野生型p53融合基因对大鼠肝癌细胞凋亡的作用

用正常的p53基因替代肿瘤细胞中突变的p53基因成为基因治疗的策略之一。构建的绿色荧光蛋白与野生型p53的融合基因,根据融合蛋白的荧光强度来判断p53蛋白的产量与定位,观察p53基因在细胞内表达及促进凋亡作用,探讨恢复p53基因正常功能对肝癌治疗效果的检测手段。     

腺病毒介导的野生型p53基因转移致血管平滑肌细胞凋亡

曾报告腺病毒介导的野生型ｐ５３基因转移能明显抑制体外培养的血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）的增殖，为探讨ｐ５３基因抑制ＶＳＭＣ增殖的机制，应用电镜、流式细胞计数仪、原位末端标记等方法，观察ｐ５３基因转移对ＶＳＭＣ凋亡的影响。结果证明ｐ５３基因转移可有效地导致ＶＳＭＣ发生凋亡，从而进一步为心血管疾病基因治疗的研究提供可靠的实验依据     

外源性野生型p53基因对人肺癌细胞生长的抑制

目的观察外源性野生型ｐ５３基因对有ｐ５３基因突变的人肺癌细胞系生长的影响。方法用多聚酶链反应单链构象多态性及ＤＮＡ测序，选择ｐ５３基因突变的人肺巨细胞癌系８０１Ｄ为受体细胞。构建野生型ｐ５３表达质粒ＰＺＩＰｎｅｏＳＶｐ５３。用基因枪介导外源基因。建立转染细胞系８０１Ｄｐ５３。用聚合酶链反应检测外源基因，观察转染细胞恶性生长的变化。结果转染细胞系８０１Ｄｐ５３体外长期传代有ｎｅｏ基因及外源ｐ５３基因存在，转染细胞生长明显受到抑制，克隆形成抑制率达９６％，裸鼠异种移植致瘤性降低，肿瘤生长明显缓慢。结论外源性野生型ｐ５３经基因枪导入有ｐ５３基因突变的人肺癌细胞后可长期存在于转染细胞中，且明显抑制转染细胞的恶性生长     

介导野生型p53基因转移的重组腺病毒的构建研究

应用同源重组方法成功地构建了携带野生型ｐ５３基因的复制缺陷型重组腺病毒，通过光镜、电镜、酶切、ＰＣＲ共扩增等方法证实了构建载体的正确性，并使常规的同源重组方法进一步改进，简化了载体构建的操作程序，结果准确，成功率高。本结果可用于以腺病毒为载体进行肿瘤、心血管疾病等基因治疗的研究。     

腺病毒介导的人野生型P53、GM-CSF和B7-1基因转移有效地诱导肝癌细胞的生长抑制和凋亡

观察携带人野生型Ｐ53、ＧＭ ＣＳＦ和Ｂ7 1基因的重组腺病毒载体 (ＢＢ 10 2 )转染ＢＥＬ 74 0 2、ＨＬＥ及ＨｕＨ 7肝癌细胞后Ｐ53基因的表达 ,以及诱导肝癌细胞的增殖。ＢＢ 10 2转染肝癌后的不同时间 ,用锥虫蓝染色计数活细胞数 ,免疫组织化学法检测Ｐ53基因的表达 ,ＴｄＴ法原位检测肝癌细胞的调亡。结果表明 ,转染ＢＢ 10 2后肝癌细胞生长明显受到抑制 ,ＢＥＬ 74 0 2、ＨＬＥ及ＨｕＨ 7肝癌细胞的受抑率分别为 58.5%、81.5%及 71.1% ,其中对Ｐ53基因突变的肝癌细胞的抑制程度要大于对Ｐ53基因为野生型肝癌细胞的抑制程度 ,转染ＢＢ 1…     

腺病毒介导的p53抑制肝癌生长的实验研究

目的探讨外源性野生型Ｐ５３（Ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｐ５３, ＷＴ－ｐ５３）基因对肝癌细胞生长的影响。方法通过表达ＷＴ－ｐ５３的重组腺病毒载体（Ａｄ－ｐ５３）,将ｐ５３基因导入肝癌细胞株中,用ＭＴＴ法检测Ａｄ－ｐ５３对各细胞株生长特性的影响,流式细胞仪分析各组细胞中ＤＮＡ含量及凋亡的比例。建立裸小鼠移植瘤模型后,瘤内注射Ａｄ－ｐ５３。最后处死动物,移植瘤称重, ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测ｐ５３和ｐ２１蛋白的表达情况。结果外源性ｐ５３基因的导入可导致肝癌细胞生长的明显抑制,表现为既诱导细胞凋亡,又诱导细胞周期阻滞。瘤内注射Ａｄ－ｐ５３后移植瘤生长明显受抑制,并出现瘤组织中ｐ５３和ｐ２１蛋白表达的上调。结论腺病毒介导的ｐ５３基因治疗能有效控制肝癌的生长。     

野生型p53基因转移抑制兔心肌细胞生长的实验研究

目的 探讨野生型p53基因转移对兔心肌细胞生长的抑制作用及p53基因用于心肌肥厚基因治疗的可能性。方法 将腺病毒介导的野生型p53基因转人体外培养的乳兔心肌细胞，应用生化染色方法、Westernblot杂交检测野生型p53基因的转染效率及表达结果，采用透射电镜、MTT增殖抑制实验（MTT）及流式细胞仪细胞周期分析方法研究野生型p53基因对细胞生长的抑制作用。结果 重组腺病毒能有效地将野生型p53基因转入心肌细胞中，并且检测到p53基因表达；转入的p53基因导致心肌细胞收缩、体积变小；MTT结果显示，野生型p53基因能够抑制心肌细胞生长，且生长抑制率呈现时间和剂量依赖性；心肌细胞增殖周期结果显示，细胞G0-G1期百分含量明显高于对照组，提示发生G1期阻滞。结论 野生型p53基因能高效转染体外培养的心肌细胞，对心肌细胞生长有明显的抑制作用，其抑制作用的机理是由于野生型p53基因影响心肌细胞的增殖周期，以上结果为心肌肥厚的基因治疗提供了重要的实验依据。     

野生型p53基因转移对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

作者用正确构建的带野生型p53基因的复制缺陷型重组腺病毒感染体外培养的血管平滑肌细胞(VSMC),结果表明p53基因转移对VSMC的增殖具有明显的抑制作用;PCR扩增法证实了病毒感染的VSMC中含有外源性p53基因;半定量逆转录PCR方法显示有p53基因mRNA的表达;Western blot印迹转移证明有外源性p53蛋白的表达。进一步证明了作者构建的重组p53腺病毒载体的正确性和有效性,为高血压病、动脉粥样硬化、PTCA术后再狭窄等疾病的基因治疗提供了实验依据。     

野生型p53基因转移对体外增减的血管平滑肌细胞增殖的抑制？…

正确构建了介导野生型Ｐ５３基因转移的复制缺陷重组腺病毒，将其感染体外增减的兔血管平滑肌细胞，结果表明腺病毒能介导野生型ｐ５３基因高效地转移和表达，对ＶＳＭＣ的增殖具有明显的帽作用；     

细胞凋亡和p53、bc1-2蛋白在肝细胞癌中的表达

目的：探讨HCC中细胞凋亡情况及其与p53和bcl-2蛋白表达的关系。方法：细胞凋亡采用原位细胞凋亡检测法．p53和bcl-2蛋白表达采用免疫组他方法．细胞凋亡与p53、bcl-2蛋白表达的关系采用双标记法进行检测。结果：70例HCC中。癌组织和癌周组织中细胞凋亡指数(1000个细胞中)分别为3．63士1．96和10．63±3.64，bcI-2和突变型p53置自检出率分别为22．9％和42．9％．bcl-2主要表达在癌周组织中，抑制肝细胞凋亡。而p53则仅表过在癌组织，抑制癌细胞凋亡。双染色显示细胞凋亡与p53或bel-2不同时在一个细胞中表选。结论：HCC癌细胞凋亡减弱一突变型p53蛋白是癌细胞凋亡减弱的主要原因．而be-2则可能在维持HCC的肝脏功能方面具有重要作用。     

锤头状核酶对肝癌突变基因p53的抑制作用

目的 探讨p53核酶对肝癌细胞突变型抑癌基因p53的抑制作用。方法 应用计算机设计并合成针对突变型p53(249位密码子AGG→AGT)的锤头状核酶RZ，构建其体外转录和真核表达载体，检测核酶对突变型p53(mtp53)的体外切割作用，并在Lipofect AMINE^TM2000的介导下转染肝癌细胞MHCC97，应用逆转录聚合酶联反应(RT—PCR)检测核酶对肝癌细胞突变型p53的抑制作用。结果 测序证实核酶基因被正确克隆人体外转录载体pBSKU6和真核载体pEGFPC1中。体外切割效率为42％，而野生型p53(wtp53)没有被切割。在Lipofect AMINETM2000的介导下成功转染肝癌细胞MHCC97，RT—PCR检测证实突变型p53的mRNA水平明显下降，细胞内的切割效率为69％。结论 p53核酶可成功抑制肝癌细胞中突变型p53的表达，为肝癌的基因治疗提供了一个新的选择。     

p16、p53、p21基因对肺癌细胞增殖的影响

目的 观察肿瘤抑制基因ｐ１６,ｐ５３及细胞周期信赖激酶抑制物ｐ２１基因单独或联合应用时对肺癌细胞增殖的影响。方法 应用十八酰基胺阳离子脂质体介导ｐ１６,ｐ５３,ｐ２１基因单独或共转染到非小细胞肺癌细胞系Ａ５４９和小细胞肺癌细胞系ＳＨ７７,观察转染后１,３,５日该细胞增殖的活力。采用四甲基偶氮唑 盐微量酶反应比色法（ＭＴＴ法）测定吸光度（Ａ）,以检测细胞增殖活力,结果 Ａ５４９细胞系：Ａ均值分别为：     

人p53/荧光蛋白融合基因在高转移人肝癌细胞中的表达与定位

目的 观察Ｐ５３基因在肝癌细胞中的正常表达及定位情况。方法 根据野生型Ｐ５３基因的编码顺序,ＰＣＲ主增突变的ＷＴ－Ｐ５３基因,使其３＇端的终止密友ＴＧＡ突变为ＴＧＡ突变为ＴＧＧ,用基因重组技术将共与绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｌｎ,ＧＦＰ）融合,通过真核表达质粒－脂质体介导,导入人高转移肝癌细胞系ＭＨＣＣ９７（ＰＣＲ检测有Ｐ５３基因突变）中、用荧光显微镜观察Ｐ５３     

Adenovirus-mediated p53 gene transfer sensitizes hepatocellular carcinoma cells to heavy-ion radiation

Background The purpose of this study was to investigate whether adenovirus-mediated p53 transfer could sensitize hepatocellular carcinoma to heavy-ion irradiation. Methods HepG2 cells were preexposed to a ¹²C⁶⁺ beam, and then infected with replication-deficient adenovirus recombinant vectors containing human wild-type p53 (AdCMV-p53) (¹²C⁶⁺ irradiation + AdCMV-p53 infection). The survival fraction was determined by clonogenic assay. The cell cycle, cell apoptosis, and p53 expression were monitored by flow cytometric analysis. Results p53 expression in ¹²C⁶⁺ irradiation + AdCMV-p53 infection groups was markedly higher than that in ¹²C⁶⁺ irradiation only groups (P < 0.05), suggesting that the preexposure to the ¹²C⁶⁺ beam promoted the expression of exogenous p53 in HepG2 cells infected with AdCMV-p53 only. The G₁-phase arrest and cell apoptosis in the ¹²C⁶⁺ irradiation + AdCMV-p53 infection groups were significantly more than those in the ¹²C⁶⁺ irradiated groups (P < 0.05). The survival fractions of the ¹²C⁶⁺ irradiation + AdCMV-p53 infection groups decreased by 30%–49% compared with those of the ¹²C⁶⁺ beam-irradiated only groups (P < 0.05). Conclusions Adenovirus-mediated p53 gene transfer can promote G₁-phase arrest and cell apoptosis, thus sensitizing hepatocellular carcinoma cells to heavy-ion irradiation.     

人原发性肝癌细胞株受照射后凋亡与癌基因表达

目的 探讨人原发性肝癌细胞株受照射后凋亡与ｂｃｌ－２、ｐ５３基因表达产物关系。方法 选择人原发性肝癌细胞株ＱＧＹ,１８０ＫＶＸ线照射,流式细胞仪技术定量测定凋亡发生率,单克隆抗体免疫化法测定受照射后ｂｃｌ－２、ｐ５３表达产物,Ｓｏｎｙ Ｍｉａｓ－３００ Ｓｐａｔｏ图象分析仪分析结果。结果 ＱＧＹ－７７３０细胞株自发凋亡率为４．７９％,随照射后时间延长及照射剂量增加凋亡发生率增加。Ｂｃｌ－１、ｐ５３     

U6嵌和型Maxizyme对肝癌突变抑癌基因p53的抑制作用

目的探讨U6嵌和型Maxizyme对肝癌突变抑癌基因p53的抑制作用。方法应用计算机设计针对肝癌突变抑癌基因p53(mtp53)249位密码子(AGG→AGT)Maxizyme(Mz)的基因片段,构建其真核表达载体,使抗mtp53的Mz嵌于U6表达系统中,细胞外由T7 RNA聚合酶转录,细胞内由RNA聚合酶Ⅲ高效转录。检测Mz在细胞外对mtp53的切割效率。在LipofectamineTM2000介导下转染肝癌细胞MHCC97,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Mz对肝癌细胞mtp53的抑制作用,western blot分析mtp53蛋白表达水平,并用四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察肿瘤细胞的生长情况。结果在细胞外,Mz可特异性切割靶基因mtp53,切割效率为42%,而野生型p53(wtp53)没有被切割。RT-PCR和western blot检测结果提示转染Mz的MHCC97内mtp53 mRNA和蛋白(5.3 ×104)表达均明显下降,转染Mz的MHCC97增殖速度明显降低。结论U6表达系统能高效启动核酶等小分子RNA的转录,U6嵌和型Maxizyme在细胞内外均可特异性抑制mtp53表达,抑制肝癌细胞增殖,有望开发为肝癌基因治疗的新方法。     

腺病毒介导MDA-7/IL-24选择性促进肝癌细胞的凋亡和增殖阻滞

目的 观察MDA-7／IL-24基因对不同p53状态人肝癌细胞HepG2、MHCC97L以及Hep3B和正常的肝细胞L02的选择性杀伤作用，为肝癌的基因治疗提供理论基础。方法 将携带人MDA-7／IL-24基因的腺病毒Ad．mda-7感染人正常肝细胞L02和不同p53状态的肝癌细胞HepG2，MHCC97L、Hep3B。通过逆转录聚合酶链反应方法观察MDA7／IL24基因的表达，酶联免疫吸附法检测细胞培养上清液中MDA-7／IL-24蛋白的浓度，通过四甲基偶氮唑盐染色法及Hoechst染色观察MDA-7／IL-24对肝癌细胞的生长抑制和杀伤作用，Annexin-V和碘化丙啶双染后流式细胞仪检测细胞的凋亡，应用流式细胞仪检测细胞周期。结果 复制缺陷型腺病毒能介导外源基因MDA-7／IL-24在肝癌细胞株HepG2，MHCC97L和Hep3B以及正常细胞L02中高效表达。细胞培养上清液中有MDA-7／IL-24蛋白表达。MDA-7／IL-24能明显抑制各种肝癌细胞的生长，Hoechst染色提示MDA-7／IL-24促进肝癌细胞的凋亡，流式细胞仪提示MDA-7能选择性杀伤肝癌细胞而对正常的肝细胞无影响，细胞周期分析提示MDA-7／IL-24阻滞肝癌细胞在G2／M期，同时对正常的肝细胞没有促凋亡作用和增殖阻滞作用。结论 复制缺陷型重组腺病毒载体Ad．mda-7能介导MDA-7／IL-24基因在人肝癌细胞中高效表达，选择性地杀伤肝癌细胞HepG2、MHCC97L和Hep3B，促进细胞增殖阻滞及诱导肿瘤细胞凋亡而与肿瘤细胞的P53基因的状态无关，同时对正常的肝细胞L02无任何毒性作用。     

Adenovirus-mediated FasL gene transfer into human gastric carcinoma

AIM: To evaluate the possible value of FasL in gastric cancer gene therapy by investigating the effects of FasL expression on human gastric cancer cell line. METHODS: An adenoviral vector encoding the full-length human FasL cDNA was constructed and used to infect a human gastric cancer (SGC-7901) cell line. FasL expression was confirmed by X-gal staining, flow cytometric analysis and RT-PCR. The effect of FasL on cell proliferation was determined by clonogenic assay, cytotoxicity was detected by MTT assay, and cell viability was measured by trypan blue exclusion. The therapeutic efficiency of Ad-FasL in vivo was investigated with a xenograft tumor model in nude mice. RESULTS: SGC-7901 cells infected with Ad-FasL showed increased expression of FasL, resulting in significantly decreased cell growth and colony-forming activity when compared with control adenovirus-infected cells. The cytotoxicity of anti-Fas antibody (CH-11) in gastric cancer cells was stronger than that of ActD (91±8 vs60±5,P<0.01), and the cytotoxicity of Ad-FasL was stronger than that of CH-11 (60±5 vs50±2, P<0.05). In addition, G1-phase arrest (67.75±0.39 vs 58.03±2.16, P<0.05) and apoptosis were observed in Ad-FasL-infected SGC-7901 cells, and the growth of SGC-7901 xenografts in nude mice was retarded after intra-tumoral injection with Ad-FasL (54% vs 0%,P<0.0001). CONCLUSION: Infection of human gastric carcinoma cells with Ad-FasL induces apoptosis, indicating that this target gene might be of potential value in gene therapy for gastric cancer.