低氧反应元件对大鼠骨骼肌成肌细胞转染表达血管内皮生长因子基因的调控作用

目的:研究低氧反应元件(HRE)对血管内皮生长因子(VEGF)基因121在原代培养大鼠骨骼肌成肌细胞中转染表达的调控作用。方法:利用分子生物学方法,构建pEGFP-C3-9HRE-CMV-VEGF121载体,通过脂质体介导将其转染到原代培养的大鼠骨骼肌成肌细胞中。在不同低氧浓度及不同缺氧时间下培养,通过RT-PCR、Western-Blot及荧光显微镜检测转基因成肌细胞的基因表达情况。结果:低氧浓度组可见明显目的基因条带,且随着氧浓度的降低及缺氧时间的延长,目的基因表达增强;低氧环境下,转染后的成肌细胞表达VEGF121蛋白产物明显增加;低氧环境下可见报告基因EGFP表达,常氧环境下未见报告基因表达。结论:以多拷贝HRE构建低氧启动子插入VEGF基因上游,可作为控制VEGF基因表达的开关,这对于防止VEGF基因转染的成肌细胞移植后VEGF基因过度表达所引起的安全问题,提高基因治疗的安全性有重要意义。     

慢病毒介导的RNAi对人胃癌细胞VEGF表达的影响

目的 探讨慢病毒介导的RNAi对人胃癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法 将构建的pGCL-GFP重组载体、phelper 1.0载体、phelper 2.0载体共转染293T细胞,包装产生重组慢病毒颗粒VEGF-RNAi-LV,并进行其病毒滴度测定.转染胃癌SGC7901细胞96 h后,用RT-PCR法检测细胞VEGF基因表达,ELISA法检测细胞培养液上清VEGF蛋白表达,四甲基偶氮唑盐比色法检测RNAi对胃癌细胞增殖的影响.结果 重组慢病毒包装滴度为2×109 TU/ml,VEGF-RNAi-LV转染胃癌细胞96 h后,其VEGF基因及培养液上清VEGF蛋白表达均明显下降,细胞生长缓慢,增殖受到抑制.结论 慢病毒介导的RNAi可明显抑制人胃癌细胞VEGF基因和蛋白表达,抑制细胞增殖.     

慢病毒介导环状RNA mmu-circ-0001033过表达抑制低氧性小鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的实验研究

目的探讨慢病毒介导环状RNA mmu-circ-0001033过表达对低氧性小鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响,为环状RNA防治低氧性肺动脉高压(HPH)提供实验依据。方法体外原代培养小鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC),并随机分为4组:常氧组、低氧组、mmu-circ-0001033过表达慢病毒转染+低氧组、空白载体慢病毒转染+低氧组。体外构建环状RNA mmu-circ-0001033过表达慢病毒载体,转染PASMC。运用qRT-PCR技术检测各组PASMC中mmu-circ-0001033的表达水平,采用CCK-8法检测各组PASMC增殖,对各组的指标值进行统计学比较和分析。结果低氧处理导致PASMC中mmu-circ-0001033的表达明显下调,且呈时间依赖性;与对照组比较,慢病毒转染组中mmu-circ-0001033表达显著上调(P0.05),提示mmu-circ-0001033过表达慢病毒成功转染入PASMC,且并高效表达;与常氧组比较,低氧组和空白载体慢病毒转染+低氧组PASMC增殖明显增多(P0.05),而mmu-circ-0001033过表达抑制了低氧对PASMC的促增殖作用。结论过表达的mmu-circ-0001033显著抑制低氧所诱导的PASMC的增殖,为明确mmu-circ-0001033作为HPH防治靶标奠定了实验基础。     

携带人HCN4与Tbx3基因慢病毒的构建

目的:构建携带人环核苷酸门控离子通道基因(HCN4)、发育调控相关转录因子基因(Tbx3)及增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的慢病毒载体,获得可供转染的滴度,为进一步研究Tbx3对HCN4异位表达及细胞起搏功能的影响提供高效的慢病毒转基因平台。方法:应用聚合酶链反应(PCR)方法,扩增HCN4及Tbx3基因,利用Gateway技术分别构建出HCN4-Tbx3-EGFP、HCN4-EGFP、Tbx3-EGFP、EGFP 4种慢病毒表达载体。经PCR及基因测序鉴定后,脂质体法转染293FT包装细胞,产生相应慢病毒,测定其滴度,荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果:PCR和测序证实,构建出携带有HCN4-Tbx3-EGFP、HCN4-EGFP、Tbx3-EGFP及EGFP基因的慢病毒表达载体。分别转染293FT细胞后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光,病毒滴度测定结果分别为4.7×107TU/ml、5.2×107TU/ml、4.5×107TU/ml、6.65×107TU/ml。结论:成功构建同时携带HCN4、Tbx3基因及EGFP基因的慢病毒载体并包装出具高效感染力的慢病毒颗粒,为通过HCN4联合Tbx3基因长期稳定的表达来构建窦房结细胞的实验研究提供高效稳定的转基因技术平台。     

β-catenin过表达的间充质干细胞对改善海水吸入型肺损伤治疗效果的研究

目的构建过表达β-catenin的慢病毒载体并建立大鼠MSCs稳转细胞株;研究过表达β-catenin的MSCs对损伤的肺泡上皮细胞的修复作用,以及对治疗海水吸入型肺损伤(seawater inhalation induced acute lung injury,SWI-ALI)大鼠模型的疗效。方法 MSCs转染:MSCs(2×105/孔)接种于六孔板过夜培养,慢病毒转染。转染慢病毒载体的MSCs表达稳定性和转染效率检测。雄性SD大鼠36只随机分为四组(每组9只),分别为空白对照组、SWI-ALI模型组、MSCs治疗组、MSCs-Ctnnb1治疗组。造模后4 h取各组肺组织标本进行苏木精-伊红染色(Hematoxylin and eosin staining,HE staining)行病理组织学检查评估肺损伤。NIR815染料标记对照组MSCs和过表达组MSCs-Ctnnb1干细胞,注入两组SWI-ALI大鼠模型气道,分别在干预后12、48 h行体外近红外光谱肺部成像对比干细胞定殖效果。最后进行数据统计分析。结果构建活化β-catenin的慢病毒稳转大鼠MSCs细胞株:培养至第10代,通过荧光显微镜观察检测转染有目的基因的MSCs表达感染效率仍大于90%。动物实验:病理损伤评估:海水吸入型肺损伤大鼠肺组织标本经苏木精-伊红染色镜下观察到肺泡壁增厚,肺泡间质炎性浸润,肺泡充血、水肿。这些组织病理学特征在MSCs治疗组和MSCs-Ctnnb1治疗组海水干预后4 h比SWI-ALI模型组明显缓解。MSCs-Ctnnb1治疗组比MSCs治疗组病理改善效果更好。MSCs在肺内定殖:MSCs治疗组和MSCs-Ctnnb1治疗组大鼠在海水干预后12 h和48 h肺组织进行体外近红外光谱成像追踪肺内MSCs,MSCs-Ctnnb1治疗组比MSCs治疗组海水干预后12 h和48 h荧光信号表达更强,定殖效果更好。结论通过β-catenin过表达激活经典Wnt/β-catenin通路提高间充质干细胞的增殖及向受损肺组织的迁移能力,增加MSCs在肺内的定殖、缓解病理损伤,并提高MSCs对SWI-ALI的治疗效果。     

Mst-1调控缺氧复氧诱导的小鼠心肌细胞自噬及凋亡的机制

目的探索小鼠心肌细胞中哺乳动物不育系20样激酶1(mammalian sterile 20-like kinase 1, Mst-1)调控缺氧复氧(hypoxia reoxygenation, HR)诱导的心肌细胞自噬及凋亡机制。方法采用酶消化法结合差速贴壁的方法培养小鼠乳鼠心肌细胞, 通过缺氧24 h复氧6 h的方法建立HR模型。实验分组:对照组:正常培养的心肌细胞;Mst-1空病毒组:用重组慢病毒空载体转染心肌细胞48 h;Mst-1敲低组:用携带Mst-1小干扰RNA(siRNA)的重组慢病毒转染心肌细胞48 h;Mst-1过表达组:用携带Mst-1基因的重组慢病毒转染心肌细胞48 h;HR组:建立心肌细胞HR模型;Mst-1敲低+HR组:用携带Mst-1 siRNA的重组慢病毒转染心肌细胞后48 h建立心肌细胞HR模型;Mst-1过表达+HR组:用携带Mst-1基因的重组慢病毒转染心肌细胞后48 h建立心肌细胞HR模型。采用实时荧光定量RCR(qPCR)以及Western blot检测细胞中Mst-1 mRNA及蛋白相对表达量, 免疫荧光染色检测心肌细胞标志物心肌肌钙蛋白T(c...     

SMO基因siRNA慢病毒表达载体的构建及其对胰腺癌细胞SMO基因表达的影响

目的:Hegdehog信号通路在胰腺癌发生发展过程中发挥着重要的作用,针对其调控机制的研究将对胰腺癌发病机制的阐明奠定良好的理论基础.构建携带SMO靶向si RNA慢病毒表达载体,并证实其对胰腺癌细胞中SMO基因表达的抑制作用.方法:设计并合成3条SMO基因靶向si RNA片段,利用基因重组技术构建携带此3条片段的慢病毒表达载体并测定其滴度,构建好的慢病毒表达载体转染人胰腺癌细胞株SW1990后,采用RT-PCR法检测SMO基因的表达以筛选出效果最佳的干扰表达载体,并以此载体转染SW1990细胞后采用Western blot法检测SMO蛋白表达.结果:基因测序与酶切电泳结果提示成功合成SMO靶向siRNA片段且其正确插入慢病毒表达载体,无碱基缺失错排与突变,测定病毒滴度分别为5.31×10~8TU/m L,1.49×10~9TU/m L及8.50×10~8TU/m L,经转染SW1990细胞后,测定对SMO基因表达的抑制率分别为86.00%、74.85%及19.22%,效果最优的干扰表达载体转染SW1990细胞后对SMO蛋白表达的抑制率80%.结论:成功构建携带SMO基因靶向si RNA的慢病毒表达载体,且该载体可有效抑制胰腺癌细胞中SMO基因的表达,为进一步的研究提供了良好的实验工具.     

Sox9基因转染对骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响

目的 探讨Sox9基因转染对骨髓间充质干细胞(MSCs)成软骨分化的影响.方法 采用密度梯度离心和贴壁培养法分离兔骨髓MSCs,体外培养扩增.阳离子脂质体介导重组真核表达Sox9质粒转染骨髓MSCs,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹实验(Westem blot)的方法检测基因产物的表达,荧光显微镜和流式细胞术测定细胞转染效率;四甲基噻唑蓝(MTT)法测定基因转染对细胞增殖能力的影响,流式细胞术对转基因细胞进行细胞周期分析;通过Westem blot,RT-PCR和免疫组织化学染色的方法检测Sox9基因转染对MSCs成软骨分化的影响.结果 脂质体介导Sox9基因可以成功地转染兔骨髓MSCs;Sox9基因转染对细胞增殖能力无明显影响;基因转染后的细胞表达软骨分化特异性分子Ⅱ型胶原,Sox9,aggrecan等明显增加.结论 Sox9基因转染骨髓MSCs可以获得稳定表达,基因表达产物可以促进骨髓MSCs向软骨方向的分化.     

人肿瘤抑素Tumstatin基因慢病毒表达载体的构建及其蛋白表达

目的 构建Tumstatin基因慢病毒表达载体,进一步研究Tumstatin基因的功能及其在肿瘤治疗中的应用.方法 采用PCR技术从含有Tumstatin基因的质粒pSPORT1-Sfi扩增目的 基因Tumstatin,并将基因克隆到慢病毒载体表达质粒PGC-Fu[含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因]中,构建慢病毒载体表达质粒pGC-FU-Tum,通过酶切、测序验证Tumstatin基因后,将pGC-FU-Tum质粒和包装质粒pHelper1.0、pHelpe2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带Tumstatin基因和EGFP基因的重组慢病毒GC-Fu-Tum,并转染人脐静脉血管内皮细胞HUVEC,Wstem blot检测目的 蛋白Tumstatin的表达.结果 pGC-FU-Tum中携有正确的Tumstatin基因;pGC-FUTurn共转染包装细胞293T能产生高浓度的重组慢病毒GC-FU-Tum;目的 基因Tumstatin能被重组慢病毒高效地转导入HUVEC,荧光显微镜下能直接观察到EGFP,Western blot能检测到Tumstatin蛋白在靶细胞中的表达.结论 成功构建了携带Tumstatin基因的重组慢病毒载体;其蛋白表达与EGFP-致..     

缺氧诱导因子-1α在胰腺癌中的作用

目的:探讨缺氧环境下胰腺癌细胞胰腺癌肿瘤细胞株SW1990中缺氧诱导因子HIF- 1α、血管生长因子VEGF、葡萄糖转运体GLUT1、和耐药基因MDR1的变化,并阐明其中可能存在的分子调控机制．方法:将胰腺癌肿瘤细胞株SW1990分为常氧组和化学诱导缺氧组(CoCl2诱导),分别采用RT-PCR方法和Western blot方法观察两组HIF- 1α、VEGE、GLUT1及MDR1基因和蛋白的表达;再分别将两组分为对照组、空白质粒转染组和HIF-1α/PCDNA3．0质粒转染组,观察上述因子的基因和蛋白水平表达的变化．结果:化学诱导的缺氧能明显诱导细胞HIF- 1α蛋白的表达(P=0．0089),但对其mRNA的表达没有明显影响(P=0．057);缺氧时胰腺癌肿瘤细胞株SW1990中的VEGF(P=0．046, 0．039)、GLUT1(P=0．0024,0．036)、MDR1(P =0．021,0．038)基因和蛋白的表达水平都明显增高．转染质粒的缺氧组与常氧组相比,HIF- 1α、VEGF、GLUT1、MDR1的基因与蛋白水平都相应的有所增高．结论:缺氧时,胰腺癌细胞通过上调HIF-1α的表达引起其下游的靶基因VEGF、GLUT1和MDR1的表达,从而耐受缺氧并进一步恶性进展．