昆明小鼠3.5d和4d囊胚不同分离方法的比较

背景：远交系的昆明小鼠作为中国自然科学研究主要实验动物,其胚胎干细胞建系的成功率一直很低.目的：探讨昆明小鼠胚胎干细胞体外分离培养的最佳方法和最适合的采胚时间.方法：采集孕3.5 d和4 d的囊胚分别以免疫外科法和全胚培养法在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上分离和克隆昆明小鼠胚胎干细胞集落.结果与结论：免疫外科法和全胚法培养3.5 d囊胚的内细胞团贴壁率和原代克隆形成率差异均不显著（P 〉 0.05）;全胚法培养4 d囊胚的内细胞团贴壁率显著高于免疫外科法（P 〈 0.05）,但原代克隆形成率显著低于免疫外科法（P 〈 0.05）;全胚法培养4 d囊胚的原代克隆形成率显著高于3.5 d囊胚（P 〈 0.05）;免疫外科法分离4 d囊胚内细胞团的贴壁率和原代克隆形成率显著高于以同样方法分离培养的3.5 d囊胚（P 〈 0.05）.结果显示用免疫外科法分离4 d囊胚更适合于昆明小鼠胚胎干细胞的体外分离培养.     

昆明小鼠3.5d和4d囊胚不同分离方法的比较

背景:远交系的昆明小鼠作为中国自然科学研究主要实验动物,其胚胎干细胞建系的成功率一直很低.目的:探讨昆明小鼠胚胎干细胞体外分离培养的最佳方法和最适合的采胚时间.方法:采集孕3.5 d和4 d的囊胚分别以免疫外科法和全胚培养法在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上分离和克隆昆明小鼠胚胎干细胞集落.结果与结论:免疫外科法和全胚法培养3.5 d囊胚的内细胞团贴壁率和原代克隆形成率差异均不显著(P > 0.05);全胚法培养4 d囊胚的内细胞团贴壁率显著高于免疫外科法(P < 0.05),但原代克隆形成率显著低于免疫外科法(P < 0.05);全胚法培养4 d囊胚的原代克隆形成率显著高于3.5 d囊胚(P < 0.05);免疫外科法分离4 d囊胚内细胞团的贴壁率和原代克隆形成率显著高于以同样方法分离培养的3.5 d囊胚(P < 0.05).结果显示用免疫外科法分离4 d囊胚更适合于昆明小鼠胚胎干细胞的体外分离培养.     

小鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上向胚胎干细胞的生长发育

背景:到目前为止已建立了数百个小鼠胚胎干细胞系,一般情况下实验室培养的胚胎干细胞有3个细胞来源,即胚泡内的内细胞群、胚胎生殖嵴的原始生殖细胞和应用克降技术制造人体胚胎并提取干细胞.目的:尝试用自制的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层分离培养小鼠胚胎干细胞.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-12/2007-09在辽宁医学院完成.材料:妊娠14.5 d的孕鼠40只,由辽宁医学院实验动物中心提供.方法:无菌条件下剪开孕鼠子宫壁,取出胚胎,去除头、尾、内脏和四肢后采用胰蛋白酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,经丝裂霉素C处理3.5 h后接种于6孔板中,细胞贴壁后即为成纤维细胞饲养层.收集3.5 d的小鼠囊胚,在显微镜下将囊胚置于上述6孔板的中央,五六_人后取隆起生长的内细胞团块,分离后再培养.主要观察指标:成纤维细胞饲养层的制备情况,胚胎干细胞的生长状态、碱性磷酸酶染色结果及分化趋势.结果:光镜下小鼠胚胎成纤维细胞呈不规则形,生长较快,传代比例为1:4,经丝裂霉素C处理后细胞贴壁较慢,失去分裂增殖能力.小鼠囊胚孵出透明带的时间为24～72 h,从胞膜中孵出约为1 d,3～5 d后可形成胚胎干细胞集落,7 d后集落呈"鸟巢"状.组织化学染色后可见细胞内有大量的蓝紫色颗粒沉积,连续培养20 d,期间不换培养液,可见胚胎干细胞团分化为亮度较小、界限清楚的单核细胞.结论:小鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上可发育成胚胎干细胞,并能进行传代.     

昆明小鼠胚胎干细胞囊胚孵出前不同培养方法的效果比较

目的:胚胎干细胞的获得、克隆与传代对实验条件及操作技术水平要求较高。分别将单纯胚胎干细胞培养液法与KSOM-胚胎干细胞培养液法应用于昆明小鼠胚胎干细胞囊胚孵出前阶段,对体外培养的胚胎干细胞进行鉴定,并比较其增殖与克隆形成情况。方法:实验于2006-03/10在哈尔滨医科大学组织胚胎学教研室暨组织工程中心完成。①冲胚液配制:含体积分数为0.05胎牛血清的磷酸盐缓冲液,4℃冰箱保存。②KSOM胚培养液配制:将配制好的贮存液放入-20℃冰箱保存,用时加入1g/L的胎牛血清白蛋白和1mL/L的丙酮酸钠,过滤,调配至100mL。③取6～8周龄雌性昆明小鼠35只腹腔内注射孕马血清绒毛膜促性腺激素7.5IU/只,48h后注射人绒毛膜促性腺激素7.5IU/只,然后与10周龄雄性昆明小鼠15只合笼,次日晨雌鼠见栓者记为妊娠0.5d。④于妊娠3.5d冲胚,将冲出的囊胚分别应用于单纯胚胎干细胞培养系统、KSOM-胚胎干细胞培养系统。前者直接利用胚胎干细胞培养液在饲养层上培养并孵出囊胚;后者先应用KSOM液滴培养囊胚至孵出,再改用胚胎干细胞培养液于饲养层上培养孵出的囊胚。⑤将孵出的囊胚置于预先制备好的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养,酶-机械法分离囊胚内细胞团,观察可传代的囊胚内细胞团数与原代胚胎干细胞的克隆形成率。⑥对培养的胚胎干细胞进行Oct-4染色和碱性磷酸酶染色鉴定,并检测其体外分化能力。结果:①不同培养系统对孵出囊胚状态的影响:KSOM-胚胎干细胞培养系统:KSOM液滴中处于囊胚内细胞团状态的囊胚腔逐渐增大,待取出时胚胎扩展更加充分,一侧突出一个大泡但未突破透明带,此为正在孵出的囊胚。孵出后仍维持有腔的囊胚状态,表明胚胎的质量良好。移入饲养层后即贴壁,囊胚内细胞团开始增殖。单纯胚胎干细胞培养系统:囊胚培养24h后开始孵出并贴壁,囊胚内细胞团逐渐增大,最后将囊胚腔充满。②不同培养系统对原代胚胎干细胞克隆形成率的影响:KSOM-胚胎干细胞培养系统、单纯胚胎干细胞培养系统的囊胚总数分别为154只和131只,差异无显著性意义(P>0.05);两种培养系统的囊胚内细胞团可传代数量分别为89只和80只,增殖到能够离散的程度基本相似(57.8%,20.1%,P>0.05);原代胚胎干细胞囊胚内细胞团离散后出现集落数分别为31个和38个,克隆形成率差异无显著性意义(20.1%,29.0%,P>0.05)。③胚胎干细胞鉴定结果:第5代胚胎干细胞Oct-4染色和碱性磷酸酶染色均呈阳性。④胚胎干细胞体外分化能力检测结果:胚胎干细胞团块悬浮培养4d时,形成由上百个细胞组成的球状拟胚体。结论:①单纯胚胎干细胞培养液一步法与KSOM-胚胎干细胞培养液两步法孵出囊胚所获得的胚胎干细胞集落形态类似,均具有胚胎干细胞的形态学特征,但后者在KSOM液培养阶段有利于囊胚孵出前的早期胚胎发育同步化。②两种培养方法得到的胚胎干细胞其增殖及克隆形成能力基本相似。     

昆明鼠胚胎干细胞系的建立及其特性

背景:到目前为止,国际上通用的动物胚胎干细胞细胞系大多是从129品系和C57BL/6系小鼠中获得的,少部分来自BALB/C系,来自于中国昆明鼠则鲜有报道.目的:分离培养昆明系小鼠胚胎干细胞,并对其生物学特性进行初步鉴定.设计、时间及地点:以细胞为对象的观察性实验,于2006-05/2007-06在南昌大学第一附属医院泌尿外科研究所完成.材料:昆明小鼠3.5 d胚龄的囊胚.方法:自昆明系小鼠3.5 d胚龄的囊胚分离内细胞团细胞,接种于小鼠原代胚胎成纤维细胞饲养层上,对分离的内细胞团细胞进行扩增、传代培养.主要观察指标:观察胚胎干细胞集落的生长情况,对其碱性磷酸酶表达进行染色分析,采用免疫荧光法检测其阶段特异性胚胎抗原1表达,以反转录-聚合酶链反应检测其特异性表达因子c-Myc,Nanog,Oct3/4和Sox2的基因表达情况,并对其体内外分化能力对进行鉴定分析.结果:分离、培养自内细胞团的细胞呈典型的胚胎干细胞集落样生长,碱性磷酸酶染色及阶段特异性胚胎抗原1荧光染色阳性,细胞表达c-Myc,Nanog,Oct3/4和Sox2等基因,细胞在体内外均能分化成来源于不同胚层的多种细胞类型.结论:成功从昆明小鼠囊胚中分离并建立一株胚胎干细胞系,其生物学特性与其他胚胎干细胞株相符.     

昆明小鼠胚胎干细胞的分离培养方法

背景:目前已经建立了数百个小鼠的胚胎干细胞系,这些细胞系大多数来源于129,C57BL/6J和BALB/C品系的小鼠,而昆明株小鼠的胚胎干细胞建系的成功率很低.目的:探寻昆明小鼠胚胎干细胞分离培养的方法,以期提高昆明小鼠胚胎干细胞建株的成功率.设计、时间及地点:以细胞为对象的观察性实验,于2006-04/2007-06在重庆市神经病学重点实验室完成.材料:昆明白小鼠3.5d和4d胚龄的囊胚.方法:分别将昆明白小鼠3.5d和4d胚龄的囊胚培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,四五天后取隆起生长的内细胞团块分离后再培养,分别采用2.5g/L胰蛋白酶-0.4g/L乙二胺四乙酸与1g/L胰蛋白酶0.2g/L乙二胺四乙酸室温作用2～4min并辅以机械离散胚胎干细胞集落.主要观察指标:观察集落的生长情况,通过碱性磷酸酶染色、OCT-4染色、细胞核型分析等对细胞集落进行鉴定.结果:[1]4d胚龄胚胎的贴壁率、内细胞团出现率及克隆形成率高于3.5d胚龄(P<0.05).[2]采用1g/L胰蛋白酶-0.2g/L乙二胺四乙酸室温作用2～4min并辅以机械作用,分离克隆胚胎干细胞效果较好.[3]胚胎干细胞呈集落性生长,符合小鼠胚胎干细胞的一系列特性,悬浮培养胚胎干细胞能得到囊状胚体.结论:采用4d胚龄的囊胚和1g/L胰蛋白酶-0.2g/L乙二胺四乙酸室温作用2～4min,并辅以机械作用的消化方法,有助于提高昆明小鼠胚胎干细胞建株的能力.     

体外分离培养昆明小鼠胚胎干细胞最佳胚龄的筛选:孕2.5d与3.5d及4.5d比较

背景:昆明小鼠基因型与人类近似,建立昆明小鼠胚胎干细胞系有利于其转基因动物的获得,但目前对于何时收集胚胎尚无明确报道.目的:探讨体外分离培养昆明小鼠胚胎干细胞的最佳胚龄.方法:分别从孕2.5 d,3.5 d和4.5 d的昆明系母鼠子宫中分离收集胚胎,于显微镜下观察胚胎的形态、贴壁情况、内细胞团形成情况、胚胎干细胞克隆率、胚胎干细胞亚克隆率等,并进行碱性磷酸酶染色.结果与结论:孕2.5 d采集的胚胎多为16细胞期胚胎,孕3.5 d采集的胚胎多为桑椹胚,孕4.5 d采集的胚胎多为囊胚.孕2.5 d胚胎和孕3.5 d胚胎的贴壁率、内细胞团形成率、胚胎干细胞克隆率、胚胎干细胞亚克隆率均无明显差异(P＞0.05);孕4.5 d胚胎上述指标均显著高丁二前两者,更适合作为胚胎干细胞培养、克隆、分离、传代的材料.     

昆明小鼠3.5d囊胚分离培养胚胎干细胞并诱导分化为胰岛素前体细胞的实验

目的:自囊胚内细胞团分离培养患者自身的胚胎干细胞并将其诱导分化为目的细胞可用于特定疾病的治疗。实验采用昆明小鼠3.5d囊胚分离培养胚胎干细胞,并将其诱导分化为胰岛素前体细胞。方法:实验于2005-09/2006-11在哈尔滨医科大学组织学与胚胎学教研室完成。①选取妊娠3.5d昆明雌性小鼠123只,至13.5d时取11只用于胚胎成纤维细胞饲养层制备。剩余112只妊娠3.5d小鼠冲胚后,挑取扩展充分、囊胚内细胞团明显的囊胚采用胰酶 乙二胺四乙酸机械法分离培养胚胎干细胞,进行碱性磷酸酶染色和Oct-4免疫荧光染色鉴定。②在细菌培养皿的盖上用不含人重组白血病抑制因子的胚胎干细胞培养液制备液滴,选取生长旺盛、形态典型的胚胎干细胞集落,采用胰酶 乙二胺四乙酸机械法悬浮培养4d,形成拟胚体,行巢蛋白免疫荧光染色。③将胚胎干细胞诱导分化为胰岛素前体细胞,首先需要L-多聚赖氨酸和纤维粘连蛋白包被培养皿,然后用ITSFn筛选液(含5mg/L胰岛素、50mg/L转铁蛋白、30nmol/L亚硒酸钠、5mg/L纤维粘连蛋白的DMEM/F12培养液)筛选巢蛋白阳性细胞6d,碱性成纤维细胞生长因子扩增及初步诱导6d,再以烟碱诱导功能成熟的胰岛素前体细胞27d。应用DTZ染色、Insulin免疫荧光染色对诱导的细胞进行鉴定。结果:①胚胎干细胞的分离培养:将扩展充分的囊胚放置在饲养层上4d后,可见囊胚内细胞团自透明带中孵出,呈柱状生长,中央颜色深于周边,并将周边的饲养层细胞推开。胚胎干细胞传代后呈典型的克隆样生长,相差显微镜下折光性强。②胚胎干细胞碱性磷酸酶染色和Oct-4免疫荧光染色结果:两种染色均呈阳性表达。③拟胚体的形成及向巢蛋白阳性细胞的诱导:胚胎干细胞悬浮培养4d可形成拟胚体,经ITSFn筛选6d后可见90%巢蛋白阳性细胞。④巢蛋白阳性细胞向胰岛素前体细胞的分化:烟碱诱导6d后,上皮样细胞增多,细胞逐渐密集形成类胰岛样组织。诱导10dDTZ染色可见集落的边缘细胞被染成腥红色。诱导27dInsulin免疫荧光染色可见染色阳性细胞团簇。结论:采用昆明小鼠3.5d囊胚成功分离培养胚胎干细胞,并可以将胚胎干细胞诱导分化为胰岛素前体细胞。     

BALB/C小鼠胚胎干细胞的分离培养及初步鉴定

目的从BALB/C小鼠的早期胚胎中分离和培养胚胎干细胞(ES细胞),并对其生物学特性进行初步鉴定.方法收集BALB/C小鼠3.5d胚龄的囊胚,分离内细胞团(ICM)细胞进行培养,以小鼠原代胚胎成纤维细胞(PMEF)作为饲养层,细胞扩增传代,观察集落的生长情况并通过碱性磷酸酶(AKP)染色对细胞集落进行初步鉴定.结果ES细胞呈集落样生长,AKP染色阳性,符合小鼠ES细胞的一些特性.结论BALB/C小鼠囊胚在原代小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上可以发育成ES细胞.     

人胚胎干细胞无血清无饲养层培养体系的建立

背景:研究表明FGF2,TGFβ/activin/nodal和IGF信号通路是人胚胎干细胞保持其多能性所必需的,然而直接添加外源性碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β和胰岛素是否能够维持人胚胎干细胞的自我更新目前尚无报道.目的:拟建立人胚胎干细胞无饲养层无血清条件下的培养体系.设计,时间及地点:细胞学体外观察,于2007-09/2009-02在中国科学院昆明动物研究所完成.材料:12.5～13.5d龄清洁级ICR孕鼠2只,由昆明医学院动物中心提供.人胚胎干细胞株BG02购自美国Bresagen公司.方法:①消化离心BG02细胞,重悬于无饲养层过渡培养基后接种,常规培养5～7 d,挑去分化的人胚胎干细胞,加入分散酶消化,切割成小团块,离心重悬后按1:3比例重新接种预铺层粘连蛋白的4孔板,此时培养基换成无血清无饲养层培养基,由80%DMEM/F12、20%KSR、2 mmol/L glutamine、1%非必需氨基酸、0.1 mmol/L β-巯基乙醇、ITS(×1)、10~6 U/L青霉素、100 mg/L 链霉素、4 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、0.12 μg/L转化生长因子β1组成.②无菌条件下取出ICR胎鼠,组织块胰酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,接种在0.1%明胶包被的6孔板中即为饲养层.将生长在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细胞株BG02预铺至有层粘连蛋白的培养板上,加入含碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1及ITS的无血清培养基连续培养.主要观察指标:观察BG02细胞在无血清无饲养层培养体系中的形态,采用细胞免疫组化法检测人胚胎干细胞特异性分子标志的表达,检测BG02细胞体外分化能力及其核型,比较BG02细胞在无血清无饲养层和小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系中的生长情况、细胞集落分化率.结果:在无血清无饲养层培养体系中,BG02细胞连续传代20代,细胞呈典型的人胚胎干细胞形态特征;BG02细胞表达SSEA-4,SSEA-3,TRA-1-60,TRA-1-81,Oct-4,但不表达SSEA-1;培养20 d后,BG02细胞进一步分化成3个胚层的细胞,分化细胞能够表达甲胎蛋白、巢蛋白、α-肌动蛋白;培养至20代细胞核型均正常(46XY).与在饲养层培养体系下比较,无血清无饲养层条件下BG02细胞BG02细胞生长速度减慢,细胞倍增时间明显延长(P＜0.05),集落分化率明显升高(P＜0.05).结论:实验初步建立了入胚胎干细胞无血清无饲养层的培养体系,添加碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1和ITS可以维持人胚胎干细胞的自我更新.