pH响应性PTEN/PLGA-(HE)10-MAP纳米粒的构建及体外评价

构建一种pH响应性细胞穿膜肽（cell-penetrating peptides,CPPs）修饰的载抑癌基因第10号染色体同源缺失性磷酸酯酶-张力蛋白（PTEN）质粒DNA的纳米粒PTEN/PLGA-（HE）₁₀-MAP,探讨其基因递送和体外靶向抗肿瘤作用。采用双乳化-溶剂挥发法制备载PTEN质粒DNA的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米粒PTEN/PLGA;利用酰胺缩合反应将pH响应性组氨酸-谷氨酸（HE）重复寡肽与模型两亲性多肽（MAP）的重组体（HE）₁₀-MAP偶联至PLGA纳米粒表面,得到纳米粒PTEN/PLGA-（HE）₁₀-MAP。以粒径、Zeta电位以及包封率与载药量为指标对其进行表征分析;通过考察其细胞毒性、细胞摄取,以及靶向转染真核表达质粒和抗肿瘤细胞增殖的能力,分析其作为目的基因靶向递送系统的可行性。结果显示,制备的纳米粒粒径为（266.5 ± 2.86） nm,包封率为（80.6 ± 6.11）%,在pH 7.4、7.0和6.5条件下Zeta电位分别为-（6.7 ± 0.26） mV、 +（0.7 ± 0.22） mV和+（37.5 ± 0.85） mV;未载质粒DNA的空载体纳米粒PLGA-（HE）₁₀-MAP在肿瘤和正常细胞中的细胞毒性试验显示细胞存活率均在80%以上,制备的纳米粒可以被细胞摄取表达,且具有pH靶向抑制肿瘤细胞增殖的作用,在肿瘤的基因治疗中具有一定的应用前景。     

基于点击化学修饰的肿瘤靶向阿霉素脂质体的制备与表征

首先合成了叠氮化的胆固醇和炔基化的奥曲肽,并基于叠氮化的胆固醇制备了叠氮修饰的阿霉素脂质体Dox@N₃-L;随后利用点击反应在其表面修饰了具有肿瘤靶向功能的奥曲肽,得到奥曲肽靶向阿霉素脂质体Dox@Oct-L;最后考察了点击反应的进程、点击修饰对药物包封率的影响以及脂质体的体外靶向性。结果表明,通过点击反应能成功将奥曲肽修饰到载药载体表面,点击修饰对脂质体中荷载的药物没有影响,包封率为99.8%,与点击前无显著差异。细胞毒性实验结果显示,Dox@Oct-L对肿瘤细胞HepG2的杀伤作用强于Dox@N₃-L,表明Dox@Oct-L对HepG2细胞具有一定的靶向性。因此,利用点击化学在荷载药物的载体表面修饰是一种温和有效的方式,可方便地实现载药载体表面的功能化。     

叶酸修饰水飞蓟宾固体脂质纳米粒的制备及其对A549细胞抑制作用研究

目的 制备一种通过叶酸受体途径作用于肿瘤细胞的叶酸修饰水飞蓟宾固体脂质纳米粒（FA-SIL-SLN）,考察FA-SIL-SLN对A549细胞抑制作用。方法 酰化反应合成膜材（FA-PEG₃₃₅₀-DSPE）,采用乳化-超声分散法制备FA-SIL-SLN,并研究其理化性质。MTT法测定FA-SIL-SLN对A549细胞的抑制率;流式细胞分析仪分析其对细胞周期的影响。结果 合成了膜材FA-PEG₃₃₅₀-DSPE;制备的FA-SIL-SLN外观圆整、平均粒径为（103±21）nm,包封率为（90.73±0.33）%、载药量为（2.13±0.17）%,体外释药实验表明其具有良好的缓释特性;对A549细胞的抑制作用呈现明显的量效和时效关系;阻滞细胞增殖。结论 本实验为叶酸介导的抗肿瘤给药系统研究提供了依据。     

胆酸修饰的联苯双酯脂质体体外肝实质细胞摄取特性

用胆酸修饰联苯双酯脂质体,以期通过受体配体特异性的结合,增加药物在肝实质细胞的蓄积。本研究采用薄膜超声法制备联苯双酯脂质体(LP-DDB)和胆酸修饰联苯双酯脂质体(BP₂B-LP-DDB),采用葡聚糖凝胶法测定包封率,比较LP-DDB和BP₂B-LP-DDB的理化性质差异;分离培养肝实质细胞,研究孵化温度、给药剂量等对肝实质细胞体外摄取上述两种脂质体的影响。BP₂B的修饰对脂质体的包封率、粒径、多分散指数和Zeta电位均无显著性影响。LP-DDB和BP₂B-LP-DDB中药物平均包封率分别为(90.66±1.22)%和(86.89±1.61)%,平均粒径分别为(309.52±16.74)和(273.77±14.14)nm,Zeta电位分别为(24.98±2.03)和(22.21±7.03)mV。与LP-DDB相比,BP₂B-LP-DDB与肝实质细胞的结合及摄取均显著增加,具有明显的主动转运特征。胆酸修饰的脂质体可作为肝实质细胞靶向的载体,可以通过受体介导的方式促进药物向肝实质细胞内的传递。     

胆甾醇修饰的PEG-P[Asp(DET)]/miRNA复合物的制备、理化性能及细胞摄取能力

目的 制备疏水基修饰的聚阳离子高分子基因载体PEG-P[Asp（DET）]-10%胆甾醇,对其复合miRNA的理化性质和细胞摄取能力进行研究。方法 开环聚合合成PEG-P[Asp（DET）],再采用氯甲酸胆甾醇基进行疏水修饰,核磁共振法验证其结构;使其与hsa-miR-15a形成胶束复合物,对该胶束复合物的粒径、Zeta电位、稳定性、包封率以及细胞毒性进行考察;以白血病细胞K562细胞系为模型细胞进行体外细胞实验对其摄取进行考察。结果 合成的PEG-P[Asp（DET）]-10%胆甾醇具有良好的溶解性,可与miRNA形成稳定的胶束复合物,当氮磷比（N/P）=20,基因浓度在5 μmol/mL时,形成的胶束复合物粒径为（192.4±10.8）nm,Zeta电位为（6.9±0.9）mV,包封率为（90.5±3.2）%。该复合物在实验条件下表现出了相当的稳定性,细胞对该复合物的摄取能力明显强于商品化试剂脂质体lipo2000。结论 PEG-P[Asp（DET）]-10%胆甾醇是一种优良的高分子基因传递系统载体,在体外实验中可有效实现细胞对于miRNA 的稳定摄取。     

叶酸-脂质体制备及对HeLa细胞靶向作用

目的　研制一种能通过叶酸受体途径靶向肿瘤细胞的叶酸脂质体。方法　将叶酸（Ｆ）、聚乙二醇二胺（ＮＨ２ＰＥＧＮＨ２）、琥珀酸酐（ＳＵＣ）和卵黄磷脂酰乙醇胺（ＥＰＥ）按序共价连接,并与胆固醇（ｃｈｏｌ）、卵黄磷脂酰胆碱（ＥＰＣ）以１０∶４０∶５６配比,用成膜水化结合冷冻熔融超声法制备内含钙黄绿素叶酸脂质体,以负染色电镜法确定其粒径;用荧光显微镜观察ＨｅＬａ细胞摄取叶酸脂质体与脂质体的差异;以荧光定量法确定浓度、时间、游离Ｆ、磷脂酶Ｄ（ＰＬＤ）和磷脂酰肌醇特异磷脂酶Ｃ（ＰＩＰＬＣ）对ＨｅＬａ细胞摄取叶酸脂质体影响程度。结果　（１）ＦＰＥＧＳＵＣＥＰＥ连接物为色谱纯;叶酸脂质体平均粒径为２００ｎｍ。（２）叶酸脂质体进入ＨｅＬａ细胞质内量明显高于脂质体。（３）浓度增大、时间延长,叶酸脂质体摄取量递增幅度明显减缓;ＨｅＬａ细胞摄取叶酸脂质体量均在脂质体的４倍以上。（４）５０μｍｏｌ／Ｌ游离Ｆ可使叶酸脂质体摄取量降低５０％;ＰＩＰＬＣ（０．２Ｕ／ｍｌ）和ＰＬＤ（０．５ｍｇ／ｍｌ）处理后,叶酸脂质体摄取量分别降低７１％和７０％。结论　２００ｎｍ粒径的叶酸脂质体能通过细胞膜上Ｆ受体介导内吞     

PEG修饰的紫草素纳米结构脂质载体的制备和体外评价

[目的] 制备一种有长循环效果的聚乙二醇（PEG）修饰的紫草素纳米结构脂质载体,并对其进行理化表征和体外抗肿瘤效果评价。[方法] 采用乳化蒸发-低温固化法制备紫草素纳米结构脂质载体,通过超速离心法检测包封率;通过粒径、多分散指数（PDI）、Zeta电位、透射电镜、差示扫描量热、X射线等对制剂进行表征。采用CCK-8法考察乳腺癌MCF-7细胞的活性,以香豆素-6和Hoechst 33342为荧光探针定量考察细胞摄取行为。[结果] PEG修饰的紫草素纳米结构脂质载体粒径为（19.68±1.25）nm,多分散指数为（0.28±0.68）,Zeta电位为[-（20.27±1.27）]mV。平均包封率为98%,制剂外观圆整,分布均匀。紫草素以无定型物包载于制剂中。紫草素的抗肿瘤作用呈现浓度依赖性,中、高剂量的PEG修饰制剂组抗肿瘤活性明显高于未修饰制剂组和溶液组。细胞摄取实验结果与细胞毒性实验结果一致。[结论] 实验制备的PEG修饰的紫草素纳米结构脂质载体包封率较高,粒径小,体系稳定,具有良好的体外抗肿瘤和细胞摄取效果。     

叶酸—脂质体制备及对HeLa细胞靶向作用

目的 研制一种能通过叶酸受体途径靶向肿瘤细胞的叶酸－脂质体。方法 将叶酸（Ｆ）、聚乙二醇二胺（ＮＨ２－ＰＥＧ－ＮＨ２）、琥珀酸酐（ＳＵＣ）和卵黄磷脂酰乙醇胺（ＥＰＥ）按序共价连接,并与胆固醇、卵黄磷脂酰胆碱（ＥＰＣ）以１０：４０：５６配比,用成膜－水化结合冷冻－熔融超声法制备内含钙黄绿素叶酸－脂质体,以负染色－电法确定其粒径;用荧光显微镜观察ＨｅＬａ细胞摄取叶酸－脂质体与脂质体的差异;以荧光定量法     

Angiopep-2修饰脂质体的构建及其脑靶向性研究

目的 构建Angiopep-2修饰脂质体,并对其理化性质和跨血脑屏障能力进行评价。方法 采用薄膜分散法制备Angiopep-2修饰脂质体（AP-LP）,研究其理化特征。原代培养脑毛细血管内皮细胞（BCEC）,通过定量细胞摄取实验研究BCEC对AP-LP脂质体的摄取率。复制体外模型,观察不同修饰的AP-LP穿过血脑屏障的能力。结果 制备的AP-LP粒径为（125.0±15.5）nm,Zeta电位为（8.35±3.64）mV。BCEC对AP-LP脂质体的摄取率是普通脂质体的4.1倍,差异有统计学意义（P?<0.05）;AP-LP的透过血脑屏障能力是普通脂质体的3.6倍,两者比较差异有统计学意义（P?<0.05）。结论 AP-LP制备方法简便易行,Angiopep-2修饰脂质体后,脂质体的血脑屏障穿透力增加,靶向性增加,是一种潜在高效的脑部靶向给药系统。     

叶酸修饰蟾毒灵阳离子脂质体的制备及体外评价

目的 制备叶酸修饰蟾毒灵阳离子脂质体（FA-BF-CLs）,并对其进行质量评价及抗肝癌研究。方法 采用薄膜-超声分散法制备FA-BF-CLs,以粒径、Zeta电位及包封率等为指标,采用单因素和Box-Behnken响应面分析法对处方及工艺进行优化。透射电镜观察脂质体显微形态,并考察其体外释放过程、溶血性及空白阳离子脂质体体外细胞安全性。采用CCK-8法比较FA-BFCLs、BF-CLs（未加叶酸修饰的蟾毒灵阳离子脂质体）及BF-solution（蟾毒灵溶液）的体外细胞毒性。结果 最佳条件为磷脂与药物质量比14.17∶1、磷脂与胆固醇质量比3.8∶1、超声时间13 min,制备得到脂质体粒径（135.5±1.40） nm,多分散系数0.192±0.025,Zeta电位（16.23±0.46） m V,包封率69.42%±2.18%。体外释放研究表明,FA-BF-CLs具有明显的缓释效果,溶血试验结果显示该载体材料无溶血现象。体外细胞安全性结果显示阳离子脂质体浓度在0～20μmol/L范围内安全无毒。体外细胞毒性表明FA-BF-CLs对HepG2肝癌细胞的抑制作用大于BF-CLs和BF-s...     

海藻酸钠包覆的降钙素脂质体的制备和体内外黏附性质

制备海藻酸钠包覆的脂质体,并对其黏膜黏附性质进行研究。采用薄膜水化法制备了包封率为(86.2±2.3)%的带正电荷的降钙素脂质体,并用不同黏度的海藻酸钠对脂质体进行包覆,包覆后的脂质体实现了电荷反转。通过黏蛋白-颗粒结合法、组织匀浆法和激光共聚焦显微镜法分别对海藻酸钠包覆脂质体的体内外黏附性质进行研究,黏蛋白-颗粒结合法研究结果表明：海藻酸钠可以与黏蛋白颗粒结合使其电位发生变化,组织匀浆法研究结果表明：海藻酸钠包覆脂质体能够增加肠道中荧光标记物的含量,并且随着海藻酸钠黏度的增加,肠道中荧光标记物的含量增大。激光共聚焦显微镜法研究表明：高黏度的海藻酸钠包覆脂质体与未包覆脂质体相比表现出了更强的荧光强度,海藻酸钠包覆脂质体与未包覆脂质体相比具有良好的黏膜黏附特性,且这一特性随着海藻酸钠黏度的增加而增大。     

透明质酸修饰的绿原酸脂质体的制备及细胞学研究

目的 制备透明质酸(HA)靶向绿原酸(CA)脂质体,探讨其对HA受体(CD44)高表达A549细胞及低表达HepG2细胞的增殖抑制作用.方法 合成HA-二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE);通过薄膜分散法制备HA-CA脂质体并用动态光散射粒径分析仪测定粒径;采用高效液相色谱法(HPLC)建立CA体外水平测定方法并测定HA-CA脂质体的包封率;采用噻唑蓝(MTT)法检测游离CA、CA脂质体及HA-CA脂质体对A549细胞和HepG2细胞的增殖抑制作用;采用荧光细胞摄取实验验证HA脂质体的靶向性.结果 HA-CA的平均粒径为219.20 nm,多分散系数(PDI) =0.16;包封率为(85.36±1.01)％;HA-CA脂质体对A549细胞的增殖抑制作用明显大于CA脂质体,且CA脂质体大于游离CA;CA脂质体和HA-CA脂质体对HepG2细胞的增殖抑制作用则基本相当,均大于游离CA;A549细胞对载6-香豆素HA脂质体(HA-C脂质体)的摄取高于HepG2细胞.结论 HA-CA脂质体能与高表达的HA受体细胞特异性结合,达到肿瘤细胞主动靶向效果.     

Targeted MR Imaging Adopting T1-Weighted Ultra-Small Iron Oxide Nanoparticles for Early Hepatocellular Carcinoma: An in vitro and in vivo Study

ObjectiveThe purpose of this study was to produce an arginylglycylaspartic acid (RGD) peptide-modified ultra-small superparamagnetic iron oxide (Fe₃O₄) nanoparticles (NPs) for targeted magnetic resonance (MR) imaging of hepatocellular carcinoma (HCC) cells and verify its utility as a T1 positive MRI imaging contrast agent in vitro and in vivo.MethodsThe carboxylated Fe₃O₄ NPs stabilized with sodium citrate were conjugated with polyethylene glycol (PEG)-linked RGD nanoparticles to form a novel target contrast agent Fe₃O₄-PEG-RGD NPs. The specificity of Fe₃O₄-PEG-RGD to bind RGD receptor was investigated in vitro by HepG2 cellular uptake and cell MR imaging, and in vivo by MR imaging of subcutaneous HepG2 tumors of nude mice.ResultsThe formed Fe₃O₄-PEG-RGD NPs displayed good biocompatibility, and the ultrahigh r1 relaxivity was 1.37 mM⁻¹S⁻¹. The synthesized Fe₃O₄-PEG-RGD NPs were demonstrated spherical-like with an approximate diameter of 2.7 nm in similar size. The targeting effect to HepG2 cells was confirmed by in vitro cellular uptake and cell MR imaging. The in vivo MR imaging of nude mice demonstrated that the MR signal intensity enhancement of HepG2 tumor in Fe₃O₄-PEG-RGD NPs treated mice was significantly higher than in mice treated with non-targeted Fe₃O₄-mPEG NPs at the same post-administration time point.ConclusionThe results indicate that the Fe₃O₄-PEG-RGD particles have potential utility as T1 positive contrast agent in targeted MR imaging.     

CD11c免疫脂质体的制备及其体外树突状细胞靶向性

目的制备CD11c单抗修饰的免疫脂质体并进行表征,验证其体外对树突状细胞(dendritic cells,DCs)的特异靶向性。方法采用薄膜分散法制备脂质体,通过化学交联法将CD11c单抗连接于脂质体上,利用高效液相法测定CD11c与脂质体的连接率,透射电镜观察脂质体形态,激光粒度测定仪测定粒径和Zeta电势,流式细胞仪检测脂质体上连接CD11c的活性和对DCs的靶向效果,激光共聚焦显微镜观察该免疫脂质体特异性靶向特点。结果成功制备了CD11c免疫脂质体,测得单抗连接率为(77.6±3.2)%,平均粒径为(151.2±1.6)nm,Zeta电位为(-32.0±1.8)mV。电镜下脂质体粒径均匀,表面光滑,多为圆形,少许椭圆形,无粘连。CD11c单抗连接于脂质体仍保持了良好的活性,体外表现出显著的DCs特异靶向性。结论制备的CD11c免疫脂质体对DCs细胞具有特异靶向性。     

PEG可脱除材料修饰miRNA纳米粒的制备以及体内外性质的考察

制备PEG可脱除材料修饰miRNA纳米粒,考察其细胞摄取以及体内分布情况。采用酰胺键缩合的方法合成可被β-环糊精包合的金刚烷修饰的PEG材料,通过静电作用与miR-34a复合制得纳米粒,加入与β-环糊精亲和力更高的布洛芬后可置换脱除纳米粒的PEG壳,测定该PEG可脱除纳米粒的粒径和Zeta电位;考察其在4T1细胞上的摄取能力以及在荷有4T1细胞的BALB/c小鼠体内的分布情况。结果显示,可被β-环糊精包合的金刚烷修饰的PEG材料合成成功;通过静电作用与miR-34a复合后制得的PEG可脱除纳米粒,粒径为107.7 nm,Zeta电位为15.8 mV;相比于PEG未脱除的纳米粒,被4T1细胞摄取的能力与在小鼠体内肿瘤部位的浓度都有显著提高,该体系在肿瘤治疗领域的应用具有很大的潜力。     

丹酚酸B脂质体的制备及其体外释药的研究

目的 研究丹酚酸B脂质体的制备方法及其体外释放情况。方法 采用逆向蒸发法制备丹酚酸B脂质体,超滤离心法测其包封率,以包封率和粒径为指标,采用正交试验设计法优化处方,并对其表面特征、包封率、粒径、体外释放情况进行考察。结果 制备的丹酚酸B脂质的体平均粒径为109.8 nm,药物的平均包封率为71.0%,体外12 h累积释放率为43.7%。脂质体外观圆整而均匀,分散性好。结论 制备的丹酚酸B脂质体包封率较高,粒径小,有良好的缓释作用,为后期研究其长循环心靶向脂质体奠定了基础。