肿瘤抗原基因MAGE-3的克隆、原核表达与纯化

目的: 克隆人MAGE-3基因并进行原核表达和分离纯化. 方法: 通过RT-PCR从人黑色素瘤细胞株中扩增MAGE-3全长cDNA,经PCR扩增MAGE-3基因3′端324 bp片段,克隆入pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达质粒pGEX/MAGE-3,对含有该质粒的大肠杆菌DH5α进行诱导表达和分离纯化.结果: 经RT-PCR扩增出大小约950 bp的基因片段,以此为模板经PCR扩增出约320 bp片段,测序结果与GenBank公布的MAGE-3序列一致,成功构建了pGEX/MAGE-3原核表达质粒,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达Mr约42 000的GST融合蛋白,纯化的蛋白纯度为89%.结论: 成功克隆了人MAGE-3基因全长cDNA并对其3′端324 bp片段编码的108个氨基酸的蛋白进行了原核表达和分离纯化,为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础.     

犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因片段的克隆和表达

目的　构建pMal N重组表达载体 ,转化E .coliDH5α ,诱导表达犬瘟热病毒 (CDV)重组核衣壳 (N)蛋白。方法　采用RT PCR技术 ,从CDVRNA中扩增编码N蛋白的基因片段 ,通过连接反应 ,构建重组克隆载体和重组表达载体 ,转化感受态。E .coliDH5α细胞。通过IPTG诱导表达CDV重组N蛋白。结果　扩增出约 1 7kbCDV全长的主要结构蛋白N蛋白基因 ,通过PCR获得 5 36bpN蛋白基因片段。将N蛋白基因片段克隆入原核表达载体pMal C2 ,表达产物麦芽糖结合蛋白 (MAP)与N蛋白的融合蛋白的相对分子质量约 6 0× 10 3,与预期大小一致。结论　构建的pMal N重组载体所表达的CDVN蛋白为进一步研究CDV的特异、敏感的抗体检测方法打下基础     

人Norpeg蛋白的原核表达及其抗体的制备

目的 原核表达Norpeg C端编码区并制备小鼠抗Norpeg多克隆抗体。方法 将Norpeg基因C端编码区克隆进原核表达载体pGEX4T-1中,转化E.coli,以WFG诱导重组蛋白的表达。以纯化的重组目的蛋白作为免疫原免疫小鼠,制备相应的多克隆抗体。结果 成功构建原核表达载体,表达了重组蛋白并制备了小鼠抗Norpeg多克隆抗体。结论 人Norpeg C端编码区能够在体外大肠杆菌中获得融合表达,制备的小鼠抗Norpeg多克隆抗体特异性较高,为下一步深入Norpeg功能研究提供了重要基础。     

重组人TALL-1基因全长及其胞外区片段的克隆和表达

目的　获得人TALL 1基因全长及其胞外区片段 ,构建重组表达载体并对其诱导表达。方法　利用RT PCR技术从人外周血单个核细胞中扩增出TALL 1全长及其胞外区基因编码区序列 ,克隆于载体pGEX 4T 1中 ,测序证实序列正确后转化大肠杆菌BL2 1,以IPTG诱导表达 ,SDS PAGE和Westernblot分析表达产物。结果　①从人外周血单个核细胞中扩增出编码TALL 1基因全长及其胞外区片段cDNA序列 ,序列测定证实与文献报道的序列一致 ;②成功构建了GST融合表达载体pGEX 4T 1 hTALL 1和pGEX 4T 1 sTALL 1;③表达了hTALL 1 GST和sTALL 1 GST融合蛋白。结论　人TALL 1基因全长及其胞外区片段的克隆成功及融合蛋白的表达 ,为进一步探索TALL 1抗原表位打下了基础。     

Nogo-66蛋白氨基酸肽的克隆及在原核细胞的表达

目的: 克隆编码Nogo-66氨基酸多肽基因,构建原核重组表达载体,并诱导其在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达。方法: 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增出编码Nogo蛋白环外-66氨基酸多肽基因,将其克隆于T载体PMD18-T,酶切鉴定后再亚克隆于原核表达载体pET-42a(+),酶切及测序证实序列正确后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白-Nogo-66。结果: 克隆了编码Nogo蛋白环外-66氨基酸多肽基因,构建了融合蛋白的重组表达质粒,融合蛋白的表达随着时间延长增加。结论: 获得了编码Nogo蛋白环外-66氨基酸多肽基因及其原核表达产物,对研究Nogo蛋白的生物学功能及其mAb的制备奠定基础。     

人PNGase片段的克隆表达和多克隆抗体制备

目的: 利用分子生物学技术克隆、表达、纯化PNGase的N端片段,并制备其多克隆抗体.方法: 利用内切酶从人PNGase全长质粒上切下PNGase N端97个氨基酸的编码序列克隆入pGEX4t1载体,进行原核系统诱导表达并纯化出目的蛋白,用该蛋白免疫大白兔制备其多克隆抗体,经免疫印记检测.结果: 重组的PNGase N端片段经测序显示构建成功,制备的抗体可以特异性识别小鼠组织内源性PNGase.结论: 本研究结果为进一步的研究奠定了基础.     

重组人可溶性THANK在大肠杆菌中的高效表达

目的:克隆人THANK的全长基因及编码可溶性胞外区的基因 ,并在大肠杆菌中表达可溶性THANK.方法:采用RT-PCR从PMA诱导的 HL60细胞中克隆人THANK全长编码基因,继以PCR扩增出可溶性THANK编码区基因(134～285位氨基酸),PCR产物克隆于pMD-18T,经DNA测序证实后亚克隆到pET-11a中.重组质粒转化B L21,以1 mmol/L IPTG进行诱导表达产物,SDS-PAGE分析表达产物,对重组蛋白经纯化复性后测定生物学活性.结果:RT-PCR扩增出编码人THANK全长编码基因及P CR扩增出THANK134-285基因的cDNA,经序列分析证实与文献报道完全一致.含有THA NK134-285编码基因的表达载体,转化大肠杆菌后表达出相对分子质量约18 000的重组蛋白.该重组蛋白经纯化后能够诱导U937细胞凋亡.结论:成功克隆了人THANK基因,并在大肠杆菌中表达重组可溶性THANK,该重组蛋白在实验条件下具有诱导U937细胞凋亡的作用.     

人VIGILIN基因分段克隆及表达大鼠肾组织干细胞的分离培养与鉴定

目的 探讨人高密度脂蛋白结合蛋白(HDLBP)-VIGILIN蛋白与其他蛋白质相互作用的机制。 方法 根据 VIGILIN基因全长编码区的结构域,将 VIGILIN基因全长编码区分为N端、KH1-7、KH8-12、KH13-14、C端5段,以pDsred2-N1/ VIGILIN为模板分别扩增5个片段及全长cDNA后克隆至pGEX 5X 3原核表达载体, 测序,然后将鉴定后的重组质粒转化到表达宿主菌E.coli BL21中进行诱导表达GST-VIGILIN融合蛋白,并用SDS-PAGE电泳及Western blot检测蛋白表达结果。结果 成功扩增了人 VIGILIN基因编码区分段片段,并且构建到原核表达载体中,经酶切、测序鉴定证实序列完全正确,重组载体构建成功,并且在pGEX原核表达系统中诱导表达GST-VIGILIN融合蛋白,经SDS-PAGE电泳及Western blot检测初步证实表达成功。 结论 本实验首次根据VIGILIN蛋白不同的结构域成功构建了GST-VIGILIN分段克隆原核表达载体,并且对融合蛋白表达条件进行了优化,成功表达了GST 融合蛋白。     

人ALEX2部分cDNA序列的克隆与表达

目的：克隆人ALEX2基因部分片段的cDNA,构建重组表达载体并诱导其表达．方法：通过RT—PCR技术从人胚胎脑组织中特异扩增出ALEX2基因部分编码序列片断(630—1058位核苷酸),克隆入pGEM—Teasy载体中,测序后亚克隆于表达载体pGEX-4T-3中,酶切鉴定正确,转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导4h后,可表达Mc417000的目的蛋白．结果：特异扩增出大小约440bp的片断,经测序与已知序列完全一致,构建了融合蛋白的重组表达质粒PGEX-ALEX2,表达的融合蛋白产物经凝胶薄层扫描检测,占菌体总蛋白量的15．5%．结论：获得了人ALEX2部分基因编码片断及其原核表达产物,为下一步ALEX2 mAb的制备和研究其生物学功能奠定了基础．     

白血病分化相关基因dif14的原核表达

目的 :构建 pGEX dif14原核表达载体 ,在大肠杆菌中表达dif14蛋白片段以获得其抗原 .方法 :采用N末端融合谷胱甘肽巯基转移酶 (GST)的 pGEX 4T 1载体 ,根据dif14基因开放读框N端 5 2氨基酸序列设计引物PCR扩增并购建原核表达载体 ,测序证实 .在大肠杆菌DH5α中进行表达 .结果 :测序证实dif14原核表达载体构建正确 ,含 pGEX dif14表达质粒的大肠杆菌经异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导后能够表达约Mr35× 10 3 的融合蛋白 .结论 :成功地构建了原核表达质粒 pGEX dif14 ,并在大肠杆菌得到表达 ,为研究dif14的功能奠定了一定的基础     

人高迁移率族蛋白1基因的克隆和表达

目的：克隆人高迁移率族蛋白1(HMG—1)编码基因，构建重组表达载体并对其诱导表达．方法：通过RT—PCR方法扩增出人外周血单个核细胞中HMG—1的编码基因，克隆于载体pGEM—T easy，测序分析后亚克隆于表达载体pGEx—4T—2，测序证实序列正确后转化大肠杆菌DH5α，经IPTG诱导4h后可表达M，约56000的融合蛋白GST—HMGl．结果：克隆了人HMG—1的编码基因，构建了融合蛋白的重组表达质粒pGEx—HMGl，表达的融合蛋白产物经凝胶薄层扫描检测，占全菌总蛋白的0．23．结论：获得了人HMG—1编码基因及其原核表达产物，对研究人HMG—1的生物学功能及其mAb的制备具有重要意义．     

人黑色素瘤抗原MAGE-A10的基因克隆及原核表达

目的:扩增和克隆人黑色素瘤抗原MAGE-A10(melanoma antigen A10)cDNA,构建原核表达载体并在大肠杆菌表达. 方法:从人黑色素瘤细胞系LiBr中提取总RNA,用RT-PCR从中扩增出MAGE-A10 cDNA,插入载体pMD18-T中. 测序正确后,克隆至原核表达载体pGEX-4T-3中,构建重组表达载体pGEX-4T-3-MAGE-A10,转化大肠杆菌BL21株进行表达. 经IPTG诱导表达,谷胱甘肽亲和层析获得重组目的蛋白. 结果:成功获得MAGE-A10编码基因并构建原核表达载体,测序结果与GenBank收录序列相一致. 可以获得部分可溶性的原核重组蛋白,经亲和层析和分析,证实融合蛋白占总量的58.9%. SDS-PAGE分析其相对分子质量(Mr)为67 000,Western blot证实为目的蛋白. 结论:成功获得MAGE-A10 cDNA,构建得原核表达载体并获得高效表达. 本研究为制备MAGE-A10 mAb及研究MAGE-A10可能参与肿瘤发生发展的机制奠定了基础.     

SARS相关冠状病毒S1融合蛋白的原核表达与纯化

目的：克隆严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV)S1蛋白编码DNA，构建原核表达质粒pGEX-5T／S1，并诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白。方法：采用PCR方法扩增合成S1片段，并克隆入载体中，经双酶切鉴定和测序后把S1序列定向插入原核表达载体pGEX-5T的多克隆位点，转化大肠杆菌K802，将纯化后的融合蛋白用于SARS—CoV抗体阳性血清的检测。结果：GST—S1融合蛋白以可溶形式表达，纯化后的蛋白用ELISA法检测，结果与对照相符。结论：成功诱导原核表达并纬化出融合蛋白S1，为将其应用于SARS—CoV的特异性检测和亚单位疫苗研究奠定了基础。     

人肝脏再生增强因子cDNA的克隆、表达及纯化

克隆人肝脏再生增强因子（ｈＡＬＲ）ｃＤＲＮＡ,构建重组表达载体并对其诱导表达,纯化。方法：提取胎儿肝组织总ＲＮＡ,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出ｈＡＬＲｃＤＮＡ,克隆于载体ｐＧＥＭ－Ｔ,酶切鉴定后亚克隆至表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－３,测序证实序列正确并转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,ＩＰＴＧ诱导表达融合蛋白ＧＳＴ－ｈＡＬＲ,表达物通过谷胱甘肽Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析纯化后进行Ｔｈｒｏｍｂｉｎ酶切,     

重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1的构建及表达

目的:构建人肿瘤相关抗原MAGE-1基因原核表达载体.方法:从人肝细胞性肝癌组织中提取总RNA,RT-PCR扩增出MAGE-1基因.酶切鉴定后,将其插入pGEM-T载体,再克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-1.将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4 h,SDS-PAGE及凝胶密度扫描分析目的蛋白的表达情况.结果:RT-PCR扩增出长度为927 bp的MAGE-1基因.重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-1转化大肠杆菌BL21(DE3)后经诱导表达,目的蛋白约57 000,占菌体总蛋白的23%.结论:成功构建出重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1,该载体在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达.     

GST-hPBD融合蛋白的克隆、表达及活化Rac1蛋白的分析

目的:制备GST-hPBD融合蛋白,探讨活化的Rac1在血管内皮细胞中的表达. 方法:采用RT-PCR方法克隆与活化Rac1相结合的hPBD基因片段,构建pGEX-2T/hPBD原核表达载体,并纯化GST-hPBD融合蛋白;应用pull down测定血管内皮细胞中活化Rac1的蛋白表达. 结果:基因测序证实原核表达载体pGEX-2T/hPBD序列正确,并在大肠杆菌中高效表达,纯化得到纯度约75% GST-hPBD融合蛋白,其Mr为36 000;进一步分析证实血管内皮细胞可表达活化的Rac1蛋白. 结论:成功构建了人pGEX-2T/hPBD原核表达载体,纯化了GST-hPBD融合蛋白,并检测到血管内皮细胞中活化Rac1蛋白的表达.     

嗜铬颗粒蛋白B-GST融合蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建小鼠嗜铬颗粒蛋白B(chromogranin B,CgB)重组原核表达载体。方法先用RT-PCR方法从小鼠脑基因组中扩增出CgB基因cDNA序列,应用T-A克隆技术,克隆到质粒pMD-T vector,经DNA测序证实基因碱基无误后,亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-1中进行表达。结果表达产物经Western Blot分析,在140处有一明显特异带,与预期结果相符。结论构建重组融合表达载体pGEX-CgB,在原核细胞中成功表达出小鼠CgB-GST融合蛋白。     

人微小病毒B19 VP1基因原核表达克隆的构建

①目的　构建人微小病毒B19VP1基因的原核高效表达系统。②方法　通过PCR扩增B19病毒主要抗原决定簇VP1区段基因 ,将目的基因克隆到原核表达载体pGEX 4T 2上 ,IPTG诱导表达融合蛋白 ,产物经亲和层析初步纯化 ,以Western Blot进行鉴定 ,并包被ELISA板 ,对临床血清进行检测。③结果　pGEX 4T 2 VP1可在大肠杆菌中高效表达 ,表达产物经纯化后可得单一目的蛋白条带。ELISA结果表明 ,其灵敏度、特异度等指标与德国Virion试剂盒有较好的符合率。④结论　该重组蛋白具有良好的抗原性 ,为研制和开发具有我国独立知识产权的B19病毒基因工程抗原ELISA诊断试剂盒提供了有价值的资料     

人氨肽酶N基因克隆和原核表达

目的：构建人氨肽酶N(APN)-谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合蛋白(APN-GST)，并进行原核表达。方法：根据人APN mRNA序列设计合成特异性引物，从人肝组织中提取总RNA并反转录成cDNA第一链，RT-PCR扩增人APN基因，并插入融合蛋白原核表达载体pGEX-4T，转化宿主菌BL21(DE3)细胞，异丙基锍基半乳糖(IPTG)诱导表达APN蛋白。包涵体经尿素变性、重折叠和亲和层析纯化。结果：重组质粒测序和酶切结果显示：APN基因已正确插入pGEX-4T，重组蛋白及纯化产物SDS-PAGE在135000处有一条明显的蛋白表达条带。结论：人APN基因已被成功地克隆、表达和纯化。     

家蝇幼虫Defensin成熟蛋白序列的克隆及在原核中的表达

目的 克隆家蝇幼虫defensin成熟蛋白编码序列并在大肠杆菌中表达，为进一步的研究该基因的功能奠定基础。方法 以家蝇幼虫cDNA文库为模板扩增出defensin基因的成熟蛋白全长编码序列，构建重组原核表达载体pGEX／MDEF，转化的克隆(质粒)通过筛选并测序鉴定。重组的pGEX／MDEF在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，SDS-PAGE鉴定其表达情况和分子质量并用抗鼠GST单抗作western blot杂交进一步鉴定融合蛋白的表达。结果 以家蝇幼虫cDNA文库扩增出一条长约为140bp的cDNA片段，经测序证实其为defensin基因成熟蛋白的编码序列，它编码含40个氨基酸的蛋白质，预测其分子质量单位为4kD。被成功克隆入pGEX-4T-1载体的家蝇幼虫defensin基因的cDNA，在重组大肠杆菌BL21(DE3)中诱导可大量生成相对分子质量30KD融合蛋白。结论 成功构建了家蝇幼虫defensin基因原核表达载体，且其成熟蛋白的编码序列在大肠杆菌高效表达。为下一步表达蛋白纯化，以及研究其生物活性提供了材料。