聚乙烯醇/柞蚕丝素蛋白材料作为肌腱组织工程支架材料的初步研究

目的检测聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)/柞蚕丝素蛋白(wild antheraea pernyi silk fibroin,WSF)电纺膜与肌腱细胞的细胞相容性,探讨其作为肌腱组织工程支架材料的可行性。方法以质量分数为98%的甲酸为溶剂,配制浓度均为11%的WSF溶液、PVA溶液及PVA/WSF(质量配比为9∶1)溶液,采用电纺丝技术制备WSF、PVA及PVA/WSF电纺膜,扫描电镜观察电纺成丝情况。取5只3日龄SD大鼠尾腱,体外分离培养肌腱细胞并传至第3代进行实验。取浓度为1×106个/mL肌腱细胞分别与PVA及PVA/WSF电纺膜复合培养,4、12 h采用MTT法测量细胞黏附率。取浓度为4.5×103个/mL肌腱细胞,分别于PVA、1/2 PVA、1/4 PVA、PVA/WSF、1/2 PVA/WSF、1/4 PVA/WSF电纺膜浸提液中培养,MTT法测定培养1、3、5、7 d的吸光度(A)值,并进行毒性等级评价。取PVA、PVA/WSF电纺膜分别与细胞密度为1×106个/mL的肌腱细胞悬液100μL复合培养制备细胞-材料复合物,7 d后行HE染色观察,1、3、5、7 d行扫描电镜观察。结果 WSF甲酸溶液无法电纺成丝,PVA和PVA/WSF甲醛溶液均可成功电纺成丝。肌腱细胞与PVA、PVA/WSF电纺膜复合培养4 h后,其细胞黏附率分别为26.9%±0.4%、87.0%±1.0%,差异有统计学意义(t=100.400,P=0.000);复合培养12 h后,其细胞黏附率分别为35.2%±0.6%、110.0%±1.7%,差异有统计学意义(t=42.500,P=0.000)。体外浸提液毒性评价结果显示,培养后1、3、5、7 d各种电纺膜间细胞A值比较,差异均有统计学意义(P<0.05);1/2 PVA和1/4 PVA浸提液细胞毒性等级差异有统计学意义(P<0.05)。细胞-材料复合物的组织学及扫描电镜观察显示肌腱细胞均可黏附于PVA、PVA/WSF电纺膜表面,但PVA/WSF电纺膜上细胞较多。结论 PVA/WSF电纺膜支架材料具有良好的细胞相容性,有望成为肌腱组织工程的理想支架。     

壳聚糖-藻酸盐多通道支架材料细胞相容性研究

[目的]通过体外细胞毒性试验,细胞与支架材料复合培养实验和体内植入试验,评价壳聚糖-藻酸盐支架材料的细胞相容性。[方法]通过冷冻干燥法制备具有纵行、平行排列通道的壳聚糖-藻酸盐支架材料。将大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow derived stromalcell,BMSCs)与其浸提液培养,采用MTT法检测培养1、3、5d时支架材料的细胞毒性。在体外将BMSCs与壳聚糖-藻酸盐支架材料复合培养3、5、7d后行扫描电镜检测,并将其植入急性脊髓半横断损伤模型中,6周后行免疫荧光检测BMSCs在材料中的生长与分化情况。[结果]MTT法检测示壳聚糖-藻酸盐支架材料的细胞毒性为0-1级。扫描电镜观察细胞在支架材料复合培养3d后即可粘附于支架材料表面,细胞呈一定方向排列。术后6周,Neurofilament200、NSE免疫荧光检测证实,支架材料内有大量BMSCs存活,部分向神经元样细胞分化。[结论]壳聚糖-藻酸盐支架具有良好的细胞相容性,有望成为一种较理想的神经组织工程支架材料。     

脱细胞羊膜的制备及其生物相容性研究

目的制备脱细胞人羊膜(HAAM),检测其细胞相容性和组织相容性,探讨其作为组织工程支架材料的可行性. 方法新鲜人羊膜经漂洗后戊二醛交联,0.5%SDS震摇24小时,胰蛋白酶消化4小时,充分漂洗,冷冻干燥,分装,环氧乙烷消毒备用.倒置相差显微镜和扫描电镜观察表面结构,测量孔径,并作HE、Mallory染色.体外培养人成纤维细胞并复合于HAAM,倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞的黏附、生长,四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定HAAM浸提液对培养的人成纤维细胞的细胞毒性.将HAAM植入SD大鼠背部皮下,观察其组织相容性. 结果 HAAM的一面为网状结构,孔径为10～80 nm,另一面为致密纤维结构.HE、Mallory染色表明材料无细胞残留,均为胶原组成.成纤维细胞能在HAAM上黏附、增殖.MTT示材料细胞毒性为0或1级,动物埋置实验无异常反应. 结论应用去垢剂-酶消化法处理新鲜人羊膜,能有效去除组织中的细胞和可溶性成分,可进一步降低其免疫原性,保留基质及网状结构,有良好的细胞相容性和组织相容性,可作为组织缺损的修复材料及组织工程的膜支架材料.     

聚羟基烷酸酯与绵羊骨髓基质干细胞相容性的研究

目的评价聚羟基烷酸酯(PHBV)作为组织工程支架与绵羊骨髓基质干细胞(BMSCs)的生物相容性。方法原代培养绵羊BMSCs,传至2～3代后,接种至PHBV膜和泡沫样三维支架上,光镜和扫描电镜观察细胞形态,计数1、2、6 h时的细胞黏附率;并以接种至培养板上细胞为对照组,每日细胞计数,绘制生长曲线;按培养液量与支架体积10 mL／cm3为标准浓度制备浸提液,并制备标准浓度1／16～16倍的浸提液,以MTT法检测细胞毒性;流式细胞仪分析接种到材料上的细胞周期,计算增殖指数;BMSCs接种于PHBV三维支架上4、8、12 d,以Hoechst33258荧光法定量测定细胞内DNA含量, BCA法测定蛋白质含量。结果第3代BMSCs接种至PHBV膜上2 h后即大部黏附,黏附率75．6％,与对照组相比差异无统计学意义,绘制生长曲线见细胞生长与对照组无差异;MTT法检测见9个浓度梯度的浸提液毒性均为0级;光镜和扫描电镜观察见细胞接种于PHBV膜上2 h后大部分黏附,3 d后伸展良好,呈纺锤形或梭形,在三维支架的孔隙内立体生长,1周开始细胞间连接,3周广泛连接,分泌大量基质;流式细胞分析见接种于材料上的细胞周期无变化;接种至PHBV三维支架上的细胞内DNA、蛋白质浓度与对照组比较无差异。结论PHBV作为BMSCs的组织工程支架材料,具有良好的生物相容性。     

聚乳酸-聚羟基乙酸/Ⅰ型胶原复合支架的生物相容性研究

目的观察聚乳酸-聚羟基乙酸(poly-lactide-co-glycolide,PLGA)/Ⅰ型胶原复合支架的生物相容性,探讨其作为组织工程阴道支架的可行性。方法取经多聚赖氨酸包被的PLGA置于含0.25%Ⅰ型胶原的醋酸水溶液,制备PLGA/Ⅰ型胶原复合支架。取10~12周龄雌性SD大鼠阴道组织,采用酶消化法分离培养阴道上皮细胞,取第2代细胞进行实验。取复合支架浸提液培养阴道上皮细胞,观察材料细胞毒性。将阴道上皮细胞与复合支架共培养48 h(实验组),检测细胞黏附率;以单纯PLGA支架接种细胞作为对照组。将细胞-支架复合物埋植至SD大鼠皮下,于2、4、8周取材行HE染色、免疫组织化学染色,观察细胞在支架上生长情况。将细胞-支架复合物移植至6只切除阴道组织的SD大鼠阴道部位,于术后3、6个月观察阴道生长情况,6个月后取阴道组织进行组织学观察。结果大鼠阴道上皮细胞在PLGA/Ⅰ型胶原复合支架材料浸提液中生长、增殖良好,细胞毒性为1级。实验组细胞黏附率为71.8%±9.2%,显著高于对照组的63.4%±5.7%(t=2.195,P=0.005)。阴道上皮细胞能在PLGA/Ⅰ胶原复合支架材料上黏附、生长;大鼠皮下埋植2周后,细胞在支架孔隙内生长增殖,成纤维细胞生长;4周支架材料表面形成1~3层上皮;8周后支架材料部分降解,上皮层次增加,呈极性排列,角蛋白免疫组织化学染色呈阳性。细胞-支架复合物原位移植3个月后,大鼠阴道黏膜呈粉红色,有光泽,支架材料大部分降解;6个月时阴道深约1.2 cm,无明显狭窄,阴道黏膜外观类似正常阴道黏膜,皱襞较少,组织学观察示上皮层与正常阴道无明显区别,基底层可见钉状突起,数量少于正常阴道,角蛋白免疫组织化学染色呈阳性。结论 PLGA/Ⅰ型胶原复合支架具有良好的生物相容性,可作为构建组织工程阴道的支架材料。     

新型脱细胞骨基质-壳聚糖复合支架的生物相容性研究

[目的]评价新型脱细胞骨基质-壳聚糖(ABECM/CS)骨组织工程复合多孔支架的生物相容性和安全性,为临床应用提供实验依据.[方法]采用联合脱细胞方法对猪股骨进行处理后制备脱细胞骨基质/壳聚糖骨组织工程复合支架.分离、培养兔骨髓间充质干细胞传代后进行实验.采用MTT法观察材料浸提液于1、3、5、7d时进行细胞毒性实验观察细胞的活性;将材料浸提液与稀释血混合离心后观察红细胞溶血情况,检测OD值计算相对溶血率;将材料浸提液经静脉注入兔体内进行热原实验,在规定时间内观察兔体温变化.[结果]细胞毒性实验显示,培养1、3、5、7d后各时间段内三组OD值两两比较(P＞0.05)无显著差异,表明材料无毒性.在溶血实验中观察实验材料的溶血率为3.0％,在标准值溶血率5％范围内,提示无溶血现象发生.热原实验结果显示每只兔体温升高均低于0.6℃,且3只兔体温升高总度数低于1.4℃,符合热原检测规定,复合材料无致热作用.[结论]经联合脱细胞处理制备的ABECM/CS复合支架无细胞毒性、无溶血反应、无热原性,具有良好的生物相容性和安全性,可作为构建组织工程骨的支架载体材料.     

聚己内酯/壳聚糖与聚己内酯/聚乳酸支架与人脂肪来源干细胞的生物相容性研究

目的对比人脂肪来源干细胞(Human adipose derived stem ceils,hADSCs)与聚己内酯/聚乳酸(Polycaprolactone/Polylactide,PCL/PLA)和聚己内酯/壳聚糖(Polycaprolactone/chitosan,PCL/CS)复合支架的生物相容性,为进一步体内组织修复提供依据。方法体外分离、培养和扩增hADSCs,分别制备PCL/PLA、PCL/CS复合支架,扫描电镜观察支架材料的表面情况。取材料浸提液培养hADSCs,CCK-8法检测细胞活力,评价支架的细胞毒性。hADSCs传代扩增后,接种到支架材料上,裸鼠皮下培养2周,HE染色观察细胞在支架上的生长情况。结果 hADSCs与成纤维细胞相似,呈"梭形",并以集落形式生长。扫描电镜观察PCL/CS孔径在100μm左右,孔隙率为88.76%,而PCL/PLA支架孔径则在40μm左右,孔隙率为91.45%。hADSCs在PCL/CS浸提液中培养1、3、7天的相对增殖率分别为98.6%、101.6%、110.3%,而PCL/PLA组为98.1%、100.7%、108.4%,说明hADSCs在两种浸提液中均保持较高的增殖率,即两种合成支架均无细胞毒性。hADSCs复合两种支架体内培养后,HE染色后可见有大量细胞长入PCL/CS支架内部,同时免疫组化HLA-Ⅰ检测发现,支架材料内部分细胞阳性表达,说明PCL/CS支架内该部分的细胞来源于人,即hADSCs。而在PCL/PLA内部渗透进入的细胞不如PCL/CS支架组。结论 PCL/CS和PCL/PLA支架安全无毒,hADSCs在PCL/CS支架上显示更好的细胞相容性,该支架可以作为hADSCs的载体材料,用于组织工程膀胱修复的研究。     

人脂肪来源干细胞与左旋聚乳酸/聚己内酯支架的体内外生物相容性研究

目的观察人脂肪来源干细胞(Human adipose-derived stem cells,hADSCs)在左旋聚乳酸/聚己内酯(Poly-Llactide/Polycaprolactone,PLLA/PCL)复合支架材料中的生长情况及其生物相容性。方法体外分离、培养和扩增hADSCs,制备PLLA/PCL复合支架。取PLLA/PCL浸提液培养hADSCs,CCK-8法检测细胞活力,评价支架的细胞毒性。hADSCs传代扩增后,接种到PLLA/PCL支架材料上。体外培养1周,裸鼠皮下分别培养1周、2周,HE染色观察细胞在支架上的生长情况。免疫荧光检测裸鼠体内复合支架材料内细胞平滑肌肌动蛋白(Smooth muscle actin,SMA)表达情况。结果hADSCs在PLLA/PCL浸提液中可保持较高的增殖率,表明PLLA/PCL浸提液无细胞毒性。hADSCs接种于PLLA/PCL支架上,经体外、体内培养后,均能长入PLLA/PCL支架的孔隙内,且体内培养比体外培养有更多的细胞长入支架内部。经体内培养后,复合细胞的支架比单纯支架有更多的细胞渗入支架内部。细胞材料复合物体内培养2周后,免疫荧光检测发现,支架材料内部分细胞SMA表达阳性。结论 PLLA/PCL复合支架材料,安全无毒,与hADSCs生物相容性好,可作为种子细胞的载体用于组织工程膀胱缺损修复的研究。     

骨骼肌无细胞基质的制备及其生物相容性研究

目的细胞外基质是脂肪组织工程材料的研究热点之一。通过探讨骨骼肌无细胞基质的制作方法及生物相容性,为其在脂肪组织工程中的应用奠定基础。方法取健康成年小香猪新鲜骨骼肌组织,横切成厚2～3 mm的组织块,采用低渗-去垢剂法脱细胞处理。处理后采用HE染色、Masson三色染色、免疫组织化学染色及扫描电镜检测骨骼肌无细胞基质是否有细胞成分残留,并观察其基本结构;应用MTT法检测骨骼肌无细胞基质细胞毒性。取乳腺癌患者自愿捐赠脂肪组织,分离培养人脂肪干细胞(human adipose-derived stem cells,hADSCs),从形态学、流式细胞学和成脂、成骨分化能力方面进行鉴定。将骨骼肌无细胞基质与第3代hADSCs共培养,于培养后第1、3、5、7天通过细胞活性检测材料上细胞黏附、扩散和增殖情况,了解其与细胞之间的相互作用。结果 HE、Masson、免疫组织化学染色及扫描电镜观察显示骨骼肌无细胞基质肌纤维去除完全,无细胞核残留,基质结构保留完整;大量连接成网状的胶原纤维呈多孔隙样结构,规则排列。MTT检测示骨骼肌无细胞基质细胞毒性为1级,细胞相容性好。细胞活性检测示hADSCs在骨骼肌无细胞基质上能很好地伸展,且能与周围基质黏附,进入基质内部并相互交织。结论经脱细胞处理的骨骼肌无细胞基质具有良好生物相容性,可能作为脂肪组织工程的支架材料。     

人舌黏膜上皮细胞体外构建组织工程尿道的初步研究

目的 探索人舌黏膜上皮细胞和脱细胞支架体外复合构建组织工程尿道的可行性.方法 前尿道狭窄患者10例,手术切取0.5 cm×0.8 cm大小舌黏膜组织,分离获得舌黏膜上皮细胞,AE1/AE3抗体行细胞免疫荧光鉴定.收集第3代上皮细胞,按1×107/ml密度分别接种于脱水BAMG支架、液体保存BAMG支架以及4层脱细胞基质(SIS)支架表面,体外培养7d后行HE及扫描电镜检测.结果 10例患者术后1个月未出现舌部相关并发症.14 d后原代舌黏膜上皮细胞融合达90％～95％并呈典型的“鹅卵石”状生长.第3代时增殖速度达顶峰,平均7d达到90％～95％融合,第4代开始细胞逐渐老化.HE及扫描电镜检测液体保存BAMG支架表面仅复合极少量细胞,脱水BAMG以及SIS支架表面可见明显多层上皮细胞覆盖,其中4层SIS支架内部可见局部细胞浸润性生长迹象 结论 人舌黏膜上皮细胞可以作为组织工程尿道上皮种子细胞来源之一,与脱水处理后的SIS和BAMG有很好的组织相容性和黏附能力,二者的有效复合可以构建适合尿道修复重建需要的组织工程替代材料.