骨包虫生发细胞S期细胞比率[(65.65±7.46)%]明显高于对照组[(32.49±4.23)%],G_0/G_1期[(32.37±4.94)%]和G_2/M期[(1.98±0.19)%]细胞比率明显低于对照组[(53.95±4.55)%、(13.55±2.48)%](P0.05)。IMRT组生发细胞caspase-9蛋白水平[(0.071±0.012)pmol/L]和caspase-9 mRNA相对表达量(30.21±6.99)明显高于对照组[(0.011±0.004)pmol/L、12.17±3.01](P0.05)。结论 IMRT可改变鼠骨包虫生发细胞的细胞周期,抑制生发细胞的增殖,可能是通过调节凋亡相关蛋白caspase-9水平而实现。     

碳酸酐酶Ⅸ抑制剂对乳腺癌细胞在低氧环境下的生长抑制作用及其机制

目的探讨碳酸酐酶Ⅸ(carbonic anhydraseⅨ, CAⅨ)抑制剂对人乳腺癌MCF-7细胞在低氧环境中的增殖抑制作用和机制。方法人乳腺癌MCF-7细胞培养24 h后,采用实时定量PCR法检测细胞在1%低氧和21%正常氧气环境下CAⅨmRNA相对表达量;将对数生长期人乳腺癌MCF-7细胞分为25、50、100μmol/L U-104组(分别加入含25、50、100μmol/L U-104的细胞培养液进行处理)和对照组(加入等量细胞培养液),低氧环境下培养48 h后,采用MTT法检测各组人乳腺癌MCF-7细胞的存活率,采用AnnexinV/PI双染流式细胞术检测对照组和100μmol/L U-104组细胞凋亡率;培养24 h后,采用Western blot法检测对照组和50、100μmol/L U-104组凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白相对表达量。结果培养24 h后,MCF-7细胞1%低氧环境中CAⅨmRNA相对表达量(23.93±4.02)高于21%正常氧环境(1.00±0.00)(P0.05);培养48 h后,对照组及25、50、100μmol/L U-104组细胞存活率[100%、(57.30±5.06)%、(28.84±3.52)%、(9.63±2.58)%]依次降低(P0.05),100μmol/L U-104组细胞凋亡率[(89.46±3.05)%]高于对照组[(6.54±0.92)%](P0.05);培养24 h后,对照组及50、100μmol/L U-104组细胞Bcl-2蛋白相对表达量(0.576±0.040、0.253±0.030、0.103±0.020)依次降低(P0.05),Bax蛋白(0.103±0.020、0.216±0.020、0.413±0.030)和caspase-3蛋白(0.216±0.020、0.373±0.010、0.540±0.020)相对表达量依次增高(P0.05)。结论 CAⅨ抑制剂U-104在低氧条件下对乳腺癌MCF-7细胞有明显增殖抑制作用,其机制可能是U-104抑制了CAⅨ在低氧状态下的活性,激活Bax、caspase-3和抑制Bcl-2,从而诱导乳腺癌细胞的凋亡。     

RNA干扰沉默survivin基因对食管癌Eca-109细胞放射敏感性的影响

目的探讨RNA干扰沉默survivin基因对食管癌Eca-109细胞放射敏感性的影响。方法构建靶向survivin基因特定序列的小干扰RNA(small interfering,siRNA)真核表达干扰质粒pRNAT-siRNA-survivin转染食管癌Eca-109细胞为干扰组,构建阴性对照质粒pRNAT-siRNA-control转染Eca-109细胞为阴性对照组,未转染的Eca-109细胞为空白对照组,3组采用Western blot检测survivin蛋白表达水平。取对数生长期干扰组Eca-109/si-survivin细胞和空白对照组Eca-109细胞,在直线加速器下分别给予6Gy的X线照射,分别为干扰+X线照射组和单纯X线照射组(X线照射组),采用流式细胞术检测各组细胞凋亡指数,采用MTT法分析细胞存活分数。结果干扰组细胞survivin蛋白表达水平(18.75±3.12)较阴性对照组(44.17±3.15)和空白对照组(46.20±2.62)明显下调(P0.05);干扰+X线照射组细胞凋亡指数[(29.56±0.74)%]明显高于空白对照组[(4.35±0.15)%]、阴性对照组[(4.32±0.32)%]、干扰组[(9.24±0.35)%]和X线照射组[(22.17±0.75)%],差异均有统计学意义(P0.05),干扰组和X线照射组明显高于空白对照组和阴性对照组(P0.05);干扰+X线照射组细胞存活分数[(19.54±1.12)%]明显低于空白对照组[(95.35±1.40)%]、阴性对照组[(93.45±1.38)%]、干扰组[(70.96±0.85)%]和X线照射组[(35.84±0.52)%](P0.05),干扰组和X线照射组明显低于空白对照组和阴性对照组(P0.05)。结论靶向survivin的siRNA能特异性沉默survivin基因表达,诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖,进而增强人食管癌Eca-109细胞的放射敏感性。     

别欧前胡素诱导急性髓系HL-60细胞凋亡机制研究

目的探讨别欧前胡素诱导急性髓系白血病HL-60细胞凋亡的机制。方法对数生长期HL-60细胞随机分为对照组(普通培养液)、10mg/L别欧前胡素组(10mg/L别欧前胡素+培养液)、30mg/L别欧前胡素组(30mg/L别欧前胡素+培养液)、50mg/L别欧前胡素组(50mg/L别欧前胡素+培养液),培养48h时行锥虫蓝染色检测4组HL-60细胞增殖抑制率,应用流式细胞仪检测细胞周期,采用实时荧光定量PCR法检测B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2associated X protein,Bax)mRNA相对表达量,采用Western blot法检测Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-8蛋白相对表达量。结果培养48h,对照组及10、30、50mg/L别欧前胡素组细胞增殖抑制率[(1.53±0.18)%、(15.20±0.10)%、(32.80±0.10)%、(72.20±0.06)%]逐渐增加(P0.05);对照组及10、30、50mg/L别欧前胡素组G1期细胞比率[(40.26±3.80)%、(41.91±5.60)%、(48.79±9.70)%、(60.42±6.30)%]逐渐增加(P0.05),S期细胞比率[(34.38±7.20)%、(33.89±8.60)%、(27.86±5.30)%、(23.42±6.70)%]、G2/M期细胞比率[(21.36±7.80)%、(20.23±5.80)%、(19.35±6.90)%、(16.16±9.80)%]逐渐降低(P0.05);对照组及10、30、50mg/L别欧前胡素组Bcl-2mRNA相对表达量(1.00±0.06、0.82±0.03、0.53±0.02、0.24±0.01)、Bcl-2蛋白相对表达量(1.13±0.04、1.09±0.10、0.85±0.04、0.55±0.10)逐渐降低(P0.05),Bax mRNA相对表达量(1.00±0.08、1.20±0.07、1.45±0.03、1.64±0.04)、Bax蛋白相对表达量(0.88±0.11、1.07±0.06、1.11±0.02、1.29±0.04)、cleaved-caspase-8蛋白相对表达量(1.23±0.05、1.32±0.04、1.56±0.06、1.93±0.06)逐渐增加(P0.05)。结论别欧前胡素可抑制急性髓系白血病HL-60细胞增殖,阻滞细胞于G1期,通过外源性和内源性途径诱导HL-60细胞凋亡,且呈剂量依赖性。     

NGAL对大鼠肾脏缺血再灌注损伤作用机制的体内研究

目的:观察中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatisase-associated lipocalin,NGAL)对大鼠缺血再灌注肾损伤(I/R)的作用机制。方法:通过切除一侧肾脏,夹闭对侧肾蒂45min的方法来建立大鼠I/R模型。雄性SD大鼠随机分为对照组、I/R组、缺血再灌注给药组(NGAL组),对照组、I/R组、NGAL组实验结束时分别用HE染色观察3组动物肾组织病理变化;再灌注24h后测血肌酐(Scr)和尿素氮(Bun),TUNEL观察肾小管上皮细胞凋亡情况,免疫组化检测Bax与激活的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved caspase-3,CC3)的表达;Western Blot技术检测凋亡蛋白Fas、Bcl-2表达的变化。结果:与I/R组比较,NGAL组Scr、Bun分别为(63.400±11.908vs121.857±17.151)μmol/L、(14.840±2.868vs28.557±6.434)mmol/L,肾小管上皮细胞凋亡数量减少(7.800±1.924vs15.400±3.049);NGAL组肾组织Fas mRNA(2.34±0.51vs6.84±2.34)表达降低、Bax蛋白[(7.440±1.640)%vs(15.456±1.955)%]表达降低、CC3蛋白[(3.171±0.321)%vs(7.291±1.059)%]表达降低、Bcl-2蛋白(6.91±1.64vs5.30±1.48)表达升高(P<0.05)。结论:NGAL对大鼠I/R的肾小管上皮细胞有保护作用,其作用与减少细胞凋亡、改变凋亡蛋白的表达,从而减轻组织损伤,发挥肾脏保护作用有关。     

CLIC4在饥饿诱导神经胶质瘤细胞自噬中的作用

目的通过饥饿诱导人神经胶质瘤细胞发生自噬,利用siRNA技术部分沉默细胞内氯通道蛋白4(CLIC4),探讨CLIC4在细胞自噬中的作用。方法根据CLIC4的基因序列构建CLIC4siRNA质粒,建立稳定转染CLIC4siRNA的U251细胞株,分析CLIC4蛋白表达;MTT法检测转染pSH1Si-CLIC4对细胞生存率的影响;利用Western Blot检测转染CLIC4siRNA在U251细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达;检测饥饿条件下U251细胞LC3蛋白、Bax、Bcl-2的表达;检测抑制CLIC4表达对于饥饿条件下细胞白caspase-3和胞浆cytc以及LC3的表达。结果 Western Blot显示,与空质粒对照组相比,转染CLIC4siRNA的U251细胞CLIC4表达显著下降;与对照组相比,转染空质粒细胞组以及瞬时转染pSH1Si-CLIC4载体细胞组U251细胞生存率均无明显差异;单纯CLIC4siRNA对于U251细胞Bax、Bcl-2表达无影响;与对照组相比,饥饿8h能够诱导U251细胞自噬,LC3水平显著增加,而细胞Bax、Bcl-2表达无明显变化;转染CLIC4siRNA后饥饿8h,caspase-3、cytc以及LC3表达增加。结论单纯CLIC4siRNA对于U251细胞自噬和凋亡均无显著影响,饥饿条件下U251细胞发生自噬的同时并没有明显细胞凋亡过程,抑制CLIC4表达促进了饥饿条件下的U251细胞自噬,同时能够启动线粒体相关途径的细胞凋亡。     

miR-326靶向MAPK/MEK信号通路抑制食管鳞状细胞癌恶性生物学行为

目的探讨miR-326靶向MAPK/MEK信号通路对食管鳞状细胞癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。方法 20例食管鳞状细胞癌患者,取手术切除食管癌组织和癌旁正常组织,采用实时荧光定量PCR法检测miR-326mRNA和MAPK mRNA相对表达量,采用免疫组织化学法检测MAPK蛋白表达。3种食管癌细胞系(KYSE150、EC9706、TE-9)和人正常食管上皮细胞系Het-1A,采用实时荧光定量PCR法检测细胞miR-326 mRNA和MAPK mRNA相对表达量,Western blot法检测细胞MAPK蛋白相对表达量。将对数生长期EC9706细胞随机分为miR-326组、转染对照组和空白对照组,miR-326组和转染对照组分别转染miR-326 mimic和mimic NC,空白对照组细胞不作任何处理,采用Western blot法检测细胞MAPK、p-MEK、p-ERK1、p-ERK2和p-C-Jun蛋白相对表达量,克隆形成试验检测细胞克隆形成率,划痕试验检测细胞划痕闭合率,Transwell小室试验检测细胞侵袭,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,荧光素酶活性检测试剂盒检测细胞荧光素酶活性。结果食管癌组织miR-326 mRNA相对表达量低于癌旁正常组织(P0.05),MAPK mRNA相对表达量高于癌旁正常组织(P0.05)。KYSE150、EC9706和TE-9细胞miR-326 mRNA相对表达量均低于Het-1A细胞(P0.05),MAPK mRNA和MAPK蛋白相对表达量高于Het-1A细胞(P0.05),且EC9706细胞MAPK蛋白相对表达量最高。miR-326组细胞MAPK 3'UTR WT荧光素酶活性(0.53±0.05)明显低于转染对照组(1.22±0.14)(P0.05),MAPK 3'UTR MUT荧光素酶活性(0.86±0.06)与转染对照组(0.91±0.11)比较差异无统计学意义(P0.05)。miR-326组细胞MAPK蛋白相对表达量(0.32±0.15)低于转染对照组(0.88±0.07)和空白对照组(0.91±0.06)(P0.05),细胞克隆形成率[(21.30±0.55)%]、划痕闭合率[(29.47±4.12)%]和侵袭细胞数[(113.86±3.15)个]低于转染对照组[(75.43±0.81)%、(80.52±2.51)%、(427.27±4.25)个]和空白对照组[(79.13±0.65)%、(83.44±1.87)%、(468.10±3.38)个](P0.05),G_0/G_1期细胞比率[(63.15±1.20)%]和细胞凋亡率[(18.54±0.60)%]高于转染对照组[(41.18±0.60)%、(5.28±1.30)%]和空白对照组[(45.11±0.80)%、(4.13±0.90)%],S期和G_2/M期细胞比率及p-MEK、p-ERK1、p-ERK2和p-C-Jun蛋白相对表达量低于转染对照组和空白对照组(P0.05),转染对照组与空白对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论 miR-326靶向抑制MAPK/MEK信号通路的激活,影响食管鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡。