人COX-2基因反义真核表达载体的构建及对SGC-7901细胞增殖的影响

背景与目的： 构建人COX-2基因反义真核表达载体,研究COX-2基因对人胃癌细胞株SGC-7901增殖的影响。 材料与方法： 采用分子克隆技术,用EcoR Ⅰ从含人全长COX-2基因的质粒pBOSNeoCOX-2中切下含COX-2 cDNA的目的片段,然后分别在其两端添加EcoR Ⅰ和Bgl II酶切位点,酶切后将该片段按正、反两个方向插入真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点中,琼脂糖凝胶电泳法对重组子进行鉴定,脂质体法将重组质粒转染到人胃癌细胞株SGC-7901中, MTT法检测转染反义COX-2基因的表达载体后SGC-7901细胞增殖的变化。 结果： 经酶切鉴定,正、反义目的片段成功地连接到pIRES2-EGFP中,COX-2基因正、反义真核表达载体成功构建,转染后在SGC-7901细胞中稳定表达,反义COX-2基因真核表达载体转染SGC-7901细胞后能抑制其增殖。 结论: 成功构建人COX-2基因反义真核表达载体, 反义COX-2基因能抑制SGC-7901细胞增殖。     

Survivin反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 为了特异封闭白血病细胞survivin的表达，抑制其功能，本实验构建了survivin反义核酸载体并导入白血病细胞系中。方法 应用RT—PCR获得survivin的cDNA片段，反向插入pcDNA3质粒载体中；经限制性酶切和测序鉴定所构建的反义核酸是否正确；采用电转染方法将重组体导入HL—60细胞中；RT—PCR技术检测转染细胞survivin表达的变化。结果 经限制性酶切和测序鉴定证明survivin反义核酸已成功构建；RT—PCR产物电泳结果显示，与转染前细胞、空质粒转染细胞相比，转染survivin反义核酸的细胞survivin mRNA水平明显降低。结论 本实验已成功建立了survivin反义核酸真核表达载体，而且在白血病细胞系中发挥了特异封闭作用，为进一步研究survivin反义核酸在白血病治疗中的作用提供了实验基础。     

COX-2反义寡核苷酸对胰腺癌PC-3细胞株COX-2 mRNA和蛋白表达的影响

目的探讨环氧合酶(COX)-2反义寡核苷酸(ODNs)对胰腺癌PC-3细胞株COX-2 mRNA和蛋白表达的影响,并进一步阐明COX-2反义ODNs基因治疗胰腺癌的可行性.方法设计和合成COX-2反义ODNs,体外转染胰腺癌PC-3细胞,然后通过荧光显微镜、RT-PCR及Western blotting证实转染效果. 结果转染COX-2反义ODNs后,PC-3细胞COX-2 mRNA和蛋白表达均下降,且体现出一定的剂量和时间依赖性关系. 结论 COX-2反义ODNs转染胰腺癌PC-3细胞株后,可下调细胞中COX-2 mRNA和蛋白表达,COX-2反义ODNs有可能达到胰腺癌基因治疗的效果.     

反义PTTG真核表达载体对人卵巢癌细胞SK-OV-3恶性表型的抑制作用

背景与目的:垂体肿瘤转化基因(pituitarytumortransforminggene,PTTG)是一个新的原癌基因,具有多种促肿瘤生长与转移的作用。目前研究多集中于PTTG在各种肿瘤组织中的表达及其相关的调控机制,而针对其反义阻断可能性的报道较少。本研究中,我们通过构建携带能够表达全长反义PTTGmRNA的真核表达载体,观察其对人卵巢癌细胞株SK-OV-3的反义阻断效应。方法:利用含酶切位点的PCR引物克隆全长PTTG,反向插入真核表达载体pcDNA3.1;用脂质体将重组载体转染SK-OV-3细胞,G418筛选阳性克隆后,Westernblot检测PTTG蛋白和碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)表达的改变,MTT法检测细胞增殖情况,并利用软琼脂糖集落形成实验观察细胞生物学性状的变化。结果:筛选出稳定表达重组pcDNA3.1-PTTGas的SK-OV-3细胞;转染细胞组较未转染细胞组的PTTG、bFGF表达分别减少了61.5%和52.3%;转染细胞增殖明显增强;转染细胞在软琼脂中的集落形成数(2.4±0.8)明显低于未转染组和转染空白质粒对照组(23.3±5.7和21.5±7.9)(P<0.01)。结论:反义PTTG真核表达载体作为一种新的工具,为针对PTTG的肿瘤基因治疗提供了可能性。     

COX-2与淋巴结转移对宫颈癌预后影响的研究

目的：研究环氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）及淋巴结转移对宫颈癌预后的影响。方法采用免疫组化SP法,检测95例宫颈癌患者中COX-2的表达情况,并采用生存分析法评估COX-2表达与淋巴结转移对宫颈癌预后的影响。结果 COX-2在95例宫颈癌中的阳性表达率为65.26%（62/95）,COX-2的阳性表达与淋巴结转移、宫旁或脉管浸润呈正相关（r=0.220,P=0.032;r=0.215,P=0.037）。生存分析显示,COX-2阳性表达（P=0.005）、淋巴结转移（P=0.000）与宫颈癌患者的预后密切相关。结论 COX-2及淋巴结转移是宫颈癌患者预后的独立影响因素,对判断预后及指导治疗具有重要的临床价值。     

Survivin反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

恶性肿瘤无限增殖的主要原因是细胞凋亡调控障碍.Survivin是新近发现的凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis protein,IAP)成员[1],特异性表达人类多种常见肿瘤中,而不存在于正常成人组织,能抑制caspase活性而发挥抗凋亡作用[2].有研究表明[3-4],应用反义策略阻断survivin表达可提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,诱导凋亡的发生,已成为肿瘤治疗的新亮点.     

胃癌组织中COX-2和VEGF表达及其相关性研究

目的探讨环氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)和血管内皮生长因子(vascularendothelial growthfactor,VEGF)在人胃癌组织中表达及其相关性。方法应用免疫组织化学SABC法检测53例人胃癌组织中COX-2、VEGF和CD34的表达,并以40例正常胃粘膜标本作为对照。对CD34阳性血管进行微血管密度(microvesseldensity,MVD)计数。对COX-2和VEGF的表达采用半定量计分法判定,并结合临床资料进行统计学分析。结果53例人胃癌组织中,COX-2表达阳性者44例,阳性率为83.0%;VEGF表达阳性者45例,阳性率为84.9%。COX-2表达与VEGF表达相关显著(P<0.05)。并且,COX-2和VEGF的表达与TNM分期(P<0.05,P<0.05)、淋巴结转移(P<0.01,P<0.05)和远处转移(P<0.01,P<0.05)相关。COX-2/VEGF同高表达组中MVD值(79.5±25.8)高于COX-2/VEGF同低表达组中的MVD值(45.0±13.9),差异非常显著(P<0.01)。结论胃癌组织中COX-2与VEGF共表达,并相互协同促进肿瘤血管生成和转移。     

RT-PCR构建人甲胎蛋白全长基因真核表达载体

目的采用反转录PCR(RT—PCR)构建人甲胎蛋白(Alpha—Fetoprotein，AFP)全长基因真核表达载体，为下一步应用以AFP蛋白为靶点的基因治疗作准备。方法体外培养人肝癌细胞HepG2，Trizol裂解细胞，提取总mRNA。设计含有特定酶切位点BglⅡ，SalⅠ和真核启动元件Kozak序列的RT—PCT正反向引物，采用RT—PCR法克隆AFP全长cDNA，使用BglⅡ SalⅠ双酶切载体pEGFP—C3载体和AFP cDNA，将AFP cDNA连接载体pEGFP—C3，构建新的真核表达载体，命名为pEGFP—AFP。结果通过测序证明pEGFP—AFP真核表达载体含有AFP全长基因：结论：本研究成功构建人甲胎蛋白基因真核表达载体pEGFP—AFP，为进一步的分子试验和基因治疗打下了基础。     

胃癌组织中COX-2表达的Meta分析

[目的]评价环氧合酶-2（COX-2）与胃癌之间的关系。[方法]综合分析1994年1月到2006年11月公开发表的有关COX-2与胃癌关系随机对照临床试验的文献。按照人选标准，有7项随机对照实验纳入本研究。用RevMan4．2软件进行统计分析。[结果]COX-2在胃癌组中的表达显著高于对照组（OR=7．88，95％可信区间为5．44-11．4，P〈0．01）。[结论]COX-2高表达与胃癌的关联有统计学意义。     

人肺癌细胞NHE—1基因片段的克隆及其反义表达载体的构建

Na~ /H~ 交换泵(Na~ /H~ exchanger,NHE)基因家族有5个亚型,分别命名为NHE-1,2,3,4及β-NHE,其中NHE-l是一种管家基因.NHE-l能通过Na~ /H~ 交换,将胞内H~ 排出,是维持胞内pH在中性或偏碱性(pH= 7.0～7.2)的一种重要膜蛋白.肿瘤细胞由于其糖酵解的反巴士德效应,导致酸性产物的异常增加,但肿瘤细胞能依靠表达增强的NHE-1膜蛋白,将胞内H~ 泵出胞外,阻止癌细胞酸化.而目前已证明胞内H~ 的蓄积将会诱发细胞凋亡.因此,抑制人肺癌细胞NHE-1基因上调表达将诱发细胞酸化和凋亡,达到肿瘤治疗的目的.为将来在有机整体中实施NHE-1基因抑制的肿瘤治疗奠定基础,我们从人肺癌组织细胞中克隆了NHE-1基因cDNA的部分序列,并构建了其反义表     

正反义人Pin1基因克隆及真核表达载体的构建

Objective： To clone and construct eukaryotic expressing vectors of sense and antisense human Pin1 （hPinl） genes. Methods： Total RNA was extracted from MG-63 cells, then the hPinl cDNA was amplified by RT-PCR. The same time the sense and antisense hPinl genes were formed by binding BamH Ⅰ and Hind Ⅲ in cis and trans-directions. At the end they were cloned into the eukaryotic expressing vector pIRES2-EGFP in cis and trans directions using DNA recombinant technology. The recombinant vectors were further identified by digestion of BamHⅠ and Hind Ⅲ. Results： The results of sequencing showed that the orientation of the ligations and the reading frame were correct. After digested by BamH Ⅰ and Hind Ⅲ, two fragments exhibiting 5.3 kb and 0.99 kb were formed in sense and antisense eukaryotic expressing vectors. Electrophoretic results were completely coincident with theoretical calculation. Conclusion： Human Pin1 sense and antisense genes were successfully cloned and eukaryotic expressing vectors were successfully constructed.     

IGF-IR反义基因片段真核表达载体的构建

目的 构建人胰岛素样生长因子Ⅰ型受体(IGF-IR)的反义真核表达载体。为肿瘤的IGF-IR反义基因治疗研究创造条件。方法设计含有BamH1和HindⅢ酶切位点的一对引物，通过逆RT-PCR获得IGF-IR cDNA片段。经过纯化的hIGF-IR cDNA和空载体peDNA3．1(-)经过BamH1和HindⅢ双酶切，连接，转化，鉴定而得到重组体。结果反义基因重组体经过BamH1和HindⅢ双酶切后，得到700bp和5．4kb两条带；以重组体为模板进行PCR检测，700bp的目的基因片段呈现强阳性；重组体测序的结果与预期结果完全一致。结论成功构建了hIGF-IR的反义真核表达载体。     

真核表达p27构建胃癌顺铂耐药细胞模型的研究

目的:构建p27真核表达载体并导入胃癌SGC-7901细胞获得稳定表达p27的稳定细胞株,以研究p27在胃癌SGC-7901细胞顺铂耐药中所发挥的功能。方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增出p27编码区,并将其连接到pCDNA 3.0-Flag载体上,转染293T细胞后分别用定量PCR和Western blot检测其表达情况,并通过Western blot检测SGC-7901细胞过表达Flag-p27稳定细胞株是否构建成功。通过CCK-8药物敏感性实验检测p27在胃癌细胞顺铂耐药中所发挥的功能。结果:双酶切和测序结果表明,pCDNA 3.0-Flag-p27构建成功,并在293T中成功表达,胃癌SGC-7901细胞过表达Flag-p27细胞株建立成功,通过耐药曲线表明过表达p27可以引起SGC-7901细胞顺铂耐药。结论:成功构建了带Flag标签的p27真核表达载体,为进一步研究p27在胃癌耐药中的功能奠定了基础。     

人反义VEGF基因表达载体的构建及其对卵巢癌细胞增殖的影响

目的：构建人反义VEGF基因真核表达载体,进行抗血管生成治疗卵巢癌实验。方法：RT－PCR法获得人VEGF基因,将VEGF基因反向克隆入真核表达载体pcDNA3中,酶切鉴定结果。用此真核表达载体转染人卵巢癌细胞HO－8910,G418筛选获得阳性克隆,RNA斑点杂交鉴定HO－8910细胞中VEGF表达。Western blot及间接免疫荧光法检测转染前后HO－8910 细胞中VEGF蛋白表达。检测转染前后瘤细胞的生物学性状及裸鼠体内致瘤性。结果：RT－PCR法得到VEGF基因,并获得反向构建的VEGF真核表达载体。VEGF反义RNA部分阻断了HO－8910细胞中VEGF表达,转染后单个细胞的克隆形成能力明显减弱;细胞周期中,G1期细胞增多,S期细胞减少,细胞增殖能力降低;形态学超微结构显示细胞器扩张和肿胀,核染色质边集,凝集成块,可见明显的凋亡改变。裸鼠体内致瘤性降低。结论：成功构建了反义VEGF基因真核表达载体,该载体可明显抑制卵巢癌细胞增殖,为卵巢癌的基因治疗提供了一定的实验依据。     

siRNA沉默mdm2基因对胃癌细胞SGC-7901增殖和Rb基因蛋白表达的影响

目的：应用RNA干扰技术（RNAi）研究针对mdm2基因的siRNA，抑制mdm2基因的表达并诱导胃癌细胞系SGC7901细胞的凋亡。方法：将mdm2siRNA转染入SGC7901中，通过RT-PCR检测转染前后各组细胞mdm2mRNA表达水平；Western-blot技术检测转染前后各组细胞mdm2、Rb蛋白表达水平；在转染后不同时间点收集细胞台盼蓝染色后，计数阳性细胞数，统计细胞增殖情况。结果：转染mdm2siRNA后的SGC7901细胞中mdm2基因mRNA水平及mdm2蛋白表达水平显著下降，Rb蛋白表达水平增加；细胞的增殖受到显著抑制。结论：特异性siRNA可以下调SGC-7901细胞中mdm2mRNA及蛋白表达水平，同时引起Rb蛋白表达上调，干涉后细胞凋亡明显增多。提示mdm2基因与Rb基因可能存在某种相互拮抗的作用。mdm2蛋白表达下调及Rb蛋白表达上调可能是凋亡发生的机制之一。mdm2基因可作为胃癌治疗的潜在靶点。     

Significance of COX-2 expression in human renal cell carcinoma cell lines

Accumulating evidences indicate that cyclooxygenase (COX)-2 plays an important role in tumorigenesis in many human cancers. Yet the relationship between COX-2 and human renal cell carcinoma (RCC) remains unclear. The aim of our study was to evaluate COX-2 expression in human RCC cell lines and its role in tumorigenesis of human RCC. Among the human RCC cell lines (SMKT-R4, OS-RC-2, ACHN) and normal renal cell line RPTEC, COX-2 overexpression was found in OS-RC-2 cells both at mRNA and protein levels. COX-2 sense- and antisense-orientated vectors were constructed and transferred into RCC cells. Significant suppression of cellular proliferation was demonstrated in OS-RC-2 antisense transfectants, whereas promotion was found in SMKT-R4 sense transfectants by colony-forming assay despite the observation that COX-2 specific inhibitor NS398 exhibited similar IC50 among RCC cell lines by MTT assay. In comparison with parent cells and sense transfectants, significant suppression of COX-2 expression and PGE2 production and increase in butyrate-induced apoptosis were observed in OS-RC-2 antisense transfectants by Western blot, ELISA assay and FACS analysis, respectively. Furthermore, tumor growth and angiogenesis of OS-RC-2 antisense transfectants in nude mice was significantly suppressed and the survival time of these mice was significantly prolonged. Our study demonstrates that COX-2 is overexpressed in OS-RC-2 RCC cell line and plays an important role in tumorigenesis of the cells in vivo, which implies that COX-2 may be a therapeutic target for COX-2-expressing RCC, and that suppression of COX-2 expression by antisense-based strategy may have potential utility in treatment of COX-2-expressing RCC.     

环氧化酶-2的表达与胃癌浸润转移的关系

目的　探讨环氧化酶 - 2 (cyclooxygenase- 2 ,COX- 2 )在胃癌组织中的表达与胃癌浸润转移的关系。方法　采用免疫组化 S- P法检测 4 5例胃癌手术切除标本 COX- 2的阳性表达。结果　胃癌组织 COX- 2的阳性表达率(77.8% )明显高于癌旁组织 (33.3% ,P<0 .0 1)。有局部淋巴结转移者 COX- 2的阳性表达率明显高于无转移者 (分别为 86 .1%和 4 4 .4 % ,P<0 .0 5 ) ;浸润达浆膜层者明显高于未达浆膜层者 (分别为 87.9%和 5 0 .0 % ,P<0 .0 5 ) ; 、 期胃癌组织明显高于 、 期 (分别为 90 .9%和 4 1.7% ,P<0 .0 5 )。结论　 COX- 2与胃癌的发生有关 ,COX- 2的表达在胃癌浸润和转移过程中显示重要作用     

miR-17-92基因簇反义寡核苷酸对胃癌细胞增殖与侵袭的抑制作用

目的：探讨miR-17-92基因簇反义寡核苷酸对人胃癌细胞株SGC-7901的增殖及侵袭的影响。方法：合成miR-17-92基因簇中miR-17、miR-18a、miR-20a的反义寡核苷酸,通过实时荧光定量PCR验证miR-17、miR-18a、miR-20a反义寡核苷酸对SGC-7901细胞的miR-17、miR-18a、miR-20a的抑制效果,然后利用MTT、Transwell检测抑制表达后对细胞增殖及侵袭的影响。结果：miR-17、miR-18a、miR-20a的反义寡核苷酸能够抑制对应miRNA的表达,同时抑制了胃癌细胞的增殖与侵袭。结论：miR-17-92基因簇可能在胃癌发生发展中起到了癌基因的作用。