古核嗜热菌组蛋白基因多点突变的新方法

嗜热菌组蛋白基因序列中精氨酸密码子在大肠杆菌中的表达率极低，限制了组蛋白的大量获得。运用分子生物学技术，在传统PCR定点突变技术的基础上进行改进，参照古核嗜热菌组蛋白基因序列和大肠杆菌偏爱密码子表，设计了一对含有5个精氨酸突变密码子的单链DNA，全长为115nt，在3‘端有20nt互补序列。将单链DNA在94℃，45℃复性，使其互补结合，72℃进行延伸反应，得到含有突变位点的组蛋白基因；再以此基因为模板设计相应的一对引物进行PCR扩增反应，得到大量组蛋白突变基因。该研究为一些序列已知，片段较小基因的多态突变提供了一种简单、易行的方法。     

广西菲牛蛭水蛭素基因cDNA的克隆与序列分析

目的克隆广西菲牛蛭水蛭素基因的cDNA,并对该基因以及氨基酸进行序列分析。方法根据已发表的马尼拉菲牛蛭水蛭素基因cDNA设计一对引物,从广西菲牛蛭的头部提取总RNA后,采用RT-PCR扩增cDNA,将产物克隆至载体PMD-19T,PCR鉴定后进行测序。结果广西菲牛蛭水蛭素基因cDNA序列长度为251 bp,编码框由83个氨基酸组成,其中包括由20个氨基酸的信号肽,以及63个氨基酸组成的成熟肽。广西菲牛蛭水蛭素基因的氨基酸序列和已报道的广东菲牛蛭、马尼拉菲牛蛭水蛭素基因HM1、HM2基因的氨基酸序列相比较,同源性分别为94%,91.8%,84.7%。结论广西菲牛蛭水蛭素基因cDNA序列长度为251 bp,由83个氨基酸组成。     

水蛭素Ⅲ（HV3）基因的合成,克隆与鉴定

根据水蛭素Ⅲ（ＨＶ３）的氨基酸序列，设计并合成了六对（共１２条）互补寡核苷酸链。经退火配对、连接成完整的ＨＶ３编码基因（２２８ｂｐ），并克隆在载体ｐｉＵＣ１８中。通过α－互补及小量抽提质粒酶切鉴定筛得阳性重组克隆，其中ｐＵＣＨ３３经正、反向引物测序鉴定，与设计的序列完全符合。     

抗凝、溶栓双功能水蛭素12肽-瑞替普酶融合蛋白的模拟、构建与表达

将水蛭素12肽通过柔性肽(Gly)3与r-PA连接,以期望获得既具有抗凝活性,又具有溶栓活性的新型基因工程蛋白质分子。采用计算机辅助分子设计手段模拟了该融合蛋白的分子结构与其活性区可以正常发挥功能。构建并表达了兼有溶栓和抗凝活性的瑞替普酶(r-PA)与水蛭素12肽双功能融合基因。通过两轮加端PCR获得水蛭素12肽与r-PA通过柔性肽(Gly)3连接得到的融合基因,再克隆到pET-21a载体上,经测序正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,融合蛋白约占菌体总蛋白的12%,以包涵体形式存在,经过体外复性后,融合蛋白的纤溶比活达到8 400.5 IU/mg,抗凝比活达到930.2 ATU/mg,具有较高的溶栓抗凝双功能活性。该双功能融合蛋白有望成为治疗血栓疾病的新型药物。     

重组水蛭素Ⅲ的质量控制标准研究

通过测定重组水蛭素Ⅲ的质粒中目的基因序列、重组水蛭素Ⅲ分子质量、C末端序列以及菌体蛋白和DNA残留量，对重组水蛭素Ⅲ的质量进行研究。结果：重组质粒经Nhe Ⅰ、HindⅢ双酶切和基因序列测定，表明工程菌所携带的质粒上含有完整的信号肽基因、Nhe Ⅰ酶切位点、水蛭素HV3基因和HindⅢ酶切位点；还原性SDSPAGE结果表明在14000 u处有单一条带，为重组水蛭素Ⅲ二聚体；测定样品分子C端序列为E—D—Y—A—D—E—P—I—P—E—F，与重组水蛭素Ⅲ的理论值一致；重组水蛭素Ⅲ样品中的残留菌体蛋白和DNA含量分别是0．02％和每剂量样品中残留DNA含量低于2．8ng。结论：从基因水平、蛋白水平和杂质的角度证明重组水蛭素Ⅲ产品符合质量控制标准。     

基于分子生物学特异性扩增的方法鉴别菲牛蛭

目的：通过DNA条形码鉴定和建立特异性引物扩增的方法,有效区分菲牛蛭与其他水蛭品种。方法：通过聚合酶链式反应（PCR）对水蛭样品的COI序列进行扩增,利用MEGA 6.06软件通过建树法进行NJ树聚类分析,针对菲牛蛭素的编码基因序列、利用Primer Premier 5软件进行引物设计,对经设计、合成的8对引物通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳实验进行筛选,并确定特异性引物的最佳退火温度。结果：通过COI序列的NJ树聚类分析可以确定20批水蛭样品中的9批菲牛蛭样品,经过Primer Premier 5软件进行引物设计共选出8对引物进行合成,通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳预实验筛选出引物7、为最佳实验引物,且确定了引物7的最佳退火温度为49℃。结论：通过COI序列的DNA条形码研究,确定了样品中的菲牛蛭,通过特异性引物PCR扩增和电泳检测,有效地将菲牛蛭与其他水蛭样品进行区分,为菲牛蛭的分子生物学鉴定方法提供了参考。     

凋亡素基因的克隆及其原核表达

目的建立凋亡素基因克隆及原核表达的方法。方法根据已报道的鸡贫血病毒凋亡素基因设计合成一对引物 ,通过PCR扩增 ,构建重组质粒pUC18 VP3,将其与pET30质粒分别用限制性内切酶NdeⅠ、EcoRⅠ消化 ,构建原核表达载体pET30 VP3,用以转化感受态的E .coliDE3,经IPTG化学诱导表达 ,表达产物进行SDS PAGE电泳鉴定。结果凋亡素基因在E .coliDE3中获得了大量表达。结论该结果对凋亡素进一步开发为抗肿瘤新药具有重要意义。     

应用聚合酶链式反应技术快速鉴别中药水蛭

目的 建立聚合酶链式反应法(polymerase chain reaction,PCR)对中药水蛭进行快速种间鉴别。方法 根据中国药典项下3种水蛭(宽体金线蛭、日本医蛭及尖细金线蛭)CO1序列的差异设计并合成3对种属特异性引物,对其进行PCR反应条件优化;对不同批次的水蛭进行稳定性试验,并对同批次的水蛭进行灵敏度试验;利用优化的PCR条件对水蛭混合样品进行分析。结果 3对引物分别能在60,61,59℃的退火温度下扩增出1 000~2 000,1 000~2 000,3 000 bp左右的明亮条带,检测限分别为0.1,1,10 ng,并能够准确鉴别以不同比例混合的水蛭样品。结论 所设计的3对引物可以快速鉴别中药水蛭、常见伪品及混掺水蛭,并具有较高的种间特异性及良好的种内稳定性和灵敏度,可作为中药水蛭传统基原鉴别方法的补充,为其质量控制提供更多参考。     

人体β-防御素-3突变基因的构建及在大肠埃希菌中的融合表达

目的从人正常皮肤组织中提取β-防御索-3基因进行定点突变后在E．coli中融合表达。方法从人正常皮肤组织中提取总RNA，经RT-PCR扩增得到编码β-防御素-3成熟肽的cDNA序列，测序正确后，寻找合适的突变位点，设计含突变位点的引物，用PCR重叠延伸法对β-防御素-3成熟肽cDNA序列进行定点突变，将突变产物克隆至pUC18进行序列测定及在E．coli中融合表达。结果测序结果表明，经RT—PCR所得的β-防御素-3成熟肽序列与GeneBank中报道的编码人β-防御索-3成熟肽的cDNA序列完全-致。经过突变β-防御素-3成熟肽第29位谷氨酰胺密码子由CAG突变为精氨酸密码子CGA，其余核苷酸序列均未发生变化。将突变β-防御素-3基因在E．coli中诱导表达3～5h后可见突变β-防御素-3蛋白表达。结论成功构建并表达了β-防御素-3突变体基因，为进-步对突变体进行真核表达、生物活性研究奠定了基础。     

多形类杆菌的分子生物学鉴定

目的用聚合酶连反应技术(PCR)鉴定多形类杆菌。方法采用16S rRNA基因序列为靶基因设计引物,建立PCR反应体系对该种细菌进行鉴定,并测定PCR产物序列,验证PCR反应的特异性。结果3株多形类杆菌能被扩增,其他菌株和基因组不能被扩增;所测得的PCR产物序列和标准的多形类杆菌16S rRNA基因序列99%同源。结论建立PCR反应体系能特异地鉴定多形类杆菌。     

重叠延伸PCR方法的建立与应用

目的建立一种新型PCR技术（重叠延伸PCR）并用于腺病毒早期基因E1A与内核蛋白体进入位点IRES（internal ribosome entry site）的直接连接,为构建复制型腺病毒载体作准备.方法以PcAE1A质粒与PIRES-EGFP质粒为模板,通过引物设计,使E1A基因3＇端与IRES基因5＇端具有相互重叠的一段序列,用该组引物行PCR分别扩增E1A基因与IRES基因,再以这两种PCR产物的混合物作为模板,进行重叠延伸PCR扩增E1A-IRES基因片段.结果经酶切及测序鉴定重叠延伸PCR方法成功构建了E1A-IRES基因片段.结论重叠延伸PCR法能将任意两段DNA序列连接起来,其在分子生物学的领域中具有潜在应用价值.     

鼠肺组织直接用于汉坦病毒S基因序列分析

目的：应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、核苷酸序列分析等技术，尝试建立一种可直接从鼠肺标本中进行汉坦病毒基因分析的方法。方法：提取经免疫荧光法检测汉坦病毒抗原阳性的鼠肺细胞总RNA，经逆转录获取病毒cDNA．纯化，克隆于pMD-18T载体，测定S基因片段核苷酸序列。结果：采用RT—PCRT／A克隆技术成功地从鼠肺组织中扩增出汉坦病毒S基因全序列，序列长为1701nt。只有一个编码N蛋白的开放读码框架（ORF），起始密码子为第37nt，终止于1326nt，推导其编码的蛋白长为429个氨基酸。与该标本分离株（简称TJJ16毒株）S基因的全序列相一致。结论：该方法可对汉坦病毒抗原检测阳性而病毒分离阴性的鼠肺标本进行分子生物学特征性分析，从而建立一种对汉坦病毒在宿主间的流行情况分析的方法。     

Construction and in vitro testing of a novel fab-hirudin-based fusion protein that targets fibrin and inhibits thrombin in a factor xa-dependent manner

Fibrin targeting of the thrombin inhibitor hirudin via chemical coupling is effective in vitro and in vivo. However, since chemical coupling has limitations, a recombinant approach was taken to improve the fibrin-targeting ability of hirudin. Additionally, to activate hirudin selectively at the target area and thereby limit side effects in an in vivo setting, the authors aimed to construct an inactive precursor molecule that is converted into an active thrombin inhibitor only upon cleavage by factor Xa. Using PCR, the coding region for hirudin was fused to parts of the genomic DNA of the IgG heavy chain that was cloned from the antifibrin antibody-producing hybridoma cell line 59D8. Additionally, a factor Xa recognition site was introduced between the antibody and the hirudin sequence. The fusion construct was then transfected into a heavy-chain loss variant of the hybridoma cell line 59D8. After selection of stable hybridoma clones, the expressed fusion protein was evaluated for its molecular size (57 kd) and its binding ability to the fibrin-specific peptide Bbeta 15-22. The cleavage of the fusion protein by factor Xa was demonstrated by HPLC. The recombinant anticoagulant revealed antithrombin activity only after cleavage by factor Xa. Thus, the newly designed hirudin fusion protein revealed the anticipated functions in vitro. Further experiments are needed to prove whether this precursor anticoagulant allows a highly clot-specific and efficient thrombin inhibition in vivo.     

多拷贝水蛭素基因在毕赤酵母中的分泌型表达

目的:通过多拷贝克隆技术实现水蛭素(Hirudin)基因在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达.方法:利用基因重组技术,从pPIC9-Hirudin中扩增α-facor-Hirudin插入到载体pA0815中,并构建pA0815-(α-Hirudin)n多拷贝重组质粒,转化毕赤酵母GS115后进行诱导表达,并鉴定表达产物活性.结果:PCR证实成功构建了水蛭素多拷贝毕赤酵母表达载体pA0815-(α-Hirudin)n,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实能成功高效分泌重组水蛭素,活性测定表明表达的水蛭素有良好的抗凝血活性.结论:成功构建了分泌型水蛭素多拷贝质粒,筛选出多拷贝稳定整合表达菌株,成功表达出具有抗凝血活性的1 600 ATU/mL重组水蛭素,为大规模表达纯化水蛭素蛋白及其临床应用奠定了基础.     

人心肌肌钙蛋白IcDNA的克隆及分泌表达

克隆人心肌肌钙蛋白I(cTnI)基因全序列，并进行分泌表达。从人心肌组织提取总RNA，经逆转录得到cDNA第一链，以此为模板，PCR扩增目的条带，重新设计上游引物，用相同PCR程序完成点突变；突变后PCR产物克隆入Pfd5载体，并用PCR、SpeI XhoI双酶切、载体测序等方法鉴定；用ITPG诱导cTnI的表达。PCR扩增出630bp左右条带，Pfd5—cTnI融合表达载体用PCR、SpeI Xho1双酶切均可见630bp左右条带，测序结果与预期序列一致；诱导后培养基及细胞周质均检测到cTnI蛋白免疫原活性。人心肌肌钙蛋白I得到成功表达。     

猪源致病性沙门氏菌四环素耐药基因tetC的PCR扩增及序列分析

本研究对16株猪致病性沙门氏菌的四环素耐药性进行了检测，结果表明，沙门氏菌对四环素类抗生素产生了广泛的耐药性，耐药率达100％。对四环素耐药基因tetC进行PCR扩增，结果在12株沙门氏菌的质粒上扩增出特异性产物，与药敏试验结果阳性符合率75％，具有较高的检出率；序列分析结果表明tetC的核苷酸同源率较高，达97．7％～98．7％，建立tetC基因的PCR检测技术，为沙门氏菌对四环素耐药性的分子流行病学监测提供了有效的途径。     

鼻咽癌中EB病毒LMP1基因的序列变异发生机制探讨

目的检测贵州省鼻咽癌中EB病毒LMP1基因N-和C-末端区序列变异的热点,并探讨其产生的机制。方法收集贵州省贵阳医学院有明确病理诊断的鼻咽癌患者鼻咽新鲜活检标本30例。采用巢式聚合酶链反应（PCR）扩增EB病毒LMP1基因N-和C-末端区,用Xho I对N-末端区扩增产物进行酶切分析,从中选取2例患者N-末端区的扩增产物进行序列分析。同时检测C-末端区扩增产物30bp缺失的情况。结果30例鼻咽癌组织EB病毒LMP1基因C-末端区存在两种基因型：缺失型（即30bp缺失）和野生型,其中病例组有40％的突变率,对照组有10％的突变率,差异有显著性（P〈O．05）。在本次研究中的30例鼻咽癌及随机收集贵阳医学院体格检查健康成人30例的外周血（EDTA抗凝）2mL作对照组中EB病毒LMP1基因N-末端区都发生了突变,都存在原有酶切位点的缺失。结论鼻咽癌中EB病毒LMP1基因突变在鼻咽癌的发生发展中起重要的作用。     

人巨细胞病毒pp65基因片段毕赤酵母表达载体的构建

目的 构建人巨细胞病毒pp65基因片段毕赤酵母表达载体.  方法   PCR扩增pp651087-1515 nt,克隆于pMD19-T载体,转化大肠杆菌DH5α.提取质粒测序鉴定后,与pPIC9K载体连接,转化DH5α,筛选阳性克隆,酶切及测序鉴定.   结果  获得了重组酵母表达载体pPIC9K-pp65,测序结果证实为pp65 1087-1515 nt基因,与基因库报道序列一致.  结论 构建得到人巨细胞病毒pp651087-1515 nt毕赤酵母表达载体.     

天花粉蛋白诱导细胞凋亡相关基因表达

目的　观察细胞凋亡相关基因的表达。方法　天花粉蛋白诱导Ｕ９３７细胞凋亡后,用锚定引物和随机引物进行差异显示逆转录ＰＣＲ反应,回收差异条带,进行ＲＮＡ点杂交。用细胞凋亡时高表达的差异片段筛选胎肝ｃＤＮＡ文库,随后测序,行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交。结果　用细胞凋亡时高表达的差异片段筛选胎肝ｃＤＮＡ文库,获得一个１－４ｋｂ的ｃＤＮＡ克隆,该ｃＤＮＡ序列中部分碱基与人Ｂｒｕｔｏｎ○ｓ酪氨酸激酶高度同源。用１－４ｋｂｃＤＮＡ进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交证实该基因在细胞中有３个转录本存在,其中０－７ｋｂ的ｍＲＮＡ在凋亡细胞中高表达。同时观察到Ｄｒｇ １基因高表达。结论　用差异显示逆转录ＰＣＲ方法结合ｃＤＮＡ文库筛选,寻找到１－４ｋｂ的ｃＤＮＡ片段,部分序列与Ｂｒｕｔｏｎｓ酪氨酸激酶高度同源,是与细胞凋亡有关的新基因的部分片段。凋亡相关基因Ｄｒｇ １在天花粉蛋白诱导Ｕ９３７细胞凋亡时高表达。