小鼠视网膜神经节细胞的纯化培养

目的 建立小鼠视网膜神经节细胞的体外纯化培养方法。方法 实验研究。采用Thy-1.2单克隆抗体免疫吸附法,将8～ 12只生后4～6d的C57BL/6小鼠视网膜消化后,制成视网膜神经细胞混合悬液,应用胶质细胞特异性抗体CD11b室温孵育后,去除混悬液中的胶质细胞,应用特异性抗体Thy-1.2吸附混合悬液中的视网膜神经节细...     

视网膜神经节细胞体外培养、纯化及生物学特性研究

目的 建立体外视网膜神经节细胞（ｒｅｔｉｎａｌｇａｎｇｌｉｎｃｅｌｌｓ,ＲＧＣｓ）培养和纯化模型。方法 出生后１－３天Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）乳鼠,ＲＧＣｓ在ｂａｓａｌｍｅｄｉｕｍｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）培养基中培养,相差显微镜下观察细胞生长规律。羊抗鼠单克隆抗体ＦＩＴＣ－Ｔｈｙ－１,１鉴定ＲＧＣｓ并通过Ｔｈｙ１．１单抗进行ＲＧＣｓ的分离纯化,四唑盐（ｍｏｎｏｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ,ＭＴＴ     

视网膜神经节细胞的培养

视网膜神经节细胞（ｒｅｔｉｎａｌｇａｎｇｌｉｏｎｃｅｌｓ，ＲＧＣｓ）是青光眼性视神经病变的主要损害细胞。近年来发展起来的ＲＧＣ培养技术为揭示其损害机制提供了１条有效途径。因此，我们需了解获得ＲＧＣｓ悬液最普遍的视网膜完全消化法及部分消化剥脱法，以及如何对ＲＧＣｓ进行分离、培养及鉴定技术。在作ＲＧＣｓ培养前需对培养皿、培养瓶等进行处理，常覆以聚－Ｌ－赖酸或预先培养的单层胶质细胞。在细胞鉴定方面，采用荧光逆行标记和Ｔｈｙ－１单克隆抗体免疫组化及细胞内电记录等方法。Ｔｈｙ－１单克隆抗体、板层素（ｌａｍｉｎｉｎ）、神经生长因子（ｎｅｕｒｏｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｓ，ＮＧＦ）、ａ－纤维母细胞生长因子（ａ－ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｓ，ａＦＧＦ）等，对培养ＲＧＣｓ有一定影响。     

视网膜神经节细胞的体外培养方法

近年来，视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell,RGCs）体外培养体系不断完善，为进一步体外研究奠定了良好的基础。现对RGCs的各种体外培养方法，以及RGCs的纯化、鉴定和活性判定等项技术综述如下。 （中华眼底病杂志，2002，18：82-84）     

视网膜色素变性大鼠闪光视网膜电图及神经节细胞动作电位改变

皇家外科学院大矗土（RCS）为遗传性视网膜色素变性的经典动物模型，随着感光细胞的变性死亡，包括视网膜神经节细胞（RGC）在内的内层神经元电生理功能究竟发生了怎样的改变，至今知之甚少。RGC以动作电位（AP）的方式将来自于感光细胞的信息向上传递，视网膜变性过程中RGC电生理特性的变化尚未见报道。     

视网膜神经节细胞多种培养方法的实验研究

目的探讨视网膜神经节细胞（ＲＧＣｓ）的多种培养方法。方法（１）在涂有鼠尾胶原的器皿上通过调整培养液培养：①乳鼠混合及纯化的ＲＧＣｓ；②单层星型胶质细胞上种植纯化的乳鼠ＲＧＣｓ；③引产胎儿混合ＲＧＣｓ。（２）检验鼠尾胶原及中脑顶盖提取液（Ｔｅ）对培养的乳鼠ＲＧＣｓ的影响。结果（１）混合培养的乳鼠及引产胎儿ＲＧＣｓ大多能存活２周以上；（２）纯化的乳鼠ＲＧＣｓ大多能存活４８ ｈ；（３）单层星型胶质细胞上种植的纯化乳鼠ＲＧＣｓ能存活４周以上；（４）鼠尾胶原及Ｔｅ对培养的乳鼠ＲＧＣｓ的贴壁及生长有明显的促进作用。结论通过调整培养液及改善微环境能用多种方法培养ＲＧＣｓ。     

同化培养液双界面法培养纯化的视网膜神经节细胞

视网膜神经节细胞 (ｒｅｔｉｎａｌｇａｎｇｌｉｏｎｃｅｌｌｓ ,ＲＧＣｓ)具有高度分化性 ,生后一般不再进行有丝分裂 ,ＲＧＣｓ体外培养属于原代培养 ;ＲＧＣｓ体外混合培养多能存活 4周 ,而纯化培养大多只能存活 4 8ｈ。我们采用星形胶质细胞同化培养液双界面法培养纯化的ＲＧＣｓ存活时间≥ 2周 ,为纯化ＲＧＣｓ提供较好的实验模型。一、材料和方法1 乳鼠脑源性单层星型胶质细胞的培养[1] :取生后 1～5ｄ的Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ(ＳＤ)乳鼠 (清洁级 ,华中科技大学同济医学院动物实验中心提供 ) 5只 ,断头处死 ,取额顶叶脑组织置于…     

睫状神经营养因子对培养大鼠视网膜神经节细胞的影响

目的 观察不同浓度睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)对培养大鼠视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell，RGC）生长、存活的影响。 方法 取15只生后2～3d Wistar大鼠视网膜组织进行细胞培养，通过Thy-1单克隆抗体免疫细胞化学对培养的RGC进行鉴定。实验分对照组和10、20、40 ng/mlCNTF组（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组），记录RGC存活时间，将培养第3、5、7天的RGC行四甲基偶氮唑盐（methylthio tetrazole,MTT）法测量吸光度(A)值［旧称光密度(OD)］。 结果 Thy-1单克隆抗体免疫组织化学检查显示培养3d的存活细胞90%以上为RGC。细胞存活期间实验组与对照组细胞均无明显突起,细胞体积无明显增大，实验组细胞存活时间比对照组长3~4d。培养第5、7d，Ⅰ组A值分别为0.075 8±0.0139、0.0693±0.0113，Ⅱ组A值分别为0.0902±0.0114、0.0825±0.0125，Ⅲ组A值分别为0.0792±0.0133、0.0653±0.0086，对照组A值分别为0.0620±0.0071、0.0513±0.0068。实验组与同时间对照组A值相比差异有显著性的意义（Ⅱ组与对照组相比P＜0.01，Ⅰ、Ⅲ组与对照组相比P＜0.05）。 结论 一定浓度的CNTF能促进培养大鼠RGC的存活，对RGC形态无影响。 (中华眼底病杂志, 2002, 18: 283-285)     

藏红花对慢性高眼压下兔眼视网膜神经节细胞的保护作用

青光眼的病理基础是在高眼压和(或)视网膜缺血的作用下,视网膜神经节细胞(RGC)及其轴突数目不断减少.在研究对慢性青光眼的损伤和治疗时,通常以RGC数目作为观察指标[1,2].我们将藏红花提取液用于慢性高眼压兔眼模型,通过观察RGC数目变化及其在电子显微镜下的改变,探讨藏红花对慢性高眼压兔眼RGC的保护作用.     

慢性高眼压大鼠视网膜神经胶质细胞组织病理学改变

目的 研究青光眼视网膜神经胶质细胞组织病理学改变及其在青光眼视网膜神经节细胞损伤中的作用机制.方法 对照实验研究.选用造模成功的慢性高眼压雄性SD大鼠72只,眼压＞22 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa).右眼为慢性高眼压眼,左眼为假手术对照眼.根据慢性高眼压模型建立的时间(手术结束时开始计算),将实验鼠分为6组(2、12 h,1 d,1、4、8周),每组12只鼠.正常组SD大鼠12只,平均眼压12.56 mm Hg.分别取实验各组(慢性高眼压)、假手术组及正常组大鼠4只眼球,冰冻切片行胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学染色,在激光共焦显微镜下观察视网膜星形胶质细胞及Müller细胞的GFAP表达情况;分别取实验各组(慢性高眼压)和正常组大鼠4只眼球,在视网膜铺片上进行GFAP免疫组织化学染色,进行星形胶质细胞计数并观察其形态;分别取实验各组(慢性高眼压)、假手术组及正常大鼠4只眼球的鼻侧半视网膜,在视网膜铺片上行小胶质细胞标记物OX42免疫组织化学染色,进行小胶质细胞计数并观察其形态;取剩余的颢侧中周部视网膜,半薄切片行甲苯胺蓝染色并进行Müller细胞计数.对不同时间点慢性高眼压组与正常组大鼠细胞表达数最进行比较,采用单因素多水平设计定量资料的方差分析.结果 慢性高眼压模型建立后2 h,即有活化的小胶质细胞出现;1 d后小胶质细胞的数量开始增加,为(327.40±68.32)个/mm2;1周后小胶质细胞的数量达到高峰,为(965.06±86.63)个/mmw,与正常组小胶质细胞数最比较,差异有统计学意义(F=196.56,P＜0.01);其后小胶质细胞数量逐渐减少.慢性高眼压模型建立后12 h,星形胶质细胞及Müller细胞开始呈现活化状态;4周时两种细胞的活化程度达到高峰,以后活化程度逐渐下降,且活化的星形胶质细胞在结构上出现明显异常,表现为星形胶质细胞突起变得粗短、僵硬,胞体的星型结构破坏;但慢性高眼压组视网膜星形胶质细胞及Müller细胞数量与正常组相比,差异均无统计学意义(F=1.36,1.89;均P＞0.05).结论 在慢性高眼压条件下,小胶质细胞可能是视网膜最早发生病理学改变的组织;活化的星形胶质细胞可出现明显的形态和结构变化,其结果不仅将加速神经节细胞的损伤,同时也会形成不利于神经节细胞轴突再生的视网膜微环境.     

Linear color opponency in carp retinal ganglion cells

Double opponent (i.e. red/green cone opponent in center and surround of the receptive field) ganglion cells in photopic carp retina were studied. It was found that a subclass of these cells (about 30%) was linearly opponent. For these cells the response to stimulation of the receptive field center could be constructed by summation of the responses due to stimulation of the red and green cone components separately. These linear opponent cells had smaller receptive field sizes than the nonlinear double opponent ganglion cells. Both strong (i.e. showing a marked sign inversion when wavelength is varied) and weak color opponency (i.e. showing no such inversion) can be found in the same linear double opponent ganglion cells. It is shown that such different behaviour can be understood from the change in amplitude, when intensity is varied, of the red and green cone components of the center responses of the cells. For small spots and low intensities, the red cone component dominates, which results in weak opponency; for large spots or high intensities strong opponency is observed.     

Notch-1调控视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化

目的研究Notch-1对视网膜前体细胞(RPC)向视网膜神经节细胞(RGC)分化的调控作用。方法分离培养胚胎14 d龄Sprague-Dawley大鼠的RPC，实验组和对照组分别用含有Notch-1反义寡核苷酸链和无关序列寡核苷酸链的培养液进行诱导分化14 d，倒置相差显微镜每天观察细胞的生长和分化情况，Thy1.1标记RGC并进行计数。结果实验组和对照组的RPC都能分化为多种视网膜细胞类型，包括Thy1.1阳性的RGC，但两组RPC向RGC分化的百分比不同。实验组和对照组RGC的百分比分别为(16.57±4.31)%和(31.19±6.90)%，两组比较差异有统计学意义（t=9.84,P＜0.001）。结论Notch-1对RPC的分化具有负向调控作用，阻断Notch-1能促进RPC向RGC分化。(中华眼底病杂志, 2007, 23: 101-103)     

大鼠视网膜神经节细胞的培养

目的建立视网膜神经节细胞（ｒｅｔｉｎａｌｇａｎｇｌｉｏｎｃｅｌｓ,ＲＧＣｓ）的体外培养方法,为ＲＧＣｓ的体外实验研究奠定基础。方法采用胰酶消化法将１６只生后２～３天的ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ大鼠视网膜制成细胞悬液后,接种于涂以鼠尾胶原的２４孔培养板,预先置入１ｃｍ×１ｃｍ的载玻片。细胞数约４×１０５个／孔,在３７℃、体积分数为５％的ＣＯ２培养箱中培养。于第１、３及５天行抗大鼠ＴＨＹ１单克隆抗体免疫细胞化学检查以鉴定ＲＧＣｓ,镜下计算每１０个高倍镜下（ｈｉｇｈｐｏｗｅｒ,ＨＰ）ＲＧＣｓ的细胞数和其轴突生长率。结果在鼠尾胶原上培养的ＲＧＣｓ生长良好,部分细胞伸出突起,且有些突起相互连接成网。培养第１天,ＲＧＣｓ数和轴突生长百分率分别为（４０１±９）个／１０ＨＰ和（２５．３４±０．７２）％,第３天为（３５１±６）个／１０ＨＰ和（３５．１６±２．２２）％,第５天为（１０９±８）个／１０ＨＰ和（６９．８４±０．９７）％。结论ＲＧＣｓ的体外培养能获成功,鼠尾胶原是ＲＧＣｓ体外生长的良好支持物。     

Rhythmicity in rabbit retinal ganglion cell responses

An interesting pattern of rhythmic spike bursts was observed in the light responses of rabbit retinal ganglion cells when using a fast time scale. This rhythmicity was found in all ganglion cell types tested in all parts of the retina. The presence and extent of rhythmicity was related to the intensity, size and shape of the light stimulus. The best stimulus extended into the receptive field surround yet still evoked a strong response from the center. We suggest that rhythmicity results from time delays in the inhibitory interactions between central and surround pathways to the ganglion cells.     

银杏叶提取物对培养的人眼视网膜神经节细胞的保护作用

目的 探讨银杏叶提取物（EGb761）对培养的人眼视网膜神经节细胞(RGC)的保护作用。方法 对照实验研究。将培养的人眼视网膜细胞分为对照组、谷氨酸组、EGb761组及谷氨酸+EGb761组,用Thy-1作为RGC特异性荧光抗体,以免疫流式细胞技术评价EGb761对人眼RGC的保护作用。多组间细胞存活率比较采用重复测量的方差分析,组间两两比较采用LSD t检验。结果 在不同干预因素作用下,RGC存活率呈现不同变化,对照组为(61.94±7.75)％,谷氨酸组为(44.59 +4.19)％,EGb761组为(75.05 +3.90)％,EGb761+谷氨酸组为(63.19±9.44)％;各组间RGC存活率比较差异有统计学意义(F=13.329,P＜0.01)。各组与对照组RGC存活率两两比较,显示谷氨酸组RGC存活率降低(P =0.010),EGb761组RGC存活率升高(P=0.019),EGb761+谷氨酸组与对照组RGC存活率差异无统计学意义(P =0.801);与谷氨酸组相比EGb761组和EGb761+谷氨酸组RGC存活率明显升高(P=0.000,0.020)。死亡RGC中大RGC所占百分比,EGb761组为(24.63+7.21)％,EGb761+谷氨酸组为(25.99±5.05)％,与对照组(36.69±2.92)％比较,两组死亡RGC中大RGC所占百分比均降低(P=0.001,0.002);与谷氨酸组(40.78±3.34)％相比,两组大RGC死亡百分比亦降低(P =0.000,0.000)。结论 EGb761可对抗谷氨酸兴奋性毒性造成的RGC损伤,对体外培养的人眼RGC具有明显的保护作用。     

线粒体动力学与视网膜神经节细胞

线粒体动力学是指细胞中的线粒体不断地分裂、融合、移动、运输和线粒体自噬等,这些动态的过程在调节线粒体的形态与功能中发挥关键作用,并对细胞的存活、代谢、功能等有重要影响.视网膜神经节细胞(RGCs)作为视网膜中一类特殊且重要的神经元,对线粒体的动力学改变特别敏感.有关常染色体显性遗传性视神经萎缩疾病的研究发现,控制线粒体融合的相关基因与RGCs功能密切相关.实验性青光眼模型提示,眼压升高引起RGCs的线粒体分裂增多,改变调节线粒体融合基因的表达,最终诱导RGCs的凋亡;线粒体在RGCs中的正常运输和分布对于RGCs轴突的功能至关重要.以上遗传性和实验性视神经病变的研究表明,线粒体动力学在调节RGCs的生存中发挥着核心作用,通过调控线粒体动力学来保护RGCs可能是一个非常有前景的治疗策略.本文将对线粒体动力学的主要内容和RGCs中的线粒体动力学进行阐述.     

Bimodal receptive fields of cat retinal ganglion cells

Receptive fields of cat retinal ganglion cells were stimulated by a drifting, sinusoidal luminance pattern of fixed contrast. The amplitudes and phases of the harmonic components in the response were determined as a function of spatial frequency. For most cells, the graphs of response vs spatial frequency (when plotted on linear scales) were unimodal and skewed towards zero frequency for all stimulus orientations. However, some cells had bimodal frequency response functions when the stimulus was in the non-preferred orientation. These unusual cells also exhibited a sudden phase-reversal of π radians which occurred at the frequency of the changeover between the two modes. Calculations based on the experimental data predicted two distinctly separate regions of high sensitivity within the receptive centres of such cells. A narrow bar stimulus was used to confirm that the receptive fields had, in effect, double centres.     

青光眼动物模型中自噬与视网膜神经节细胞的关系

青光眼的主要病理特征是视网膜神经节细胞(RGCs)渐进性丢失,而其损伤机制尚未明确.自噬是溶酶体降解物质的过程,该过程消除了受损的细胞成分,包括细胞器和长寿蛋白,这对维持细胞内环境的稳定有着重要作用.最近的研究表明,自噬参与了青光眼发病的病理生理过程.本文总结了视神经损害模型、视网膜缺血-再灌注模型、高眼压模型等不同青光眼动物模型中自噬与RGCs的关系,发现在不同青光眼动物模型中,自噬既可促进RGCs存活,又可促进其死亡,而在相同动物模型中,自噬对RGCs的调节也发挥着双刃剑的作用.同时阐述了自噬与具有神经元保护作用的Sirt1之间的相互作用.