转基因细胞移植对损伤脊髓天门冬氨酸受体的影响

[目的]研究腺病毒介导的脑源性神经生长因子(brainderivedneurotrophinfactor,AxCABDNF)转基因细胞移植和大剂量甲基强的松龙对大鼠损伤脊髓组织N甲基D天门冬氨酸(NMDA)受体的影响。将成年大鼠分为4组,A组单纯脊髓损伤组;B组脊髓损伤+AxCABDNF基因转染的成肌细胞移植组;C组脊髓损伤+甲基强的松龙组;D组脊髓损伤+细胞移植+甲基强的松龙组。应用后1、3、7、14d,采用[3H]标记的地卓西平马来酸盐([3H]MK801)放射性配基分析法检测大鼠损伤后脊髓NMDA受体的变化。[结果]发现各组[3H]MK801放射性配基分析最大结合容量都有不同程度的减少,其减少程度顺序是A组>B组>C组>D组。表明应用甲基强的松龙(MP)和BDNF转基因细胞移植可以通过影响脊髓NMDA受体减轻脊髓继发性损伤。     

N-甲基-D-天门冬氨酸受体拮抗剂MK-801胚胎脊髓移植后大鼠损伤脊髓凋亡的影响

[目的]探讨大鼠脊髓损伤后N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂MK-801胚胎脊髓移植后对大鼠脊髓细胞凋亡的影响.[方法]将动物分为大鼠脊髓半切洞损伤后,分为应用胚胎脊髓和MK-801治疗组(A组),大鼠脊髓半切洞损伤应用胚胎脊髓移植组(B组),单纯脊髓半切洞损伤明胶海绵填充组(C组).手术后1、3、7、14 d对脊髓损伤区进行细胞凋亡的检测(TUNEL),以及Bcl-2蛋白免疫反应表达的测定(免疫组化法).采用计算机图像分析技术,进行定量分析.[结果]A、B、C三组中均发现凋亡细胞及BCL-2蛋白免疫反应阳性细胞,图像分析发现,细胞凋亡率为:C＞B＞A,Bcl-2免疫反应阳性细胞表达顺序为:A＞B＞C.[结论]大鼠脊髓损伤后应用NMDA受体拮抗剂MK-801和胚胎脊髓移植能抑制脊髓损伤后细胞凋亡.     

胚胎脊髓不同移植方法对大鼠损伤脊髓N-甲基-D-天门冬氨酸受体的影响

创伤后一个重要的继发性损伤是释放兴奋性氨基酸 (EAA) ,随后作用于N 甲基 D 天门冬氨酸受体 (NMDAR )。NMDAR是EAA受体的一种重要亚型 ,参与EAA释放的调节。近年来发现中枢神经系统损伤时NMDAR过度激活可引起神经细胞内Ca2 + 超载和Na+ 积蓄 ,由此产生细胞内高渗压和激活细胞内一系列钙依赖性酶学反应 ,导致神经细胞的凋亡和死亡[1] 。我们用胚胎脊髓、大网膜以及腺病毒介导的脑源性神经生长因子 (AxCA BDNF)基因转染的成肌细胞移植 ,应用免疫组织化学和氚标记的地卓西平马来酸盐 ( [3 H]MK 80 1)放射性配基分析 ,观察上…     

胚胎脊髓移植联合应用MK-801促进大鼠脊髓损伤后功能恢复

目的　研究胚胎脊髓移植并应用N 甲基 D 天门冬氨酸 (NMDA)受体拮抗剂MK 80 1能否促进半切洞脊髓损伤后功能恢复。方法　将成年大鼠分为 3组 ,A组 :单纯脊髓半切洞损伤组 ;B组 :脊髓半切洞损伤 胚胎脊髓移植组 ;C组 :脊髓半切洞损伤 胚胎脊髓移植 MK 80 1组。手术后应用联合行为评分 (CBS)、感觉诱发电位 (SEP)、运动诱发电位 (MEP)检查。结果　 3组CBS得分A组>B组 >C组 ,SEP和MEP潜峰时A组 >B组 >C组 ,统计学分析差异有显著性 (P <0 0 5 )。结论　胚胎脊髓移植联合应用NMDA受体拮抗剂MK 80 1能够促进脊髓损伤后功能恢复     

肝硬化门静脉高压对大鼠认知功能和N-甲基-D-天门冬氨酸受体2B亚基表达的影响

目的 研究肝硬化门静脉高压对大鼠认知功能及N-甲基-D-天门冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NR) 2B亚基(NR2B)表达的影响. 方法 雄性SD大鼠37只,按照完全随机法分为两组:肝硬化组(25只),采用四氯化碳-花生油溶液方法制造肝硬化门静脉高压大鼠模型;对照组(12只).两组于造模前及造模成功后第1、3、5、7天分别利用跳台法和Y-迷宫法对各大鼠进行行为学测试;测试完成后处死大鼠,取海马组织,RT-PCR方法检测大鼠海马NR2B mRNA的水平,Western blot检测海马NR2B蛋白表达水平,免疫组化法检测大鼠海马CA1区NR2B蛋白分布的变化.ELISA法检测肝损伤相关指标ALT、AST、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、TNF-α、IL-1、IL-6的含量.结果 肝硬化组AST、ALT、TNF-α、IL-1、IL-6、MDA分别为(261±7)、(178±7) U/L、(206±18)、(0.46±0.11)、(298±41) μg/L、(19.7±2.5) μmol/L,较对照组明显升高(P＜0.01),SOD为(96±7) U/ml,较对照组明显降低(P＜0.01).与对照组比较:肝硬化组跳台潜伏时间延长、y-迷宫、错误次数增加(P＜0.0l),海马中NR2B mRNA的水平及NR2B的蛋白表达明显降低(P＜0.01),海马CA1区NR2B免疫组化表达明显下降(P＜0.01). 结论 肝硬化门静脉高压引起大鼠认知功能的降低,同时下调海马中NR2BmRNA和蛋白的表达及CA1区锥形细胞中NR2B的表达.     

神经生长因子对脊髓损伤后神经元N-甲基-D-天门冬氨酸受体和一氧化氮生成的影响

我们用原位杂交法通过检测神经生长因子 (ＮＧＦ)作用于损伤脊髓前后Ｎ 甲基 Ｄ 天门冬氨酸受体 (ＮＭＤＡＲ) 1及固有型一氧化氮 (ＮＯ)合酶 (ｎｃＮＯＳ)ｍＲＮＡ的表达变化来探讨ＮＧＦ保护损伤脊髓的机理 ,现报道如下。一、材料和方法1 .动物及分组 :Ｗｉｓｔａｒ大鼠 65只 ,体重 2 0 0～ 2 50 ｇ ,雌雄不分 ,随机分成 3组 :正常组 :5只 ,不作手术 ,作为测量脊髓ＮＭＤＡＲ1和ｎｃＮＯＳ的正常数值 ;生理盐水 (ＮＳ)组 :30只 ,经蛛网膜下腔导管注入生理盐水 ;ＮＧＦ组 :30只 ,经导管注入ＮＧＦ。2 .动物模型的建立 :以 1 0 ｇ× 2 .5ｃ…     

脑源性神经营养因子基因修饰神经干细胞对体外培养的脊髓背根神经节细胞的生物学作用

目的建立稳定表达脑源性神经营养因子(BDNF)基因的神经干细胞并观察其对于体外培养的脊髓背根神经节(DRG)细胞存活及突起生长的影响。方法以PCR技术从人脑cDNA文库中获取人BDNF基因片段。采用分子克隆技术构建带有绿色荧光蛋白报告基因的多顺反子的MSCVBDNFIRES2EGFP重组鼠干细胞病毒表达载体,病毒经PT67细胞包装后感染神经干细胞株C17.2。通过免疫组化,RTPCR,ELISA检测BDNF的表达,在双室共培养系统中共培养3,10d后观察经筛选的稳定表达株对原代培养DRG细胞的生物学作用。结果RTPCR证实BDNF基因在C17.2细胞中转录,ELISA分析显示转基因C17.2培养上清中在转染24h后即可检测到BDNF表达,并在3个月后仍表达(14.6±0.8)ng·d-1·10-1细胞;免疫细胞化学显示,与对照组相比较,BDNF基因修饰的神经干细胞组,DRG细胞突起生长较长交织呈网状的,节细胞存活较多。结论干细胞病毒介导转染的BDNF基因能够在神经干细胞C17.2中稳定表达,并且BDNF基因修饰的神经干细胞对体外培养的DRG细胞的存活及突起、延伸具有显著促进作用。     

脑源性神经营养因子基因修饰细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的电生理研究

目的 采用神经电生理检查方法,观察逆转录病毒载体介导脑源性神经营养因子（BDNF）基因修饰成肌细胞对损伤脊髓的治疗作用。方法 30只SD大鼠在T9水平制成脊髓横断损伤模型并随机分为基因细胞组（A组）、成肌细胞组（B组）及损伤对照组（C组）,每组10只大鼠。术后3个月,采用皮层体感诱发电位（CSFP）和运动诱发电位（MFP）等电生理检测技术,观察轴突是否有再生及其神经功能恢复程度。结果 （1）A组中3只大鼠损伤3个月后出现CSEP波,5只出现MEP波,B、C组动物未发现电生理信号恢复;（2）重新出现的CSEP或MEP信号均较损伤前波幅减低,潜伏期延长;（3）A组脊髓神经功能较B、C组有显著改善。结论 BDNF基因修饰细胞脊髓内移植能有效促进损伤脊髓神经的再生及部分传导功能恢复。     

神经干细胞移植促进脊髓损伤后脑源性神经营养因子的表达

目的：探讨神经干细胞（NSCs）移植对大鼠脊髓损伤后脑源性神经营养因子（BDNF）表达的影响及其意义。方法：NSCs提取自新生Wistar大鼠的海马区，经培养、鉴定。制作大鼠脊髓损伤（SCI）模型，于伤后第7天移植NSCs。实验分为3组：NSCs移植组（A组），DMEM填充组（B组），正常对照组（C组）。应用RT—PCR法和免疫组化法观察细胞移植后BDNF基因表达的变化。结果：RT—PCR结果分析，移植术后第1、3、5天，A组BDNF mRNA的表达量明显高于B组，差异有统计学意义（P〈0．05）。组化结果分析，移植术后第7、14、28天BDNF的表达量A组明显高于B组，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：NSCs在移植后可上调脑源性神经营养因子BDNF基因的表达，是其修复脊髓损伤的机制之一。     

脑源性神经生长因子转基因细胞移植和大剂量甲基强的松龙对脊髓损伤后细胞凋亡的影响

目的：探讨大鼠脊髓损伤后腺病毒介导的脑源性神经生长因子（AxCA-BDNF）体外转基因成肌细胞移植和静脉内注射大剂量甲基强的松龙（MP）对大鼠脊髓损伤后细胞凋亡的影响。方法：120只Wistar大鼠分为：脊髓挫伤组（A组），脊髓挫伤后AxCA-BDNF基因转染的成肌细胞移植组（B组），脊髓挫伤后静脉内注射大剂量MP治疗组（C组），脊髓挫伤后同时应用AxCA-BDNF和MP组（D组）。手术后1、3、7、14、28d用行为学和电生理检查观察大鼠功能恢复情况，并用计算机图像分析技术对脊髓损伤区细胞凋亡（TUNEL法）和Bcl-2蛋白表达（免疫组化法）进行定量分析。结果：四组中均发现凋亡细胞及Bcl-2蛋白阳性表达细胞．图像分析发现四组凋亡细胞核数为A组〉B组〉C组〉D组；Bcl-2免疫反应阳性细胞表达顺序为D组〉C组〉B组〉A组。大鼠后肢功能恢复和电生理检查也有类似的变化趋势。结论：体外转基因成肌细胞移植和大剂量MP都能抑制大鼠脊髓损伤后的细胞凋亡，促进大鼠后肢功能恢复，两者联合应用具有协同作用。     

联合应用PARP-1与Caspase-3抑制剂对脊髓损伤大鼠神经细胞凋亡的影响

目的:探讨联合应用多聚腺嘌呤二核苷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-aminobenzamide,3-AB)和Caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK对脊髓损伤大鼠神经细胞凋亡的影响。方法:120只成年健康SD大鼠随机分为假手术组(A组)、模型组(B组)、PARP-1抑制剂组(C组)和联合用药组(D组),每组30只。以Allen′s打击法制备大鼠脊髓损伤模型,每组分别于造模后1d、3d、7d取5只大鼠行BBB评分,处死后利用免疫组化方法检测损伤部位脊髓内PARP-1、凋亡诱导因子(AIF)、Caspase-3及Bcl-2的表达;各时间点各组剩余大鼠处死后利用Western blotting检测PARP-1、Caspase-3蛋白表达水平,实时荧光定量PCR检测PARP-1、AIF、Caspase-3及Bcl-2的m RNA水平,采用原位末端标记(TUNEL)法检测神经细胞凋亡情况。结果:造模后1d时B、C、D组大鼠BBB评分均为0分;3d时三组间的评分无统计学差异;7d时D组及C组明显高于B组,且D组最高(P0.05)。免疫组化及Western blotting结果显示,脊髓损伤后1~7d,B组脊髓组织中PARP-1、AIF及Caspase-3表达逐渐增强,Bcl-2表达逐渐减弱(P0.05);与B组比较,D组及C组的PARP-1、AIF、Caspase-3表达均显著降低,且D组最低(P0.05);而D组及C组的Bcl-2表达显著高于B组,且D组最高(P0.05)。实时荧光定量PCR检测各目的基因表达水平与其蛋白水平一致。TUNEL结果显示,B组脊髓损伤后3d凋亡细胞最多,7d时数量减少,但仍保持在较高水平(P0.05);D组及C组凋亡细胞指数均显著低于B组,且D组最低(P0.05)。结论:联合应用PARP-1抑制剂3-AB和Caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK可有效抑制大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡,其机制可能与PARP-1、AIF、Caspase-3的表达抑制及Bcl-2的表达上调有关。