人牙周膜干细胞的分离培养及生物学特性研究

目的：分离筛选人牙周膜干细胞，研究其生物学特性并进行初步鉴定。方法：采用STR0-1为标记物以免疫磁珠分离筛选人牙周膜干细胞，观察细胞生长及克隆形成情况，流式细胞仪细胞周期、细胞表型分析，免疫细胞化学染色技术检测STR0-1、Vimentin表达，并测定细胞体外多向分化能力。结果：免疫磁珠法可获得人牙周膜干细胞，细胞具有克隆形成能力，增殖速度低。细胞周期分析大多数细胞处于G0／G1期，为慢周期性；细胞表型分析证实CD146、CD44高表达，CD34、CD45低表达。STR0-1及Vimentin均为阳性染色，矿化诱导和成脂诱导证实该细胞具有多向分化能力。结论：免疫磁珠法是有效的分离纯化牙周膜干细胞的方法。所分离细胞具有干细胞的细胞周期、表型特点及多向分化能力。     

免疫磁珠法分离和提纯雪旺细胞的实验研究

[目的]探讨利用免疫磁珠从SD大鼠坐骨神经分离培养获得大量、高纯度雪旺细胞的方法.[方法]选用4-7 d SD大鼠,无菌条件下取双侧坐骨神经,解剖镜下剥离去除神经外膜,获得神经束,将神经束剪碎至1 mm3大小.采用双酶2次消化法消化,胎牛血清中止消化后,离心并加入DF12培养液培养.7 d后应用免疫磁珠法对细胞进行纯化培养,培养2 d后进行传代接种.培养过程中对细胞进行形态学观察、计数及活力测定;MTY法绘制细胞生长曲线,采用免疫细胞化学荧光染色对细胞进行鉴定并且计算所得细胞纯度.[结果]分离培养所得细胞即为雪旺细胞;采用免疫磁珠法能对培养所得雪旺细胞进行纯化.纯化后雪旺细胞活力为96%±0.5%,纯度98%±1.1%,培养2 d后就可以传代.[结论]免疫磁珠法可以用于雪旺细胞的纯化培养,所得雪旺细胞纯度高,活力强,能满足组织工程人工神经的需要.     

利用毛囊干细胞和成纤维细胞重建全层皮肤的研究

目的建立利用毛囊干细胞和成纤维细胞进行全层皮肤重建的实验方法.方法取美容手术切取的头皮组织,K19免疫荧光染色定位毛囊干细胞,消化、分离、体外培养,以胶原-成纤维细胞聚合物为基质,采用气-液界面对第2代毛囊干细胞立体培养14 d,建立全层皮肤培养模型,并行组织学及K1免疫荧光染色观察.结果K19免疫荧光染色定位毛囊干细胞存在于毛囊外根鞘处,与成纤维细胞联合体外气-液界面立体培养14 d,获得的皮肤类似物,可见真皮基底膜形成,表皮多层上皮有序、多角形排列,上层细胞出现角化,真皮部成纤维细胞均匀分布于胶原基质中,角质细胞形成分化特异标志物K1染色阳性.结论毛囊外根鞘处的毛囊干细胞具有高增殖能力并向表皮细胞分化,可成功利用毛囊干细胞和成纤维细胞进行皮肤重建,为临床应用奠定基础.     

毛囊干细胞参与创面修复及相关的信号转导通路

目的对毛囊干细胞（hair follicle stem cell，FSC）参与创面修复过程及相关信号转导通路的研究进展进行综述。方法广泛查阅近年国内外相关文献，对FSC定位、细胞表面标记物、与创面修复的关系及相关信号转导通路研究进展进行回顾总结与分析。结果FSC在维持毛囊循环和创面修复中具有重要作用。已知参与调控这一过程的信号转导通路有Wnt、骨形成蛋白／转化生长因子β．Notch、Shh和成纤维细胞生长因子等。结论FSC在创面修复等再生医学中有广阔的应用前景，有关其增殖分化调控的研究将成为创面修复及组织工程等领域内新的研究热点。     

毛乳头细胞诱导毛囊形成的研究

目的 探讨培养的毛乳头细胞在体内外条件下诱导毛囊形成的可能性。方法 采用酶消化法获得毛乳头细胞、真皮鞘细胞、毛囊上、下段及球部细胞，进行毛囊组织工程重建，或用游离细胞混合移植于棵鼠，组织学观察毛囊形成情况。结果 毛囊间表皮细胞、毛囊上段上皮细胞、下段上皮细胞和球部细胞在间质细胞凝胶上均可形成双层结构的组织工程皮肤，在真皮鞘细胞胶原凝胶上毛囊的上、下段上皮细胞形成了毛囊结构，移植于棵鼠后8周毛乳头细胞胶原凝胶诱导毛囊上、下段细胞形成了毛囊。低代毛乳头细胞与毛囊上皮细胞混合移植形成了数量较多、结构典型的毛囊，并有肉眼可见的毛发纤维产生。结论 毛囊的真皮成分细胞即毛乳头细胞、真皮鞘细胞在体内、外均具有诱导毛囊形成的能力，通过与毛囊上皮细胞之间的相互作用，可诱导毛囊形成。     

成体干细胞与干细胞疾病

目的 结合文献对成体干细胞的特性进行总结，描述干细胞疾病的定义及特性。方法 广泛查阅近期相关文献，回顾成体干细胞及干细胞疾病。结果 成体干细胞是一类位于成熟组织器官内、维持正常组织细胞数量和功能的原始细胞，具有自我更新和多潜能分化能力，随着生物个体生命周期增长，成体干细胞出现老化。起源于干细胞的疾病可视为干细胞疾病。当成体干细胞自我更新能力增强和／或分化障碍时，细胞增殖能力变强，引起增生性疾病特别是肿瘤疾病。当成体干细胞自我更新减弱，提前老化或分化不全时，可导致功能细胞形成减少，如不能满足组织器官功能的需要，将导致相应器官功能衰竭，形成退行性疾病。结论 对成体干细胞自我更新、分化及老化的研究，在理论上将指导干细胞疾病的研究，并有助于发展干细胞疾病的诊断及治疗方法。     

新生大鼠骨骺前软骨干细胞培养及细胞库建立

目的　建立新生大鼠骨骺前软骨干细胞 (precartilagious stem cells,PSCs)库 ,为 PSCs作为组织工程种子细胞修复骨骺损伤的研究奠定基础。　方法　利用磁性细胞分选系统分离纯化有成纤维细胞生长因子受体 3(fibroblast growth factor receptor3,FGFR- 3)表面标志的骨骺 PSCs。将纯化后的 PSCs体外扩增至第 3代 ,采用液氮深低温保存细胞 ,应用 RT- PCR、免疫组织化学及免疫荧光等技术定期 (2、4周 )对复苏 PSCs行生物学特性鉴定。　结果　复苏后 PSCs存活率高 (>95 % ) ,细胞生长周期稍滞后。RT- PCR、免疫组织化学及免疫荧光检测均有较强的 FGFR- 3表达。经液氮冻存的 PSCs在细胞增殖、表型特征方面无显著变化 ,基本保持了原代 PSCs的生物学特性。　结论　成功建立了新生大鼠 PSCs细胞库 ,为应用组织工程技术修复骨骺损伤的研究提供良好的种子细胞。     

胚胎面突外胚间充质细胞的培养鉴定及向平滑肌细胞的自分化研究

目的 探讨胚胎面突外胚间充质细胞在体外的生长特性、表型特征及在无分化抑制剂-白血病抑制因子(LIF)的DMEM／F12培养基中向平滑肌细胞自分化的过程。方法 取孕50天人胚面突，用消化法培养获得外胚间充质细胞，倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况，免疫组织化学鉴定细胞分化表型。用无LIF的DMEM／F12培养基培养，2天后进行抗α-平滑肌肌动蛋白(α—SMA)单克隆抗体免疫组织化学检测，通过RT—PCR在mRNA水平检测α-SMA的表达，透射电镜观察细胞超微结构。结果 培养的细胞呈单层生长，成纤维状，长梭形，有2～4个突起，抗人自然杀伤细胞标志、波形丝蛋白、S-100蛋白、神经元特异性烯醇化酶、肌红蛋白及Ⅶ因子染色阳性，抗神经胶质纤维酸性蛋白、神经纤维细丝蛋白、α-SMA、角蛋白染色阴性。去除LIF2天后，抗α-SMA免疫组织化学检测呈阳性，RT-PCR显示细胞在RNA水平表达平滑肌细胞特异的α-SMA，透射电镜可见超微结构与平滑肌细胞相类似。结论 所获得的外胚间充质细胞具有干细胞特性。在无分化抑制剂存在时，面突外胚间充质细胞呈明显向平滑肌细胞的自然分化。     

人表皮干细胞的体外分离与培养

目的 探索人表皮干细胞（epidermal stem cells，ESCs）的分离方法和培养体系。方法 用Ⅳ型胶原纯化、富集ESCs，将黏附细胞（实验组）和未黏附细胞（对照组）分别接种在Ⅳ型胶原摹质（实验组为A1，对照组为A2）和3T3细胞滋养层（实验照组为B1，对照组为B2），培养体系为：低糖无钙DMEM培养基（添加10％胎牛血清、表皮生长因子10μg／L、氯化钙0．05mmol／L、氢化可的松0．8mg／L），观察细胞能否呈克隆状生长，用流式细胞仪和免疫细胞化学染色，对ECSs周期和表型进行分析。结果 实验组细胞呈克隆状生长，G0／G1期细胞和α6^briCD71 dim细胞百分率明显高于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05），实验组角蛋白19免疫细胞化学染色呈阳性，对照组呈刚性。结论 人ESCs可通过Ⅳ型胶原快速黏附分选，并可在适当的培养体系里扩增。     

成体干细胞的分化潜能及在修复重建中的应用前景

目的 探讨成体干细胞（AS细胞）的分化潜能性及在临床修复重建中应用的可能。方法 检索医学和生物医学文献数据库中关于AS细胞研究的相关报道，并对AS细胞的最新研究进展作简要总结。结果 AS细胞存在于成体的各种组织中，具有自我更新能力和分化潜能性；部分成体干细胞，如骨髓皮肤、肝及脂肪等组织中的AS细胞，具有多向分化潜能，可向无关组织类型的成熟细胞横向分化；AS细胞是组织更新与修复的起源细胞，且与肿瘤的发生和衰老密切相关。结论 AS细胞具有多向分化潜能，在创伤修复等再生医学中有广阔的应用前景。     

人骨髓间质干细胞的优化培养

目的探索人骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的优化培养条件.方法应用不同条件,研究原代培养方法、接种密度、首次换液时间、培养基、血清浓度及种类对细胞生长的影响,并以选定的条件培养、扩增MSCs,扩增后向成骨细胞和软骨细胞诱导.结果在其它条件不变的前提下,密度梯度分离法优于全骨髓法,2.5×105/cm2是人MSCs原代培养的适宜接种密度,原代第5天首次换液为最佳换液时间,DMEM培养基优于α-MEM培养基,血清C为适宜的血清,10%为适宜的血清浓度.所选条件培养的MSCs可在体外扩增15代以上,形态保持不变,并具有良好的分化潜能.结论建立了人MSCs的体外优化培养条件,为其在组织工程方面的应用作出了新的探索.