促卵泡刺激素干预改善绵羊卵巢组织玻璃化冻存后异种移植的效果研究

背景:卵巢皮质片移植是无血管吻合移植,因此,提高卵巢组织对冻存-解冻和移植后缺血的耐受力是提高冻存后移植物卵泡存活和延长功能寿命的关键环节.目的:观察促卵泡刺激素在玻璃化冻存过程中对绵羊卵巢组织形态和功能的保存效果,为成人卵巢组织的冻存提供技术方法.方法:BALB/c品系雌性裸鼠随机分为3组.均行羊卵巢皮质片裸鼠异位移植:①新鲜移植对照组,取材后即移植.②玻璃化冻存移植组,采用玻璃化冻存解冻后移植,所用液体均未添加促卵泡刺激素.③添加促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组,采用冷冻液、解冻液和培养液均添加促卵泡刺激素的玻璃化冻存后移植.移植后检测受体鼠动情周期恢复率、恢复时间、卵泡数和发育状况,于移植后4周取移植卵巢进行组织学观察、并行血清雌二醇水平分析.结果与结论:含促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组与新鲜移植组相比动情周期恢复率、每高倍视野卵泡计数差异均无显著性意义(P>0.05),卵泡计数高于未添加促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组(P<0.05);动情周期恢复需要的天数接近于新鲜移植组,明显短于未添加促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组(P<0.05).移植后4周,含促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组组织学观察见卵泡发育,未添加促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组仅偶见原始卵泡.含促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组与新鲜移植组相比血清雌二醇水平差异无显著性意义(P>0.05),显著高于未添加促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组(P< 0.05).结果提示,在玻璃化液中加入促卵泡刺激素可提高冻存绵羊卵巢组织移植后卵泡存活率.     

大鼠卵巢组织的冷冻移植

背景:玻璃化冷冻是应用高浓度的冷冻保护液结合极快的制冷速度,使细胞快速冷冻,避免细胞内外冰晶形成对细胞的破坏作用,是一种比较新的冷冻方法,具有操作简单、冷冻效率高等特点.目的:采用玻璃化冷冻技术冷冻大鼠卵巢组织,比较4种冷冻保护剂对大鼠卵巢组织学和功能的影响.方法:将大鼠随机数字表法分为6组,每组6只:二甲基亚砜+乙二醇组、二甲基亚砜+乙二醇+蔗糖组、二甲基亚砜+乙二醇+蔗糖+乙酰胺组、乙二醇+蔗糖+乙酰胺组、去势组、正常对照组.4冷冻组摘除卵巢后应用相应的冷冻保护液冻存,去势组仅摘除卵巢不冻存、不移植,正常对照组不作处理.冻存2周后解冻复苏行同体异位移植,将卵巢组织植入大鼠后肢大腿内侧.移植后30 d,观察阴道上皮类型及动情周期;移植后3个月,经腹主动脉采血检测血清雌二醇水平;回收卵巢组织做组织学检查.结果与结论:4冷冻组均可见卵巢组织结构受损表现,原始卵泡的形态正常率分别为67.9%,71.6%,80.5%,59.4%,初级卵泡形态正常率分别是41.6%,52.3%,55.9%,36.7%.二甲基亚砜+乙二醇+蔗糖+乙酰胺组卵泡正常率较二甲基亚砜+乙二醇组、乙二醇+蔗糖+乙酰胺组高(P<0.05);不同发育阶段卵泡构成比差异无显著性意义,均未见典型的次级卵泡.受损的卵细胞主要表现为体积变小、胞浆内出现空泡、核皱缩等.4冷冻组未出现典型动情周期的细胞类型.移植物自周围组织获得可见的血管供应,将卵巢组织块连接形成网络.移植物内毛细血管丰富,皮质中可见成群的原始卵泡,初级卵泡、次级卵泡所占比例低于原始卵泡,形态与正常者相似.4种冷冻方法冻存卵巢组织血清雌二醇水平较正常对照组明显降低(P<0.01),二甲基亚砜+乙二醇+蔗糖+乙酰胺组高于其他冷冻组(P<0.05).结果提示4种冷冻方法均对大鼠卵巢组织有一定程度破坏,初级卵泡的损伤大于原始卵泡.冻存复苏后,卵巢功能恢复,但并不完全,二甲基亚砜+乙二醇+蔗糖+乙酰胺组效果优于另外3组,但移植后动物没有出现规律的动情周期,提示冷冻方法尚需进一步完善.     

卵巢组织玻璃化冷冻保存和移植的研究进展

背景:卵巢组织玻璃化冷冻技术作为一种快速、简便、经济的冷冻方式被逐渐应用于卵巢组织的保存。目的:综述国内外关于卵巢组织玻璃化冷冻保存及移植的研究进展。方法:由第一作者检索1995/2011PubMed数据库及清华同方数据库有关卵巢组织玻璃化冷冻保存以及卵巢组织移植技术等方面的文献。结果与结论:玻璃化冷冻是一个超高速的冷冻过程,形成高黏度的"玻璃样凝固状态",可以避免由于冰晶形成所造成的细胞损伤。但至今玻璃化冷冻仍缺乏统一的标准化程序。影响卵巢组织玻璃化冷冻保存效果的主要因素有卵巢组织块的大小、冷冻保护剂的种类、渗透平衡的时间和温度、冷冻载体等。随着低温生物学的发展和卵巢组织冷冻保存效果的提高,卵巢组织的移植已经具备了一定的临床应用可行性。到目前为止,全世界已有一系列关于冻存卵巢组织移植后成功妊娠及分娩的报道,移植成功的关键在于减少缺血再灌注损伤和促进新生血管的形成。     

枸杞多糖对胎儿卵巢组织冷冻保存的影响◆

背景:抗氧化剂的应用对于提高卵巢组织冻存后的活力起着很重要的作用.目的:通过观察冷冻保存的胎儿卵巢组织异种移植到裸鼠肾被膜下的发育情况,探索枸杞多糖在卵巢组织冷冻保存中的作用.方法:实验分为4组.①新鲜移植组:取材后的新鲜胎儿卵巢组织直接进行移植.②冻存对照组:冷冻保护液为基液.③β-巯基乙醇组:冷冻保护液为基液添加100μmol/L β-巯基乙醇.④枸杞多糖组:冷冻保护液为基液添加400 mg/L枸杞多糖.对冷冻复温后的胎儿卵巢皮质块进行祼鼠的肾被膜下移植,并于移植后12周取材.结果与结论:各组在移植物的存活率上差异无显著性意义(P >0.05).在卵泡计数上冷冻对照组最低(P <0.05).在卵泡的存活率上,各组间差异均有显著性意义,其中以冷冻对照组最低,枸杞多糖组最高.β-巯基乙醇组和枸杞多糖组卵巢超微结构较冷冻对照组保存的好.提示400 mg/L的枸杞多糖和100μmol/L的β-巯基乙醇有利于卵巢组织的冷冻保存,并可显著提高冷冻卵巢组织移植后的存活率.     

大鼠胚胎卵巢冷冻保存和异体无血管皮下移植的生长

背景:胚胎卵巢组织免疫原性低,不易引起宿主的免疫排斥反应,是卵巢异体移植的理想供体.但由于获取胎儿卵巢的不随意性和来源限制,标本的冷冻显得至关重要,成功的冷冻保存和复苏技术是建立胎儿卵巢库的关键.目的:通过对大鼠新鲜或冻融胚胎卵巢组织异体无血管移植后的组织形态和功能的观察,探讨胚胎卵巢组织异体移植和超速冷冻保存的可行性.设计、时间及地点:随机对照动物实验.于2006-03/05在云南省第一人民医院生殖遗传科进行课题设计,于2006-05/2007-02在云南大学单克隆抗体研究中心完成实验.材料:卵巢来源于孕龄为18～20 d SD大鼠胚胎.取阴道脱落细胞涂片证实有正常动情周期未交配过的SD成年雌性大鼠作为移植对象,分4组:正常对照组(n=10)、去势对照组(n=10)、新鲜胚胎卵巢移植组(n=25)、冷冻胚胎卵巢移植组(n=25).方法:正常对照组仅行皮肤筋膜肌肉切开缝合术,去势对照组切除双侧卵巢组织.将孕龄为18～20 d的新鲜或经超速冷冻法冷冻复苏的大鼠胚胎卵巢植入去势后4周的大鼠颈部皮下作为实验组,分别为新鲜移植组和冷冻移植组.主要观察指标:通过阴道脱落细胞的观察和血清雌二醇、孕酮的测定了解大鼠内分泌恢复情况,并对移植卵巢进行组织学观察.结果:新鲜移植组和冷冻移植组分别有52.17%和38.01%大鼠恢复了动情周期,两组血清雌二醇和孕酮在分别在35和49 d恢复到正常,且动情周期天数与正常对照组比较,差异无显著性意义.冷冻移植组大鼠恢复动情周期虽稍短于新鲜移植组,但差异并无统计学意义.63 d后取出移植物观察,见移植物色泽红润,表面有丰富的血管形成,镜下见卵巢内有大量的小动脉和小静脉;移植物组织学检查发现卵泡的发育,光镜下可见不同发育阶段的卵泡,有成熟卵泡和黄体形成,形态与正常卵巢无明显差别.结论:大鼠胚胎卵巢异体异位无血管皮下移植后能存活、生长发育并具有与正常卵巢相似的内分泌功能;超速冷冻法能较好的保存胚胎卵巢的活性,复苏后与新鲜胚胎卵巢组织具有相同的生理活性.     

深低温冻存同种异体皮肤移植中转化生长因子β的表达

背景：皮肤移植和创面覆盖是创伤、烧伤治疗的重要措施。目前,同种异体皮仍然是可利用的最佳创面覆盖物。目的：通过检测转化生长因子β在深低温冻存后的大鼠同种异体皮肤移植后的表达,评估深低温贮存同种异体皮在创面上的应用。方法：取大鼠皮肤保存于低温-20℃（低温保存组）及80℃深低温（深低温保存组）,冻存1周、1,2个月后,皮片分组移植于同种大鼠背部进行实验,并以自体移植大鼠作为对照组。结果与结论：同低温保存组相比,深低温保存组转化生长因子β的表达被抑制,移植皮肤排斥反应出现时间延迟及存活时间延长,排斥反应评分也较低。同低温冻存相比,深低温冷冻保存能使同种异体移植物的转化生长因子β抗原表达降低。提示深低温冻存的异体皮作为一种创面临时覆盖物,在存在皮肤组织缺失或皮源不足的情况下具有广阔的应用前景。     

枸杞多糖对胎儿卵巢组织冷冻保存的影响

背景：抗氧化剂的应用对于提高卵巢组织冻存后的活力起着很重要的作用。目的：通过观察冷冻保存的胎儿卵巢组织异种移植到裸鼠肾被膜下的发育情况,探索枸杞多糖在卵巢组织冷冻保存中的作用。方法：实验分为4组。①新鲜移植组：取材后的新鲜胎儿卵巢组织直接进行移植。②冻存对照组：冷冻保护液为基液。③β-巯基乙醇组：冷冻保护液为基液添加100μmol/Lβ-巯基乙醇。④枸杞多糖组：冷冻保护液为基液添加400mg/L枸杞多糖。对冷冻复温后的胎儿卵巢皮质块进行祼鼠的肾被膜下移植,并于移植后12周取材。结果与结论：各组在移植物的存活率上差异无显著性意义（P〉0.05）。在卵泡计数上冷冻对照组最低（P〈0.05）。在卵泡的存活率上,各组间差异均有显著性意义,其中以冷冻对照组最低,枸杞多糖组最高。β-巯基乙醇组和枸杞多糖组卵巢超微结构较冷冻对照组保存的好。提示400mg/L的枸杞多糖和100μmol/L的β-巯基乙醇有利于卵巢组织的冷冻保存,并可显著提高冷冻卵巢组织移植后的存活率。     

深低温冻储同种异体气管移植并骨髓间充质干细胞移植后气管上皮细胞血管内皮生长因子的表达

背景:深低温冷冻后的组织可以保持其原有的活力和组织完整性,并能消减抗原性。目的:静脉移植骨髓间充质干细胞合并深低温处理供体气管后进行同种异体气管移植,观察骨髓间充质干细胞在促进上皮再生和再血管化后的作用。方法:用深低温冻储2周和6周的气管进行Wistar大鼠同种异体气管移植后,用PKH-26标记的3～5代骨髓间充质干细胞经鼠尾静脉移植入受体内,等量的磷酸盐缓冲液注射作为实验对照。观察供体气管的组织学和血管内皮生长因子蛋白表达。结果和结论:骨髓间充质干细胞移植合并深低温冻储后的移植气管结构完整,软骨无变性坏死;深低温6周的移植气管上皮再生情况优于2周。骨髓间充质干细胞移植组的上皮细胞表达血管内皮生长因子水平高于磷酸盐缓冲液对照组。结果提示,骨髓间充质干细胞移植合并深低温冻储6周后移植气管存活期好于深低温冻储2周;骨髓间充质干细胞能够促进移植物周围新生血管的增加,从而促进气管损伤的修复。     

重组人骨形态发生蛋白2晚期自体骨痂成骨对血管内皮生长因子表达的影响

背景:重组人骨形态发生蛋白2和重组人骨形态发生蛋白7治疗骨缺损已经应用于多种实验动物模型.作者前期实验在兔自体髂骨与骨痂骨等长骨骨折治疗中应用,已取得满意效果.目的:验证采用骨折断端周围晚期自体骨痂复合重组人骨形态发生蛋白2移植治疗骨缺损效果,并观察血管内皮生长因子对骨折愈合的影响.设计、时间及地点:随机对照实验,于2008-08/2009-01在本溪市中心医院科研实验室和中国医科大学附属二院实验动物中心完成.材料:2.0～2.5 kg的成年健康日本大耳白兔20只.方法:将兔行双侧桡骨中段模拟骨折,12周后观察至明显骨痂生长随机分配实验Ⅰ组10只,实验Ⅱ组10只.在原骨折部位手术,切除骨痂备用,同时切除骨折端使之缺损1.5 cm,实验Ⅰ组,左桡骨移植复合重组人骨形态发生蛋白2骨痂为为骨形态发生蛋白2骨痂组,右桡骨移植髂骨为移植自体髂骨组,实验Ⅱ组,左桡骨移植晚期自体骨痂为移植晚期自体骨痂组,右桡骨空白对照为空白对照组.主要观察指标:于术后14 d取标本检测各组兔血管内皮生长因子基因mRNA表达水平的.结果:骨形态发生蛋白2骨痂组、移植髂骨组的血管内皮生长因子mRNA及蛋白表达水平差异无显著性意义(P>0.05);移植晚期自体骨痂组、空白对照组血管内皮生长因子未见明显表达.骨形态发生蛋白2骨痂组、移植髂骨组的血管内皮生长因子蛋白表达及基因表达明显高于移植晚期自体骨痂组、空白对照组(P<0.05).结论:骨折断端周围晚期自体骨痂复合重组人骨形态发生蛋白2明显促进血管内皮生长因子的合成分泌,对促进骨缺损愈合有积极意义.     

卵巢移植及移植卵巢的保存

目的:结卵巢移植的研究现状及卵巢组织的冷冻解冻方法。资料来源:应用计算机检索Medline1996-01/2006-12与卵巢移植相关的文章,检索词为“ovary transplantation,auto-ovary transplantation,heterologous transplantation,cryopreservation,vitrification,hysterocarcinoma”,限定文献语种为“English”;同时检索万方数据库2000-01/2006-12相关文章,检索词为“卵巢移植,自体移植,异种移植,低温保存,玻璃化冷冻”,限定文献语种为中文。资料选择:共检索到相关文献280余条,选择卵巢移植及卵巢组织的冷冻解冻方法相关文章,无论观察对象是人还是动物均纳入,筛除明显重复文献。资料提炼:将筛选的文献进一步查找全文,纳入35条文献进行综述。其中26篇论述卵巢的自体移植、异体移植及异种移植的研究进展,另外9篇是介绍卵巢组织的冷冻解冻方法以及各种方法的差异。资料综合:目前卵巢的移植可以分为自体移植、异体移植、异种移植:①目前人类卵巢组织的自体移植无论是异位还是原位移植有效性和实用性尚不完全清晰。理论上自体原位移植在卵泡的发育和恢复生育功能上更具有优势,但是,在实际观测临床应用中,卵巢组织自体异位移植仍然是最佳首选。②目前同种异体移植面临的最大难题就是免疫排斥反应,其次是受体提供者的问题;另外胚胎卵巢组织作为移植物所具有的优越性越来越受到关注,但是在应用于临床中除了有伦理道德等社会问题,还存在潜在的检测不出的基因的异常表达等技术检测问题需要解决。③异种移植仅处于实验室研究阶段,迄今为止绵羊、猪、猫、猴和人等卵巢组织已经作为材料用于实验室异种移植中。在卵巢组织的移植过程中,卵巢组织的冷冻方法有慢速冷冻法、快速冷冻法和玻璃化冷法;大多数冻存的卵巢组织应用快速复温法解冻。结论:随着免疫移植学、卵巢组织冻存技术的发展,卵巢组织的移植技术将成为解决女性生殖及内分泌的最佳有效途径。但是就目前发展状况来看,还存在许多亟待解决的问题。