内在核糖体进入位点控制多药耐药基因mdr1表达的研究

目的：观察内在核糖体进入位点（ＩＲＥＳ）控制多药耐药基因ｍｄｒ１的表达能力。方法：以帽依赖性Ｈａｍｄｒ１载体为对照，利用ｐＳＸＬＣ／ｐＨａ系统构建依赖脑心肌炎病毒ＩＲＥＳ翻译的逆转录病毒载体ＨａＩＲＥＳｍｄｒ１（ＨａＩｍｄｒ１），脂质体转染法导入鼠源包装细胞ＧＰ＋Ｅ８６并获得长春新碱耐药细胞；用聚合酶链反应（ＰＣＲ）与流式细胞术（ＦＣＭ）检测ｍｄｒ１基因的转移与表达。结果：病毒生产细胞ＧＰ＋Ｅ８６／ＨａＩｍｄｒ１上清中逆转录病毒的滴度为２．０×１０５ｃｆｕ／ｍｌ，对长春新碱、柔红霉素与紫杉醇产生交叉耐药（２４～５２倍），而且具有多药耐药表型。ＰＣＲ证实ｍｄｒ１基因已稳定整合至ＧＰ＋Ｅ８６／ＨａＩｍｄｒ１细胞基因组；ＦＣＭ分析表明ＩＲＥＳ能引导ｍｄｒ１基因翻译成Ｐ糖蛋白而高效表达，程度略低于Ｈａｍｄｒ１对照。结论：ＩＲＥＳ可引导ｍｄｒ１基因进行有效的帽非依赖性翻译，ｍｄｒ１基因在双顺反子载体中可作为显性选择性基因用于基因治疗。     

应用PCR－SSCP法探讨外周血B细胞参与多发性骨髓瘤的发病

为探讨多发性骨髓瘤（ＭＭ）的克隆起源，经形态学及ＡＢＣ法筛选１８例外周血无浆细胞污染的ＭＭ患者，采用多聚酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增免疫球蛋白重链ＣＤＲ３区编码基因，并经单链构象多态性（ＳＳＣＰ）法分析其单链构象多态性。经平行检测患者外周血（ＰＢ）和骨髓（ＢＭ）标本，发现１５例ＢＭ及１１例ＰＢ获得预期的克隆特异性ＰＣＲ产物为８０～１１０ｂｐ，其中９例ＰＢ和ＢＭ获得相同的ＰＣＲ产物，８例为１条扩增条带，其ＳＳＣＰ分析可见２条单链，另１例ＰＣＲ产物为２条扩增条带，其ＳＳＣＰ分析可见３条单链，同一患者ＰＢ与ＢＭ标本的单链泳动速度一致。提示至少６０％ＭＭ患者ＰＢ和ＢＭ不仅ＰＣＲ产物一致，其单链构象也一致，研究结果证实了外周血Ｂ细胞参与ＭＭ的发病。     

结直肠癌p53基因点突变和蛋白表达的研究

目的了解中国人结直肠癌ｐ５３基因的突变谱，探讨聚合酶链反应－单链构象多态（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）银染技术用于研究结直肠癌中ｐ５３基因突变的可行性。方法应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ银染技术检测４１例结直肠癌ｐ５３基因突变，以ＡＢＣ免疫组织化学染色检测结直肠癌Ｐ５３蛋白的表达。结果３４％（１４／４１）的病例显示有ｐ５３基因突变，其中外显子５，６，７和８各有４，１，５和４例突变。２０例有Ｐ５３蛋白异常表达，阳性率为４９％。结论导致Ｐ５３蛋白异常堆积的ｐ５３基因突变是结直肠癌的一种常见的分子结构改变，可能在结直肠癌的发生和发展中起着重要的作用。ＰＣＲ－ＳＳＣＰ银染技术是一简便、快速、有效的检测基因点突变的方法     

膀胱肿瘤P53基因突变临床意义

用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ对３０例福尔马林固定，石蜡包埋膀胱肿瘤标本进行研究。结果：ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法检测出Ｐ５３基因突变１０例，Ⅰ级１例，Ⅱ组４例，Ⅲ组５例，符合病理诊断及随访资料，Ｐ５３基因未突变组与突变组在病理分级、临床分期和生存时间上差异显著（Ｐ〈０．０５）。     

骨髓移植供受者HLA—DRB的单链构型多态性配型

用ＰＣＲ和单链构型多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）法检查供受的ＨＬＡ－ＤＲＢ－１基因座的多态性的一致性，以此做ＤＲＢ的基因配型。１６例同胞供受对的ＤＲＢ－１的ＰＣＲ－ＳＳＣＰ配型，有６对相合（６／１６），１０对不合（１０／１６）。此基因配型结果与其它配型结果比较，说明ＤＲＢ－１的ＰＣＲ－ＳＳＣＰ配型在区分同胞供受对Ⅱ类抗原多态性上有较高的灵敏度，同时表现此类配型在应用于骨髓移植前检查同胞供的意义     

一种新的NADH-细胞色素b5还原酶基因点突变

目的　为了查明中国人遗传性高铁血红蛋白血症（ＲＣＭ） 患者的ＮＡＤＨ细胞色素ｂ５ 还原酶（ｂ５Ｒ） 基因突变类型,探讨ＲＣＭ 发生的分子机制。方法　从已报道的１ 例ＲＣＭⅠ型患者的外周血白细胞中提取ＲＮＡ,应用逆转录聚合酶链反应法（ＲＴＰＣＲ） 扩增了ｂ５ＲｃＤＮＡ（９２１ ｂｐ）,测定其ｂ５ＲｃＤＮＡ的全部编码序列。结果　ｂ５ＲｃＤＮＡ基因的第２０３ 位密码子存在（ＴＧＣ→ＴＡＣ）Ｃｙｓ→Ｔｙｒ 的错义突变。经基因组ＰＣＲ限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ） 分析证实该突变并非ＰＣＲ过程中的错配。结论　Ｃｙｓ２０３ →Ｔｙｒ 是ＲＣＭ 的一种新的基因突变类型     

聚合酶链反应单链构象多态性和银染技术筛查胰岛素受体基因突变

目的建立聚合酶链反应单链构象多态性（ＲＣＲＳＳＣＰ）和银染技术筛查胰岛素受体基因突变方法。方法选择８９例非胰岛素依赖型糖尿病患者,ＰＣＲ扩增编码胰岛素受体酪氨酸激酶域的外显子（外显子１７～２１）,进行ＳＳＣＰ电泳,银染色后,对突变样品进行序列分析。结果发现１１例外显子１７和１例外显子２０的异常电泳条带,外显子１７的突变经顺序分析,为ＣＡＣ１０５８→ＣＡＴ１０５８的杂合和纯合多态性突变。结论ＰＣＲＳＳＣＰ结合银染技术是一种操作简便、经济、灵敏度高、适合于临床大样本基因突变筛查的方法。     

细胞色素b5还原酶基因L72P突变的分子诊断

１９９８年,我们曾报道一隐性遗传性高铁血红蛋白血症（ＨＭ）先证者的基因序列［１］,发现了细胞色素ｂ５还原酶（ｂ５Ｒ）基因Ｌ７２Ｐ（ＣＴＣ→ＣＣＣ）突变。运用ＰＣＲ限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）方法,分析家系其他成员的ｂ５Ｒ基因,证明ＰＣＲ结合ＡｐａⅠ限制性内切酶分析可用于ｂ５Ｒ基因Ｌ７２Ｐ突变的基因诊断。一、材料和方法１模板制备：取先证者［１］之兄、父、母及正常成人外周全血细胞２００μｌ,分别提取其基因组ＤＮＡ。２目的ＤＮＡ片断的扩增：使用Ｓａｇｏｎ公司合成、用于扩增ｂ５Ｒ基因片段（含３…     

三种方法在检测Leber‘s视神经萎缩mt—DNA突变的比较

比较ＭＳＰ－ＰＣＲ、ＳＳＣＰ、ＲＦＬＰ在检测Ｌｅｒｂｅｒ’ｓ视神经萎缩（ＬＨＯＮ）线粒体ＤＮＡ（ｍｔ－ＤＮＡ）１１７７８突变中的优缺点。７７例受试者，分别用ＭＳＰ－ＰＣＲ、ＳＳＣＰ、ＲＦＬＰ法检测ｍｔ－ＤＮＡ１１７７８突变。被ＭＳＰ－ＰＣＲ检出的４８例阳性者同时也被ＳＳＣＰ检出，另外ＳＳＣＰ还检出６例杂合性突变；ＭＳＰ－ＰＣＲ和ＳＳＣＰ检测阳性的９例患者，再用ＲＦＬＰ（ＭａｅⅢ）检测也得出一致结果     

骨髓移植供受者HLA－DRB的单链构型多态性配型

用ＰＣＲ和单链构型多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）法检查供受者的ＨＬＡ－ＤＲＢ－１基因座的多态性的一致性，以此做ＤＲＢ的基因配型。１６例同胞供受者对的ＤＲＢ－１的ＰＣＲ－ＳＳＣＰ配型，有６对相合（６／１６），１０对不合（１０／１６）。此基因配型结果与其它配型结果比较，说明ＤＲＢ－１的ＰＣＲ－ＳＳＣＰ配型在区分同胞供受者对的Ⅱ类抗原多态性上有较高的灵敏度，同时表明此类配型在应用于骨髓移植前检查同胞供者的意义。     

多重聚合酶链反应检测多肿瘤抑制基因初探

目的建立一种敏感、特异和快速检测多肿瘤抑制基因（ＭＴＳ１）的方法。方法选择ＭＴＳ１基因组中的外显子２为扩增靶序列，设计合成了一对引物，同时选择人的β球蛋白基因作为对照扩增，建立了多重聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测ＭＴＳ１ＤＮＡ的方法。结果以常规ＰＣＲ与多重ＰＣＲ对正常组织进行检测，扩增产物均出现５３６ｂｐ和３１０ｂｐ条带，两种实验方法结果相同。对２０例肿瘤组织进行检测，检出３例肿瘤组织ＭＴＳ１基因发生了变异。结论所建立的方法较为敏感、特异，可反映ＭＴＳ１基因是否发生变异，为临床诊断、治疗和判断预后提供辅助的实验指标，也为进一步研究打下基础。     

多位点VNTR用于异基基因骨髓移植植入存活检定研究

探讨多位点可变数串联重复序列（ＶＮＴＲ）－Ｄ１７Ｓ３０、ＰＡＨ、ＶＳ１７、ＭＬＯＷ１在异基因骨髓移植存活检定中的应用。方法：以聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增４个位点ＶＮＴＲ、ＰＣＲ产物以聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染法检测,对２名异基因骨髓移植患者作移植物成活检定研究。     

聚合酶链反应—单链构象多态性分析与反向杂交法进行骨髓移植…

用聚合酶链反应（ＰＣＲ），扩增骨髓移植（ＢＭＴ）受者及７８例无关供者ＨＬＡ－ＤＰＢ１基因，作单链构象多态性（ＳＳＣＰ）分析，初步选出与受者ＨＬＡ－ＤＰＢ１ＳＳＣＰ带型相同者；最后进行反向杂交检测，确定ＨＬＡ－ＤＰＢ１更为相容的供者。应用上述技术，从７８例无关供者中选择出１例与ＢＭＴ受者基因相同的供者。整个过程快速、经济、准确性高。     

应用PCR—SSP对异基因骨髓移植供受者HLA—DQA1位点的基因分型

为探索一种可靠性和灵敏性高的ＨＬＡⅡ类基因的配型方法，根据Ｏｌｅｒｕｐ提出的１６个特异性引物序列，用多聚酶链反应－序列特异性引物（ＰＣＲ－ＳＳＰ）方法，对ＤＱＡ１基因位点的多态性进行检测和分型，并与多聚酶链反应－序列特异性寡核苷酸探针杂交（ＰＣＲ－ＳＳＯＰＨ）及多聚酶链反应－单链构型多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）检测结果进行比较，获得了一致的分型结果。ＰＣＲ－ＳＳＰ可分辨出ＤＱＡ１位点的纯合体和杂合体     

应用PCR－SSP对异基因骨髓移植供受者HLA－DQA1位点的基因分型

为探索一种可靠性和灵敏性高的ＨＬＡⅡ类基因的配型方法，根据Ｏｌｅｒｕｐ提出的１６个特异性引物序列，用多聚酶链反应－序列特异性引物（ＰＣＲ－ＳＳＰ）方法，对ＤＱＡ＿１基因位点的多态性进行检测和分型，并与多聚酶链反应－序列特异性寡核苷酸探针杂交（ＰＣＲ－ＳＳＯＰＨ）及多聚酶链反应－单链构型多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）检测结果进行比较，获得了一致的分型结果。ＰＣＲ－ＳＳＰ可分辨出ＤＱＡ＿１位点的纯合体和杂合体等位基因，并能检测出单一碱基的点突变；它将ＰＣＲ扩增和检测两个步骤合并为一次完成，操作更简便、快速。并已将ＰＣＲ－ＳＳＰ方法成功地用于１５对异基因骨髓移植的供、受者的分型。ＰＣＲ－ＳＳＰ作为基因分型的有效技术，可为骨髓来源提供直接的科学依据。     

PCR直接测序法分析结核分枝杆菌katG基因突变

为了了解我国结核分枝杆菌耐异烟肼（ＩＮＨ）分离株ｋａｔＧ基因突变情况，研究其临床意义。本研究通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）、ＰＣＲ－单链构象多态性（ＳＳＣＰ）和ＰＣＲ直测序法分析９２株结核分枝杆菌临床分离株的ｋａｔＧ基因。以Ｈ３７Ｒｖ标准株为对照，２３株药物敏感体中，２１株ｋａｔＧ基因ＳＳＣＰ分析正常，２株异常。３６株耐非ＩＮＨ药物的分离株中，２０株ｋａｔＧ基因ＳＳＣ正常，１６株异常。３３株耐ＩＮＨ分     

白血病患者WT1基因的表达及其与预后及多药耐药的关系

目的探讨ＷＴ１基因与白血病的预后、多药耐药性及细胞凋亡之间的关系。方法应用逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）方法测定６８例白血病患者及２３名正常人的ＷＴ１、ＭＲＰ及ｍｄｒ１基因的表达,同时采用免疫荧光流式细胞术（ＦＣＭ）观察了３２例急性髓系白血病（ＡＭＬ）患者抗凋亡基因ｂｃｌ２的表达。结果６８例白血病患者中３７例ＷＴ１基因表达阳性,２３名正常人ＷＴ１基因表达阴性。ＷＴ１基因表达阳性患者的完全缓解（ＣＲ）率低于表达阴性者（分别为５９．４６％和８７．１０％,Ｐ＝００１１）。ＷＴ１表达阳性患者的ＭＲＰ阳性率高于ＷＴ１表达阴性者（分别为５８．３３％和３２．２６％,Ｐ＝００３３）。联合ＷＴ１及ｂｃｌ２表达情况将ＡＭＬ患者分为高危、中危、低危三组,其ＣＲ率分别为３３３３％、４７．３７％及１００％,三组间差异有显著性（Ｐ＜０．０５）。结论ＷＴ１基因的表达与白血病患者的化疗效果及预后密切相关,是影响白血病患者ＣＲ率的重要危险因素之一。ＷＴ１基因及ｂｃｌ２的共同表达情况可作为预测ＡＭＬ患者预后的重要指标     

骨髓增生异常综合征p53基因突变的临床意义

骨髓增生异常综合征ｐ５３基因突变的临床意义江继发潘祥林朱平王正起王应福王岩我们采用多聚酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）分析方法检测了６７例骨髓增生异常综合征（ＭＤＳ）患者的ｐ５３基因点突变，结合向白血病转化，观察该基因在转变中相对危险性和...     

先天性甲状腺功能减退症壮族患儿 ＴＳＨＲ 基因突变遗 传分析

摘要：目的 分析南宁市先天性甲状腺功能减退症壮族患儿促甲状腺激素受体（ＴＳＨＲ）基因突变及其特点。方法 以 ２１ 例患 有先天性甲状腺功能减退症的壮族患儿及其父母为研究对象。提取患儿及其父母的外周血 ＤＮＡ，采用荧光定量 ＰＣＲ 扩增 ＴＳＨＲ 基因所有 １２ 个外显子、外显子－内含子交界区以及 ３′端和 ５′端非翻译区，利用第一代测序法对基因扩增产物进行测序 并进行分析。结果 ２１ 例患儿中的 １２ 例存在 ＴＳＨＲ 基因突变，分别为 ｃ．Ｃ８０５Ａ（ｐ．Ｒ２６９Ｓ）纯合突变 ６ 例，ｃ．Ｃ１５４Ａ（ｐ．Ｐ５２Ｔ）和 ｃ．Ｃ８０５Ａ（ｐ．Ｒ２６９Ｓ）复合杂合突变 １ 例，ｃ．Ｃ８０５Ａ（ｐ．Ｒ２６９Ｓ）杂合子复合 ｃ．Ｇ２１８１Ｃ（ｐ．Ｅ７２７Ｄ）纯合突变 １ 例，ｃ．Ｃ８０５Ａ（ｐ．Ｒ２６９Ｓ） 杂合子突变 ４ 例。４０ 例父母中存在的 ＴＳＨＲ 位点基因突变分别为 ｃ．Ｃ１５４Ａ（ｐ．Ｐ５２Ｔ）１ 例，ｃ．Ｇ２１８１Ｃ（ｐ．Ｅ７２７Ｄ）９ 例，ｃ．Ｃ８０５Ａ （ｐ．Ｒ２６９Ｓ）２４ 例。结论 先天性甲状腺功能减退症患儿的发病与父母 ＴＳＨＲ 基因具有遗传相关性，新发现的 ｃ． Ｃ８０５Ａ （ｐ．Ｒ２６９Ｓ）基因突变位点可能是壮族人群遗传性先天性甲状腺功能减退症的主要突变位点     

非同位素银染单链构象多态性技术筛查葡萄糖激酶基因突变

目的建立银染单链构象多态性（ＳＳＣＰ）技术筛查葡萄糖激酶基因点突变。方法收集１０个ＮＩＤＤＭ家系的１１２例基因组（ＤＮＡ），经多聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增葡萄糖激酶基因第２～１０号外显子，ＳＳＣＰ电泳，硝酸银染色筛查点突变。结果发现３个家系，９例受试者第５，６号外显子出现异常ＤＮＡ片段条带，经顺序分析证实为第５号内含子１２位碱基Ｃ→Ｇ突变。结论非同位素ＳＳＣＰ技术是一种简便、经济、快速、准确和有效的筛查基因点突变的方法。