5-氮胞苷诱导对骨髓间充质千细胞凋亡影响的实验研究

目的：研究5-胞苷（5-azacytidine，5-aza）对体外培养的兔骨髓问充质于细胞（mensenchymal stemcell，MSC）凋亡的影响。方法：体外分离培养兔MSC，用不同浓度5-aza诱导不同时间．观察MSC凋亡情况。结果：正常培养兔MSC有轻度细胞捌亡；5-aza诱导浓度达15μmol／L时凋亡率明显增加（P〈0．01）．当浓度达10μmol／L，诱导时间延长则细胞洲亡率明显增加（P〈0．05），超过15μmol／l。时出现成片细胞死亡。结论：5-aza诱导对体外培养兔骨髓间质干细胞有诱导细胞凋亡作用，其作用程度与诱导时间及浓度有关。     

5-氮胞苷浓度对体外骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌样细胞的影响

目的探讨不同浓度5-氮胞苷(5-aza)体外诱导小型猪骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化的可能性及其对细胞扩增速度的影响.方法10ml骨髓,1.077g/ml Ficoll密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞(MNCs),第2代传代细胞分别加入3,5,10μmol/L浓度5-aza化学诱导24h,与对照组连续培养4周,细胞爬片免疫荧光法鉴定结蛋白desmin及心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)的表达,电镜观察诱导细胞的超微结构变化.结果5-aza化学诱导后MSCs形态变长、增大,排列更加紧密、整齐,5和10 μmol/L组可见较多的多核细胞,部分管状结构,诱导率分别为36%和31%,无显著性差异;3μmol/L组上述变化的细胞极少,3种浓度及对照组4周后细胞扩增数量分别为(3.81±0.40)×106、(3.76±0.62)×106、(3.67±0.80)×106及(2.90±0.21)×106,10μmol/L组增殖速度明显减慢(P＜0.05).各组诱导后的细胞均未见自发搏动.免疫组化提示desmin及cTnI表达阳性,5和10μmol/L组电镜下出现肌丝样结构、心房颗粒及细胞间的缝隙连接.结论小型猪MSCs经5、10 μmol/L 5-aza化学诱导可分化为心肌样细胞,其中5 μmol/L5-aza不仅可以诱导心肌样细胞而且对细胞增殖速度影响小.     

5-氮胞苷体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

目的: 研究5-氮胞苷（5-Aza）对培养人骨髓间充质干细胞（MSC）的作用,并对分化后的心肌样细胞进行鉴定。方法: 采用密度梯度离心法分离到骨髓单个核细胞（MB-MNC）,用含200 ml/L胎牛血清的低糖型DMEM培养液进行培养。采用差速贴壁法纯化MSC,用流式细胞仪检测细胞表面抗原。以5-Aza诱导第3代MSC 24 h后继续培养。培养4周,用免疫细胞化学染色法检测肌系标记抗原:α-肌动蛋白（α-actin）及心肌细胞特异性标记抗原:肌钙蛋白T（cTnT）;在透射电镜下观察细胞的超微结构。结果: MSC经5-Aza诱导分化后,可表达α-actin和cTnT,未经诱导的同培养天数的MSC中均未见表达。透射电镜可观察到肌丝等心肌细胞的特异性结构。结论: 5-Aza可诱导MSC分化为心肌样细胞。     

不同浓度5-氮胞苷对小鼠骨髓间充质干细胞的诱导作用

目的探讨5-氮胞苷（5-aza）对小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的最佳诱导浓度。方法分离2周龄小鼠胫骨、股骨,冲洗出骨髓,采用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心和贴壁培养的方法获得MSCs。取传第2代MSCs培养48h后分别加入3、5、10、20、50μmol／L5-aza进行诱导,设为3、5、10、20、50μmol／L组。继续培养3周后观察细胞形态变化,免疫细胞化学法检测心肌特异性蛋白α-actin表达。结果5-aza3、5μmol／L组α-actin阳性率分别为0．88％±0．52％、2．61％±0．96％,两组细胞形态均无明显改变;10μmol／L组可见细胞突起回缩,α-actin呈强阳性表达,阳性率为30．57％±1．82％;20、50μmol／L组细胞已脱落。结论MSCs经5-aza体外诱导分化,可获得形态类似、表达心肌特异性蛋白的心肌样细胞,且以10μmol/L浓度诱导作用最佳。     

5-氮胞苷诱导对骨髓间充质干细胞凋亡影响的实验研究

目的：研究5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)对体外培养的兔骨髓间充质干细胞(mensenchymal stem cell, MSC)凋亡的影响。方法：体外分离培养兔 MSC,用不同浓度5-aza 诱导不同时间,观察 MSC 凋亡情况。结果：正常培养兔 MSC 有轻度细胞凋亡；5-aza 诱导浓度达15μmol/L 时凋亡率明显增加(P＜0.01),当浓度达10μmol/L, 诱导时间延长则细胞凋亡率明显增加(P＜0.05),超过15μmol/L 时出现成片细胞死亡。结论：5-aza 诱导对体外培养兔骨髓间质干细胞有诱导细胞凋亡作用,其作用程度与诱导时间及浓度有关。     

心房利钠肽与心血管疾病的临床研究进展

心房利钠肽(ANP)是由28个氨基酸共同组成的一种多功能活性肽,是近年的临床研究热点。由于ANP在机体内功能众多,因而根据其功能的不同又称为利尿素、心钠素、血管舒张素和利钠素。ANP常用于临床利尿、利钠、调控细胞增殖、舒张血管平滑肌,有极佳的水、钠、血压维持效果,在心血管临床中使用广泛。本文对最新的ANP与心血管疾病临床研究进展进行了综述,以期为心血管临床ANP的使用提供参考依据。     

不同浓度的5-氮胞苷对人骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的影响

目的探讨不同浓度的5-氮胞苷（5-aza）对人骨髓间充质干细胞（hMSCs）向心肌细胞分化的影响。方法抽取人胸骨骨髓35 ml,采用密度梯度离心法和贴壁法进行hMSCs的分离培养。于第3代生长状态良好的hMSCs中,分别加入3、5、10、20和40μmol/L 5-aza处理24 h,更换新鲜的培养基继续培养;对照组的细胞始终用完全培养基培养。光镜下动态观察细胞形态的变化,4周后用免疫组化染色法检测心肌肌钙蛋白I（cTnI）、连接蛋白43（Cx43）的表达。结果经5-aza诱导处理后,hMSCs的形态变长、增大,排列更加紧密、整齐。免疫组化染色法检测表明,对照组与3μmol/L 5-aza组cTnI、Cx43的表达呈阴性,5、10、20和40μmol/L 5-aza组cTnI和Cx43的表达均呈阳性。在一定范围内（<10μmol/L的5-aza）,随着5-aza浓度的增加,hMSCs向心肌细胞的转化率逐渐增高;但高浓度（>10μmol/L）5-aza的毒性可造成细胞大量死亡。结论hMSCs经适当浓度的5-aza处理后,可向心肌细胞分化,10μmol/L的5-aza为最适诱导浓度。     

流体剪切力对5-氮杂胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响

目的观察5-氮杂胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,并探讨流体剪切力对诱导过程的影响。方法贴壁法从大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞,进行纯化传代培养,取第4代骨髓间充质干细胞以3、5、10、15及20μmol/L 5-氮杂胞苷分别作用12、24及48 h,用免疫荧光法鉴定分化的心肌样细胞α-肌动蛋白表达率,10μmol/L作用24 h为最佳诱导浓度。通过建立流体剪切力模型,设立以下四组:不加载流体剪切力组、加载5 dyn/cm2流体剪切力组、加载15 dyn/cm2流体剪切力组和加载25 dyn/cm2流体剪切力组,作用24 h,倒置显微镜观察诱导后骨髓间充质干细胞形态的变化,4周后逆转录聚合酶链反应测定分化的心肌样细胞心肌肌钙蛋白ImRNA的表达。结果骨髓间充质干细胞随着传代逐渐变成梭形,5-氮杂胞苷诱导后骨髓间充质干细胞胞体逐渐增大并伸出细长突起,部分相邻细胞的突起连接成网,形态学上表现出向心肌细胞方向转化的特征。免疫荧光显示α-肌动蛋白表达阳性。经过流体剪切力作用细胞后,心肌肌钙蛋白I的表达增高,阳性条带均比未进行力学刺激的细胞表达明显,以15 dyn/cm2剪切力最明显。但是25 dyn/cm2剪切力作用结果并没有随着力的增大而增大。结论 5-氮杂胞苷可以诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,5-氮杂胞苷可联合剪应力诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,且诱导效果优于单独使用5-氮杂胞苷。     

5-氮胞苷诱导间质干细胞为心肌细胞的实验研究

分离SD大鼠下肢骨,培养获得骨髓间质干细胞（MSCs）,经5-氮胞苷（5-aza）定向诱导24h后t用免疫细胞化学法检测诱导细胞对连接蛋白43和α横纹肌肌动蛋白的表达,用逆转录-聚合酶链反应鉴定心肌细胞特异性蛋白的表达情况。结果显示,MSCs经5-aza诱导后,细胞形态不规则;3周后5-aza 10μm组细胞连接蛋白43、α横纹肌肌动蛋白阳性表达;RT-PCR显示细胞表达心肌肌钙蛋白Ⅰ、α心肌肌动蛋白。提示5-aza可体外诱导MSCs分化为心肌细胞,用于心肌梗死的治疗。     

细胞代数与5-氮胞苷浓度对体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞定向分化的影响

目的探讨不同细胞代数与不同5-氮胞苷(5-Aza)浓度对体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌细胞定向分化增殖能力的影响。方法采用Percoll密度梯度离心法分离大鼠骨髓单个核细胞。选择第2代、第6代、第10代细胞,每代分为四组(三组为诱导组,一组为对照组),三个诱导组分别以5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L5-氮胞苷孵育24h后,与对照组以完全培养液连续培养5d。通过MTT法测取各代细胞诱导组与对照组第1天、第3天、第5天的OD值,计算三代细胞经不同浓度5-氮胞苷诱导后及对照组的增殖率。采用免疫细胞化学法检测各代MSCs经不同浓度5-氮胞苷诱导培养4周后心肌特异蛋白cTnT、α-Actin的表达。结果正常对照组第2代与第6代细胞增殖率无统计学意义(P0.05),与第10代细胞均有统计学意义(P0.05)。相同浓度药物诱导的三代细胞,第2代细胞与第6代、第10代细胞增殖率有统计学意义(P0.05),第6代、第10代细胞增殖率无统计学意义(P0.05)。不同5-氮胞苷浓度诱导的同代细胞间增殖率无统计学意义(P0.05)。经三种浓度5-氮胞苷诱导的2代、6代、10代MSCs均表达心肌特异蛋白cTnT、α-Actin,对照组表达为阴性。结论随着细胞代数的增加,药物浓度对细胞的增殖能力影响越来越小。经5-氮胞苷诱导的MSCs表达心肌特异蛋白cTnT、α-Actin,未经诱导的MSCs不表达心肌特异蛋白。     

慢性心力衰竭患者心钠素水平及与心功能关系的观察

目的探讨心钠素(ANP)在慢性心力衰竭发生与发展过程中的意义及与心功能的关系。方法选择35例慢性心力衰竭患者和32例正常对照,采用放射免疫法测定其血浆ANP水平,应用彩色多普勒超声心动图测定左心室收缩末期内径(LVSd)、左心室舒张末期内径(LNDd)、左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS)及心动周期中二尖瓣舒张晚期心室充盈峰速度(A)与二尖瓣舒张早期心室充盈峰速度(E)的比值(A／E),观察ANP水平与心功能之间的关系。结果心力衰竭患者血浆ANP水平比健康对照组明显升高(P<0．001),且随着心功能程度的不断加重,ANP水平逐渐升高．依次为心功能Ⅱ级<心功能Ⅲ级<心功能Ⅳ级(P<0．05-0．001)。ANP水平与LVEF、LVFS呈负相关,r值分别为0．76(P<0．01)、-0．72(P<0．01);与LVSd、LVDd及A／E呈正相关,r值分别为0．65(P<0．01)、0．79(P<0．01)、0．72(P<0．01)。结论慢性心力衰竭进展中,ANP水平与心力衰竭的严重程度密切相关,能够反映不同的心功能状态,为慢性心力衰竭的诊断与治疗提供参考依据。     

骨髓间质干细胞体外诱导为心肌细胞的实验研究

目的:探讨骨髓间质干细胞(MSCs)体外诱导分化为心肌细胞的可行性,为心肌梗死治疗提供理想的细胞材料。方法:分离大鼠下肢骨获取MSCs进行培养;5-氮胞苷(5-aza)诱导24h后继续培养;免疫细胞化学检测细胞对连接蛋白-43和α横纹肌肌动蛋白的表达;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)进一步了解心肌细胞特异性蛋白的表达。结果:MSCs经5-aza诱导后,细胞形态不规则;诱导后3周10μmol/L 5-aza组细胞连接蛋白-43、α横纹肌肌动蛋白表达阳性。RT-PCR显示10μmol/L 5-aza诱导后3周的细胞可表达心肌肌钙蛋白I、α心肌肌动蛋白。结论:MSCs体外经5-aza诱导后可分化为心肌细胞。     

骨髓间充质干细胞向心肌分化的实验研究

目的:研究骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)分化为心肌样细胞的能力,用于心肌补片治疗心肌梗死的研究。方法:分离C57/BSL小鼠BMSCs,全培养差速贴壁法,经过贴壁培养至第3代,流式细胞仪鉴定细胞表面标志(CD34、CD45、CD73、CD90),经10μmol/L的5-氮杂胞苷诱导细胞,24 h后更换完全培养基培养,2 w后进行免疫荧光染色,荧光显微镜观察心肌钙蛋白T(cTnT)和连接素蛋白43(CX43)的表达。结果:流式鉴定结果显示CD34、CD45阴性,CD73强阳性,CD90弱阳性。免疫荧光染色显示,诱导后细胞高表达心肌细胞特异性蛋白cTnT,连接素蛋白CX43表达水平明显增加。结论:5-aza可以诱导BMSCs大量表达心肌特异性蛋白cTnT和细胞连接素蛋白(CX43),干细胞分化为心肌样细胞,为干细胞移植治疗小鼠心梗提供种子细胞。     

成肌细胞表达异源心钠素基因的研究

目的研究成肌细胞表达异源心钠素(atrial natriuretic factor,ANF)基因的可行性,为其在心血管疾病中的应用提供依据.方法以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增人的心钠素基因,将其与质粒pcDNA3.0连接,构建质粒pcDNA3.0/ANF.将pcDNA3.0/ANF及对照pcDNA3.0分别转染体外培养的大鼠骨骼肌成肌细胞,筛选以获得稳定表达异源心钠素基因的细胞.收集筛选后的细胞培养基以放射免疫分析法检测心钠素的表达水平,第14d以定量PCR的方法检测成肌细胞内心钠素mRNA的水平.结果pcDNA3.0/ANF组重组心钠素的表达水平为174.19 52.43pg/ml,成肌细胞内mRNA含量(灰度值)为254.62 10.86,与对照组比较均有显著性差异,P＜0.01.结论成肌细胞可以表达异源心钠素基因,这一方法有可能应用于心血管疾病的基因治疗.     

5-氮胞苷诱导大鼠骨髓基质细胞表达β肾上腺素能受体的研究

目的 探讨5-氮胞苷对大鼠骨髓基质细胞β肾上腺素能受体(β受体)及其mRNA表达水平的影响。方法 体外分离培养大鼠骨髓基质细胞,以5-氮胞苷诱导24 h,正常培养3周,125I-Pindolol同位素放射配基法测定β受体密度,RT-PCR法测定其β受体mRNA表达水平,并与培养乳鼠心室肌细胞相比较。结果 正常培养大鼠骨髓基质细胞不表达β受体蛋白及其mRNA。5-氮胞苷诱导后的骨髓基质细胞表达β受体,随着5-氮胞苷浓度增加,骨髓基质细胞的β受体密度增加,至5×10-6mol/L时达最高峰;β受体密度随着培养时间延长而逐渐增加,于4周时接近正常心肌细胞水平。结论 5-氮胞苷诱导后,培养大鼠骨髓基质细胞表达β受体,并有明显的剂量和时间依赖性,分化后的细胞具有类似儿茶酚胺类激素的受体。     

骨髓干细胞移植与动员治疗心肌梗死的比较

目的对骨髓干细胞移植与粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员的自体骨髓来源的干细胞对大鼠急性心肌梗死动物模型的治疗作用进行比较。方法建立大鼠左冠状动脉结扎的心肌梗死模型,随机分为对照组,细胞移植组,动员剂组,移植组模型建立1w后再次开胸,于梗死区内注射经BrdU标记的骨髓基质干细胞。4w后观察移植细胞分化情况和促血管生成作用,并用超声检测心脏功能改变。结果细胞移植4w后,可以在坏死区内找到增殖的BrdU标记的移植细胞,另外Ⅷ因子染色可见移植组和动员剂组坏死区内有大量的血管新生,超声检查显示移植组及动员组心脏功能显著改善,两组均与对照组有显著性差异(P<0.05),且两者间又有显著性差异(P<0.01)。结论细胞移植和动员剂注射治疗,均能促进大鼠急性心肌梗死缺血区及其周边区域的毛细血管新生、改善心脏功能,而细胞移植效果更明显。     

罗格列酮对糖尿病大鼠心肌超微结构、心钠素mRNA表达的影响

观察链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠心肌超微结构的变化和心钠素mRNA的表达以及罗格列酮的作用，发现糖尿病大鼠心肌结构破坏，罗格列酮治疗可保持其机构与对照大鼠相似，同时使糖尿病大鼠心肌细胞表达的心钠素mRNA下降（6周1．14±0．05、10周1．12±0．09 vs 0．97±0．14，均P〈0．05），提示罗格列酮对糖尿病大鼠心肌超微结构有保护作用，且不依赖于血糖变化。