大鼠耳蜗前体细胞的体外培养与分化鉴定

目的:分离?培养大鼠的耳蜗前体细胞,鉴定其增殖和分化能力,分析内耳发育相关基因在其分化中的表达?方法:从新生大鼠的耳蜗组织中分离获得前体细胞,进行体外培养,并加入血清诱导分化,通过免疫细胞化学的方法鉴定其增殖和分化为毛细胞的能力,利用荧光定量PCR的方法分析不同分化阶段的耳蜗前体细胞中内耳发育相关基因的表达?结果:原代培养的耳蜗前体细胞经免疫细胞化学鉴定呈nestin?BrdU阳性,经血清诱导分化后呈myosin Ⅶ A阳性?荧光定量PCR的结果表明Sox2?CyclinA2在耳蜗前体细胞分化的过程中表达逐渐下降,而Jagged1在分化过程中表达不断升高?结论:分离的耳蜗前体细胞具有增殖能力和分化为毛细胞的潜能,在其分化过程中Sox2?CyclinA2和Jagged1可能参与调控大鼠前体细胞的分化和耳蜗组织的发育?     

内耳干细胞分离培养及鉴定的实验研究

目的：明确内耳干细胞的取材、培养方法及鉴定方法,观察内耳干细胞的形态.方法：取前庭椭圆囊处上皮;大鼠内耳内螺旋沟;内耳的Corti器位置;利用无血清培养和单细胞克隆技术,进行细胞培养,在相差显微镜下观察细胞形态及生长状况,并用Nestin、Brdu免疫荧光方法,鉴定内耳干细胞.同时进行细胞计数.结果：从新生大鼠内耳分离的组织,经原代和传代培养后,可获得大量未分化,悬浮生长的Nestin阳性细胞团,并具有增殖的能力,免疫荧光实验可表达Brdu阳性.其中内耳的Corti器位置取材组Nestin阳性细胞团的直径和其他两组存在统计学差异.而打散后的细胞团中Brdu阳性细胞数量较多,是内耳干细胞的最佳取材位置.结论：从新生大鼠前庭椭圆囊处上皮、大鼠内耳内螺旋沟、内耳的Corti器位置可分离出内耳干细胞,其中内耳的Corti器是内耳干细胞的最佳取材位置.     

当归补血汤对耳蜗干细胞鼓阶内移植治疗药物性感音神经性耳聋大鼠增效作用研究

目的:观察当归补血汤对耳蜗干细胞移植治疗感音神经性耳聋大鼠增效作用.方法:感音神经性耳聋大鼠分为耳蜗干细胞移植组、当归补血汤组和空白对照组3组.体外培养耳蜗干细胞进行内耳移植,耳蜗干细胞移植组将耳蜗干细胞悬液移植入内耳耳蜗结构,当归补血汤组将含有当归补血汤的耳蜗干细胞悬液移植入内耳耳蜗结构,空白对照组移植生理盐水.分别于术后1、3、6和12个月采用听觉脑干诱发电位方法检测模型大鼠的听力恢复情况,处死大鼠,通过免疫荧光染色方法观察移植的耳蜗干细胞在内耳存活、分化和迁移情况.结果:从E14大鼠耳蜗分离的组织,经原代和传代培养后,可获得大量未分化悬浮生长的Nestin阳性细胞团, Brdu表达阳性,说明是具有自我更新和增殖潜能的干细胞.免疫荧光检测发现在耳蜗干细胞移植组、当归补血汤组在移植针道两侧可见移植的干细胞,有些还迁移到基底膜区.存活的细胞部分呈 Myosin Ⅶ A阳性染色.与耳蜗干细胞移植组比较,当归补血汤组 Myosin Ⅶ A阳性染色细胞数量较多,差异有统计学意义(P<0.05).听觉脑干诱发电位结果显示当归补血汤组的感音神经性耳聋模型大鼠听力恢复情况较耳蜗干细胞移植组和对照组好,差异有统计学意义(P<0.05).结论:经体外培养的耳蜗干细胞移植入内耳鼓阶后能够存活和迁移,并分化为内耳毛细胞;当归补血汤可以提高耳蜗干细胞分化为内耳毛细胞的比例,并促进感音神经性耳聋模型大鼠听力恢复.     

针刺动物血清对内耳干细胞分化影响的实验研究

目的 针刺动物血清对体外培养内耳干细胞生长分化的影响.方法 观察针刺动物血清、胎牛血清等对体外培养内耳干细胞生长分化的影响;流式细胞仪检测培养细胞中BrdU阳性和Myosin ⅦA阳性神经元的比率;RT-PCR技术分析bHLH基因表达的动态变化.结果 针刺动物血清不仅对耳蜗干细胞的增殖有很好的促进作用,而且能更多地诱导耳蜗干细胞向毛细胞分化;胎牛血清和针刺动物血清的Mash1在分化后表达逐步增强(d 3最明显).结论 针刺动物血清可以更多地诱导神经干细胞分化为神经元.     

骨髓间充质干细胞分化为内耳毛细胞前体细胞的研究

目的 探索大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）体外诱导分化成内耳毛细胞前体细胞的过程,以期为耳蜗MSCs移植提供实验依据.方法 采用贴壁法提取SD大鼠MSCs,体外培养纯化.分别以EGF＋IGF-1＋BDNF＋ATRA、EGF＋IGF-1＋bFGF＋BDNF＋NT-3作为诱导条件,诱导MSCs分化.观察诱导组及对照组细胞形态的变化,并采用免疫细胞染色法检测毛细胞前体细胞或毛细胞特异性抗原myosinVI、Pax-2、nestin、p27kip1的表达.结果 EGF＋IGF-1＋BDNF＋ATRA诱导组细胞呈短梭形样、方形样,未形成突触;myosin VI、Pax-2、nestin、p27kpi1均有不同程度阳性表达.EGF＋IGF-1＋bFGF＋BDNF＋NT-3诱导组细胞变圆或变细长,逐渐伸出突触,部分形成网络状、大环状结构;nestin、p27kpi1均呈阳性表达.结论 大鼠MSCs在体外培养诱导分化后,可形成内耳毛细胞前体细胞和神经前体细胞.     

人工外淋巴液诱导新生豚鼠海马神经干细胞分化的实验研究

目的观察新生豚鼠海马神经干细胞在人工外淋巴液中的分化情况。方法将原代培养的新生豚鼠海马来源的神经干细胞进行体外培养，分别置入合有5％-15％人工外淋巴液培养基使其分化，3周后对分化的细胞进行免疫荧光检测，计数产生表达毛细胞标记蛋白Mysion Ⅶa阳性细胞的比例。结果人工外淋巴液能诱导新生豚鼠海马神经干细胞分化为表达毛细胞特异抗体的细胞。结论神经干细胞在人工外淋巴液中可以存活并分化出袁达毛细胞特异抗体的细胞，为神经干细胞的移植内耳治疗提供有力的依据。     

大鼠脊髓背根神经节内神经前体细胞的观察

目的:探讨大鼠脊髓背根神经节(DRG)内是否存在神经前体细胞.方法:取成年和胚胎大鼠DRG冰冻切片,进行Brdu,Nestin,P75免疫荧光组织化学检测,分别取成年和胚胎大鼠DRG进行原代细胞培养,观察其增殖与分化情况,并行Nestin免疫组织化学和Brdu,P75,NF,GFAP免疫荧光组织化学鉴定.结果:在成年和胚胎大鼠DRG冰冻切片上均见有Brdu/Nestin和Nestin/P75免疫荧光双标细胞.细胞培养观察到取自DRG的细胞有分裂增殖,呈Nestin免疫组织化学阳性反应和Brdu,P75免疫荧光组织化学阳性反应;培养第三代细胞加入胎牛血清后出现分化,分化细胞呈NF和GFAP免疫荧光组织化学阳性反应.结论:大鼠DRG内存在有分裂增殖的神经前体细胞,这些细胞可以分化为神经元和神经胶质细胞.     

C57BL/6小鼠内耳前庭末梢器官的形态发育过程及Myosin Ⅵ的表达

目的探讨C57BL/6小鼠内耳前庭末梢器官的形态发育过程及MyosinⅥ在该过程中的表达。方法选择从E10到E20每个时间点的孕鼠,取E10～E17的胚胎头、E18～E20的胚胎内耳,通过冰冻连续切片、HE染色及免疫荧光观察小鼠内耳前庭末梢器官的形态发育过程及MyosinⅥ抗体标记阳性毛细胞出现的时间。结果小鼠内耳前庭末梢器官发育早、过程短,E10是听囊,E11已经能区分出背侧较大的前庭囊和腹侧较小的耳蜗囊,E12的前庭囊和耳蜗囊区分已很明显,并且出现内淋巴囊和管、上和后半规管始基,E13可见到上和后半规管壶腹嵴始基,出现水平半规管始基和椭圆囊始基,E14形成球囊和水平半规管壶腹嵴始基,E15椭圆囊、球囊、膜半规管初具成熟形态,所有囊斑、壶腹嵴基本形成,E18形态发育基本完成。MyosinⅥ标记阳性表达的毛细胞在E15的所有壶腹嵴、囊斑里出现,未见支持细胞表达MyosinⅥ。结论 MyosinⅥ在E15开始表达,这个时期可能是毛细胞成熟的关键时期。     

Morphological development process of periphery vestibular organs in inner ear and expression of myosin Ⅵ in C57BL/6 mice

目的 探讨C57 BL/6小鼠内耳前庭末梢器官的形态发育过程及MyosinⅥ在该过程中的表达.方法 选择从E10到E20每个时间点的孕鼠,取E10～E17的胚胎头、E18～E20的胚胎内耳,通过冰冻连续切片、HE染色及免疫荧光观察小鼠内耳前庭末梢器官的形态发育过程及MyosinⅥ抗体标记阳性毛细胞出现的时间.结果 小鼠内耳前庭末梢器官发育早、过程短,E10是听囊,E11已经能区分出背侧较大的前庭囊和腹侧较小的耳蜗囊,E12的前庭囊和耳蜗囊区分已很明显,并且出现内淋巴囊和管、上和后半规管始基,E13可见到上和后半规管壶腹嵴始基,出现水平半规管始基和椭圆囊始基,E14形成球囊和水平半规管壶腹嵴始基,E15椭圆囊、球囊、膜半规管初具成熟形态,所有囊斑、壶腹嵴基本形成,E18形态发育基本完成.Myosin Ⅵ标记阳性表达的毛细胞在E15的所有壶腹嵴、囊斑里出现,未见支持细胞表达Myosin Ⅵ.结论 MyosinⅥ在E15开始表达,这个时期可能是毛细胞成熟的关键时期.     

人胎内耳中碱性成纤维细胞生长因子的定位表达

目的：研究人胎内耳中碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)的定位表达情况。方法：合法水囊引产胎儿10个，制备火棉胶包埋颞骨切片，采用免疫组织化学技术观察bFGF在内耳中表达情况。结果：耳蜗毛细胞，支持细胞，螺旋神经节细胞，神经纤维均有bFGF表达，成熟毛细胞表达很弱；前庭毛细胞，支持细胞，上皮下组织和神经纤维均有bFGF表达。结论：bFGF参与人内耳发育，主要起促分化作用。     

回转器模拟失重对SGC-7901、HFE-145细胞增殖和周期的影响

目的探讨模拟失重对胃癌SGC-7901细胞和胃黏膜上皮HFE-145细胞增殖和周期的影响。方法采用回转器模拟失重,两种细胞各分为两组,回转组和1G对照组,实验时间共72h。采用免疫组化法观察两种细胞增殖核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）表达的变化,应用流式细胞仪测定细胞周期。结果与对照组相比,回转组SGC-7901细胞48h及72hPCNA抗体阳性率明显减少（P〈0.05及P〈0.01）,G0＋G1期细胞显著增多（P〈0.01及P〈0.05）;12h、24h及36h PCNA抗体阳性细胞的比率无显著性差异。与对照组相比,回转组HFE-145细胞12hPCNA抗体阳性率明显减少（P〈0.05）,G0＋G1期细胞显著增多（P〈0.05）。结论回转器模拟失重使胃癌SGC-7901细胞48h及72h时出现细胞周期阻滞、增殖抑制。胃黏膜上皮HFE-145细胞在12h时出现上述变化。     

自然杀伤细胞与肝纤维化

 肝淋巴细胞中含有丰富的自然杀伤细胞（natural killer cells,NK）,后者通过影响天然免疫抵御肝内病毒感染及肿瘤转移。而活化的肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）在肝纤维化发生发展中起着关键作用。近来一些研究表明NK细胞可通过产生具有抗纤维化作用的IFN-γ以及直接杀死活化HSCs,起到明显的抗肝纤维化作用。因此,刺激NK细胞活化极可能成为治疗肝纤维化的新途径,但其有效性及安全性需进一步通过临床研究来证明。     

X射线对Jurkat和EL-4细胞周期进程的影响

目的：探讨较大剂量X射线照射对Jurkat和EL-4 2种T淋巴细胞周期进程的影响。方法：采用碘化丙啶（PI）荧光标记及流式细胞术（FCM）分别检测2.0 Gy X射线照射后不同时间点（0、4、8、16、24和48 h）Jurkat与EL-4细胞周期进程变化的时间-效应关系和1.0、2.0和4.0 Gy不同剂量X射线照射后两者的剂量-效应关系。结果：与各时间点对应的假照组比较,2.0 Gy X射线照射后Jurkat细胞G₀/G₁期和S期细胞百分率降低（P<0.01）,G₂+M期细胞百分率增高（P<0.01）,于照射后24 h变化最为显著;EL-4细胞G₂+M期细胞百分率于照射后4 ~ 8 h增高（P<0.01）,G₀/G₁期细胞百分率于照射后8 ~ 48 h增高（P<0.05或P<0.01）,S期细胞百分率于照射后8 ~ 24 h降低（P<0.01）。1.0 ~ 4.0 Gy X射线照射后16 h,随着剂量的增加,与假照组比较,Jurkat细胞G₀/G₁期和S期细胞百分率降低（P<0.05或P<0.01）,G₂+M期细胞百分率增加（P<0.01）;随着剂量的增加,与假照组比较,EL-4细胞G₀/G₁期细胞百分率升高（P<0.01）,S期细胞百分率降低（P<0.01）,G₂+M期细胞百分率仅在4.0 Gy X射线照射后显著增高（P<0.01）。结论：1.0 ~ 4.0 Gy X射线照射可以改变Jurkat与EL-4细胞周期进程,诱导Jurkat细胞发生G₂期阻滞,EL-4细胞发生G₁期和G₂期阻滞。     

ACAT-1在单核细胞向泡沫细胞分化过程中的表达变化

目的研究单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中脂酰CoA胆固醇酯酰转移酶-1(ACAT-1)表达及活性的变化。方法复苏、培养人单核细胞株THP-1细胞,与乙酸肉豆蔻佛波酯(PMA)、PMA+氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)共孵育1～4 d,RT-PCR方法检测单核细胞分化过程中ACAT-1 mRNA表达,Westernblotting检测ACAT-1蛋白表达的变化。结果(1)单核细胞复苏后加入PMA诱导48 h后,分化为巨噬细胞。经PMA+ox-LDL诱导24 h后分化为泡沫细胞。(2)与无血清培养单核细胞对照组比较,在PMA诱导单核细胞株THP-1向巨噬细胞分化过程中,ACAT-1 mRNA、蛋白表达及酶活性水平明显增高(P<0.05),呈时间依赖效应。(3)巨噬细胞向泡沫细胞分化过程中,ACAT-1 mRNA、蛋白表达及酶活性水平增高,呈时间依赖效应。但和无血清培养巨噬细胞比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论单核细胞株THP-1经PMA,PMA/ox-LDL诱导后,可分化为巨噬细胞、泡沫细胞。ACAT-1的表达及活性增高在单核细胞向泡沫细胞诱导分化过程中起着重要作用。     

人骨髓间充质干细胞与髓核细胞共培养后的类髓核分化效应及其对髓核细胞表型的调节作用

目的探讨人骨髓间充质干细胞分别与正常及退变髓核细胞共培养后的类髓核分化效应及其对髓核细胞表型的调节作用并进行比较。方法取来源于腰椎退变患者以及脊柱侧弯患者的间盘组织,通过改良Pfirrmann法对其退变程度进行分级,进行髓核细胞（NPCs）的分离培养及鉴定,通过术中椎弓根钉道取血,进行骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离培养及鉴定。取传至第3代细胞进行共培养。建立5个培养组：BMSCs单独培养组,退变NPCs单独培养组,正常NPCs单独培养组,BMSCs与退变NPCs共培养组,BMSCs与正常NPCs共培养组。共培养7d后,RT—PCR法检测各组细胞SOX-9、聚集蛋白聚糖Aggrecan与Ⅱ型胶原蛋白的mRNA表达。结果相较于BMSCs单独培养组,共培养组BMSCs的SOX-9、Aggrecan与Ⅱ型胶原蛋白的mRNA表达均有明显增加（P〈0．05）。同时与BMSCs与正常NPCs共培养组相比,BMSCs与退变NPCs共培养组BMSCs的SOX-9、Aggrecan与Ⅱ型胶原蛋白的mRNA表达均有明显增加（P〈0．05）。与退变NPCs单独培养组相比。共培养组退变NPCs的SOX-9、Aggrecan与Ⅱ型胶原蛋白的mRNA表达均明显增加（P〈0．01）。与正常NPCs单独培养组相比,共培养组正常NPCs的SOX-9、Aggrecan与Ⅱ型胶原蛋白的mRNA表达均明显增加（P〈0．01）。结论BMSCs与NPCs共培养时的相互作用能促使BMSCs向类髓核表型分化,较之正常NPCs,退变NPCs与BMSCs共培养时能更明显地促进BMSCs向类髓核表型分化。同时BMSCs对NPCs的调节作用能促进其特征性相关基因表达,与退变NPCs共培养时,这一效应依然明显。     

Retinal stem cells and potential cell transplantation treatments

The retina, histologically composed of ten delicate layers, is responsible for light perception and relaying electrochemical signals to the secondary neurons and visual cortex. Retinal disease is one of the leading clinical causes of severe vision loss, including age-related macular degeneration, Stargardt's disease, and retinitis pigmentosa. As a result of the discovery of various somatic stem cells, advances in exploring the identities of embryonic stem cells, and the development of induced pluripotent stem cells, cell transplantation treatment for retinal diseases is currently attracting much attention. The sources of stem cells for retinal regeneration include endogenous retinal stem cells (e.g., neuronal stem cells, Müller cells, and retinal stem cells from the ciliary marginal zone) and exogenous stem cells (e.g., bone mesenchymal stem cells, adipose-derived stem cells, embryonic stem cells, and induced pluripotent stem cells). The success of cell transplantation treatment depends mainly on the cell source, the timing of cell harvesting, the protocol of cell induction/transplantation, and the microenvironment of the recipient's retina. This review summarizes the different sources of stem cells for regeneration treatment in retinal diseases and surveys the more recent achievements in animal studies and clinical trials. Future directions and challenges in stem cell transplantation are also discussed.     

单细胞RNA测序在干细胞生物学中的应用研究进展

细胞间的变异或异质性是干细胞群的基本和内在特征。传统的组学分析是在混合细胞群体上进行,导致这些差异被掩盖。近年来,单细胞基因组、表观基因组、转录组测序等技术发展迅速,为全面解析细胞异质性和识别不同表型细胞类型提供了强有利工具。这些方法应用于不同类型的干细胞,包括多能干细胞和组织特异性干细胞,在干细胞领域取得了令人兴奋的新发现。本文综述了单细胞组学测序技术的最新进展,并对单细胞组学测序的方法和应用进行了展望。     

Monoclonal anti-human T cell antibody and PAP-s conjugate —Preparation and selective cytotoxic properties on leukemic cell

Pokeweed antiviral protein (PAP-s) was prepared from seeds of Phytolacca americana. Monoclonal antibody against human pan-T lymphocyte Wu71 was linked to PAP-s by a disulfide bond. The results of SDS-PAGE, double immunodiffusion of active monoclonal antibody and PAP-s showed that the conjugate was highly cytotoxic to the human T-leukemic cell line CEM, but not to antigen-negative cell line SP₂/O. At a concentration of 10⁻⁹mol/L, 76.4 % of the target cells were killed, as compared with 10.1 % 10⁻⁹mol/L of free PAP-s. Treatment of the CEM cells with conjugate at 10⁻⁹mol/L reduced their rate of protein synthesis by 72.4 %, as determined with¹⁴C-leucine incorporation. The immunotoxin may be useful for the in-vitro eradication of leukemic cells in autologous bone marrow transplantation to leukemia patients.     

肾小球细胞与糖尿病肾病

在糖尿病肾病的发生发展过程中，高糖刺激肾小球固有细胞合成和分泌多种生物活性因子，而且肾小球固有细胞可以通过这些因子相互作用，导致肾多种细胞肥大、细胞外基质过度积聚，从而导致尿病肾病的特征性病理改变。联合使用这些生物活性因子的拮抗剂或抗体，将有助于防治糖尿病肾病。     

肝星状细胞凋亡与线粒体

肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)活化增殖是形成肝纤维化的主要因素.活化的HSC转分化为肌纤维母细胞样细胞表型,产生大量胶原蛋白等细胞外基质(extracellular matrix, ECM)成分,同时活化的HSC表达金属蛋白酶组织抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1, TIMP-1)、金属蛋白酶组织抑制因子-2(tissue inhibitor of metalloproteinase 2, TIMP-2)以及转化生长因子-β(transforming growth factor β, TGF-β)等阻碍ECM的降解,加重肝纤维化的程度.