肠道病毒71型VP1蛋白原核表达及初步鉴定

目的采用分子克隆技术,构建肠道病毒71型(EV71)VP1全长基因大肠杆菌原核系统表达载体,诱导重组VP1融合蛋白表达。方法自EV71感染患者血清中提取病毒总RNA,进行一步法RT-PCR,扩增编码VP1蛋白的全长基因片段(891 bp),以pET32(a)为表达载体,构建重组表达质粒pET32(a)-VP1,转化E.coli.Rosseta感受态细胞,获得重组工程菌株。经诱导培养,SDS-PAGE电泳,免疫印迹鉴定表达产物。结果获得了含重组表达质粒pET32(a)-VP1的正相阳性工程菌株,经IPTG诱导能高效表达VP1融合蛋白。结论重组工程菌可表达VP1融合蛋白,对研究EV71发病机制及疫苗研制具有重要意义。     

融合基因Tat—HPV16L1的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:构建人乳头瘤病毒16型L1基因和蛋白转导肽基因Tat的融合表达载体,以大肠杆菌作为表达系统,探索制备经济而高效的人乳头瘤病毒疫苗的新方法.方法:以pBR322-HPV16质粒为模板扩增L1基因,与原核表达载体pET28a连接,重组质粒再与自行设计蛋白转导功能片段Tat连接,经测序鉴定后转入大肠杆菌表达菌株DE3进行诱导表达Tat-HPV16L1融合蛋白.结果:融合基因Tat-HPV16L1测序结果与预期完全符合,经过IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳分析,结果诱导表达成功.结论:本研究为制备经济而高效的人乳头瘤病毒疫苗打下了基础.     

烟曲霉硫氧还蛋白还原酶重组蛋白的原核表达及抗原性分析

摘要：目的：克隆烟曲霉硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase,TR）基因并构建原核表达载体,获得烟曲霉TR重组蛋白,并鉴定其抗原性。 方法：用RT-PCR方法从烟曲霉总RNA中扩增出TR cDNA片段,克隆至pMD18-T载体,并转化E.coli JM109。经序列分析证实后,提取重组克隆质粒双酶切获得目的基因,与表达载体pET28a(+)连接,转化E.coli BL21（DE3）,筛选重组表达质粒。用异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导重组融合蛋白表达,用SDS-PAGE及免疫印迹法分析重组蛋白质,并用亲和层析柱进行纯化。 结果：构建了含TR全长基因的重组表达质粒,IPTG诱导后可高效表达。免疫印迹结果表明该重组蛋白质可被侵袭性曲霉病患者血清识别。 结论：成功构建了重组表达质粒pET28a(+)/TR,并在大肠埃希菌中获得了高效表达,重组蛋白质具有良好的抗原性,为进一步研究奠定了基础。     

靶向克隆法构建PEP-1-VP3基因的原核表达载体

目的 利用PCR 产物靶向克隆法构建细胞穿透肽-凋亡素(PEP-1-VP3)的原核表达载体.方法 以PGEX-6P-1/TAT-VP3 质粒为模板,PCR 扩增VP3 基因的366 bp 片段,应用靶向克隆酶,将VP3 基因插入到线性pET15b-PEP-1,得到重组表达质粒pET15b-PEP-1-VP3,经过筛选,挑选出阳性克隆进行Nde Ⅰ和BamHⅠ双酶切图谱分析和重组质粒核苷酸序列分析以鉴定所构建的原核表达载体.结果 PCR产物经过电泳可见366 bp 特征性的VP3 片段,重组的质粒经过双酶切获得了一个大小为440 bp 的特征性PEP-1-VP3 片段,重组质粒测序证实VP3 cDNA 编码区成功地克隆入了pET15b-PEP-1,且其序列与GeneBank 中VP3 cDNA 序列完全一致.结论 靶向克隆法可快速、高效地构建PEP-1-VP3 基因的原核表达载体,为制备PEP-1-VP3 融合蛋白奠定基础.     

重组日本血吸虫亲环素B的克隆、表达及免疫分析

目的克隆、表达日本血吸虫亲环素B(SjCyPB)基因,鉴定并分析重组蛋白的免疫性。方法根据Genbank中日本血吸虫序列设计一对特异性引物,以日本血吸虫cDNA为模板扩增SjCyPB基因,酶切后连接到表达载体pET28,构建pET28a(+)-SjCyPB重组质粒,转化入感受态大肠杆菌BL21/DE3后对质粒进行双酶切和测序鉴定。IPTG诱导表达后,经亲和层析纯化重组蛋白。采用Western Blotting分析鉴定重组蛋白的抗原性。将纯化的重组蛋白免疫大鼠,获得免疫血清,ELISA检测抗SjCyPB特异性抗体滴度。结果构建的pET28a(+)-SjCyPB重组质粒经双酶切和测序鉴定证实SjCyPB基因成功连接到pET28a(+)质粒中。经原核表达后获得纯化的重组蛋白,Western Blotting结果显示,该重组蛋白可与感染日本血吸虫的兔血清结合形成明显的条带。采用ELISA检测重组蛋白免疫后大鼠免疫血清的特异性IgG抗体滴度为1∶51 200。结论成功克隆了日本血吸虫CyPB基因,并获得大量纯化的重组蛋白,重组SjCyPB具有免疫原性和抗原性。     

LanCL1融合蛋白表达纯化及其多克隆抗体制备鉴定

目的:获得LanCL1原核和真核表达融合蛋白,制备兔抗LanCL1的多克隆抗体以用于LanCL1基因功能研究。方法:PCR扩增LanCL1 CDS编码区序列,分别亚克隆至原核和真核表达载体上。将真核表达重组质粒用脂质体转染HEK293细胞成功获得了pRK5-LanCL1真核表达融合蛋白。同时将原核表达重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-LanCL1原核表达融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖珠亲和纯化,透析浓缩获得高纯度GST-LanCL1融合蛋白。将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体。结果:获得了LanCL1真核和原核表达重组融合蛋白。经亲和纯化后的GST-LanCL1融合蛋白纯度达到90%,BCA蛋白定量浓度约0.44mg/mL。获得了高效价的特异性兔抗LanCL1多克隆抗体。结论:成功进行了LanCL1融合蛋白的原核和真核表达,并获得抗LanCL1的高灵敏度的多克隆抗体,为LanCL1进一步功能研究奠定了基础。     

日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21中的表达

目的：构建日本血吸虫（Sj）重组质粒 pGEX-Sj32并研究其在大肠埃希菌 BL21中的表达效率。方法从该实验室保存的 BL21（pET28α-Sj32）重组菌中抽提质粒 pET28α-Sj32,PCR 扩增 Sj32抗原编码基因,定向克隆入穿梭载体 pGEX-1λT,构建重组质粒 pGEX-Sj32。将重组质粒转化大肠埃希菌 BL21（DE3）,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达;表达产物用SDS-PAGE 和 Western blot 进行鉴定。结果 PCR 成功扩增出 Sj32编码基因,并成功构建了重组质粒 pGEX-Sj32;SDS-PAGE显示相对分子质量约为58×103的重组蛋白,薄层扫描分析显示表达蛋白约占菌体总蛋白的21％;Western blot 显示重组蛋白可被日本血吸虫感染兔血清识别。结论成功构建日本血吸虫重组质粒 pGEX-Sj32,该重组质粒在大肠埃希菌 BL21中得到了高效表达,且表达蛋白具有特异的抗原性。     

人Ⅱ型丙氨酸氨基转移酶表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

目的　构建基因工程菌株 ,以获得重组人II型丙氨酸氨基转移酶 (ALT2 )蛋白。方法　逆转录PCR法从人肌肉组织总RNA中扩增ALT2基因片段 ,插入原核表达载体pET - 2 8a ,构建成融合表达质粒pET2 8 ALT2 ,将其转化大肠杆菌BL2 1DE3,IPTG诱导表达。SDS PAGE、活力测定、活性染色及westernblot鉴定表达产物。结果　重组质粒pET2 8 ALT2测序和酶切结果与预期完全符合。IPTG诱导后 ,阳性菌体裂解物上清ALT2活性很高 ,PAGE出现一分子量 5 80 0 0蛋白条带 ,可被抗ALT1抗血清识别 ,酶活性染色显示有ALT活性。结论　已成功将ALT2基因克隆到pET 2 8a载体 ,ALT2蛋白得到可溶性高效表达。     

人regucalcin cDNA高表达重组质粒的构建及其在原核细胞中的表达

目的原核表达获得大量人regucalc in(RGN)蛋白。方法用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2)中扩增RGN全长cDNA,将扩增的产物连接于测序载体pMD18-T,测序鉴定准确后,进行酶切,将正确的RGN全长cDNA与原核表达载体pET42b( )构建成重组质粒pET42b( )-RGN。将pET42b( )-RGN先转化入大肠杆菌DH5α,提取质粒经双酶切鉴定正确后,再转化入表达宿主大肠杆菌DE3菌株。对转化菌株进行诱导、破菌,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹分析,鉴定RGN融合蛋白质表达的正确性。RGN重组融合蛋白经N i2 亲和层析纯化,达电泳纯。结果构建了重组质粒pET42b( )-RGN并获得高效表达,RGN重组融合蛋白经异丙基硫化-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后以包涵体形式存在,表达的蛋白质相对分子质量为34 000。结论人RGN蛋白在pET42b( )原核表达载体可获得高效表达,为进一步了解RGN蛋白质的结构、功能及其抗体的制备等奠定了基础。     

人regucalcin cDNA高表达重组质粒的构建及其在原核细胞中的表达

目的 原核表达获得大量人regucalcin（RGN）蛋白。方法 用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术从人。肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2）中扩增RGN全长cDNA，将扩增的产物连接于测序载体pMD18-T，测序鉴定准确后，进行酶切，将正确的RGN全长cDNA与原核表达载体pET42b（＋）构建成重组质粒pET42b（＋）-RGN。将pET42b（＋）-RGN先转化入大肠杆菌DH5α，提取质粒经双酶切鉴定正确后，再转化入表达宿主大肠杆菌DE3菌株。对转化菌株进行诱导、破菌，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）与免疫印迹分析，鉴定RGN融合蛋白质表达的正确性。RGN重组融合蛋白经Ni^2＋亲和层析纯化，达电泳纯。结果 构建了重组质粒pET42b（＋）-RGN并获得高效表达，RGN重组融合蛋白经异丙基硫化-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导后以包涵体形式存在，表达的蛋白质相对分子质量为34000。结论 人RGN蛋白在pET42b（＋）原核表达载体可获得高效表达，为进一步了解RGN蛋白质的结构、功能及其抗体的制备等奠定了基础。     

Tiotidine and cimetidine--kinetics and dynamics

Tiotidine and cimetidine kinetics and dynamics were compared to assess mechanisms of the longer duration of effect of tiotidine in man. Both drugs has similar lag times for absorption. Tiotidine with a meal was more slowly absorbed than when fasting and was also more slowly absorbed than cimetidine with a meal. The elimination rates for both drugs did not differ; they were both approximately 2 to 3 hr. Oral doses of cimetidine achieved areas under the plasma concentration curve approximately three times that of tiotidine but these concentrations were only 1/10 as potent. The cimetidine concentration inducing 50% inhibition of food-stimulated gastric acid secretion was 0.41 +/- 0.04 whereas it was 0.04 +/- 0.003 microgram/ml for tiotidine. The effect of tiotidine lasted longer than that of cimetidine because the doses recommended for use in man resulted in higher concentrations in plasma relative to effective concentration than clinical doses of cimetidine.