人骨形成蛋白-4反转录病毒体系的构建及裸鼠肌内成骨实验

目的：建立hBMP-4反转录病毒体系，为BMP-4基因治疗在骨组织工程中的应用提供研究平台：方法：应用亚克隆方法构建pLEGFP—hBMP-4真核表达载体，脂质体介导下转染PA317细胞，包装病毒颗粒。收集病毒上清．感染NIH3T3细胞系，测定滴度。以同样方法转染、包装获得了绿色荧光蛋白LEGFP反转录病毒，作为实验对照。将实验组和对照组病毒液分别注射至4只裸鼠肌内，8周后取材，组织学检查，鉴定成骨的效果。结果：成功构建了pLEGFP-hBMP-4载体。转染包装细胞后，获得了较高滴度的LEGFP—hBMP-4和LEGFP反转录病毒颗粒。裸鼠肌内注射后8周，hBMP-4病毒注射部位有新生骨块形成，而EGFP组则未见新生骨块。结论：成功建立了LEGFP—hBMP-4反转录病毒体系．为利用BMP-4基因治疗进行骨修复的研究提供了反转录病毒工具。     

两型腺相关病毒对培养人牙髓细胞转染效率的研究

目的探讨两种不同腺相关病毒（AAV）介导的增强型绿色荧光蛋白rAAV2-EGFP和rAAV2/1-EGFP对人牙髓细胞的转染效率及对人牙髓细胞的毒性,为AAV携带目的基因治疗提供理论依据与实验基础。方法采用组织块加酶消化法培养人牙髓细胞并鉴定组织来源。按照感染复数（MOI）为10^4、10^5、5×10^5转染第2代人牙髓细胞,并选择最适MOI值;流式细胞仪检测转染后7d,rAAV2-EGFP和rAAV2/1-EGFP对人牙髓细胞的转染效率;MTT法检测AAV2-EGFP,AAV2/1-EGFP转染后4、6、8、10、12d人牙髓细胞的增殖活性。结果荧光显微镜下观察rAAV-EGFP对人牙髓细胞的转染效率及荧光蛋白强度,随着MOI值的增加而增高,其中105为转染最适MOI值,7d时,流式细胞仪检测AAV2-EGFP、AAV2/1-EGFP转染率分别为35.8%、76.9%;病毒转染细胞后,细胞生长正常,MTT显示转染后各转染组与未转染组的吸光度值差异无统计学意义。结论rAAV2-EGFP对体外培养的人牙髓细胞转染效率高于rAAV2/1-EGFP,是腺相关病毒中转染人牙髓细胞比较适合的载体。     

介导Sonic Hedgehog基因传递载体的体外构建实验

目的：制备高纯度滴度的病毒载体，介导外源基因Sonic Hedgehog传递至骨组织工程的种子细胞内。方法：包装重组质粒pSNAV2．0-Shh，生产重组病毒rAAV—Shh，并感染小鼠颅骨前成骨细胞MC3T3-E1，流式细胞仪及实时定量PCR检测基因传递效果。结果：生产出高滴度及纯度的重组病毒rAAV—Shh，能有效感染MC3T3-E1，促进胞内成骨相关因子的表达升高。结论：这种重组病毒rAAV—Shh能有效传递外源基因，为骨组织工程中的种子细胞提供基因传递载体。     

增强型绿色荧光蛋白慢病毒载体标记人牙周膜干细胞的实验研究

目的研究增强型绿色荧光蛋白（eGFP）慢病毒载体标记人牙周膜干细胞（PDLSCs）的理想条件,以获得稳定高表达eGFP的人PDLSCs。方法eGFP慢病毒载体以25、50、100、200和400的感染复数（MOI）转染人PDLSCs48 h,荧光倒置显微镜及流式细胞术检测各组的转染效率和荧光强度,MTT法评价转染对细胞增殖的影响,检测细胞多向分化能力以及碱性磷酸酶（ALP）的表达状况,从而确定理想的转染条件。结果eGFP慢病毒作用48 h,不同组的转染效率分别为44.7%、60.9%、71.7%、85.8%、86.9%;除MOI为400时以外,eGFP慢病毒转染对细胞增殖无明显影响;MOI为200时,转染细胞的多向分化能力未受影响,ALP活性与未转染组的差异无统计学意义（P>0.05）。结论MOI为200作用48 h对细胞的增殖分化无明显影响,是eGFP慢病毒载体标记PDLSCs的理想条件,保持了其基本的生物学特性。     

Hif-1α慢病毒载体的构建及对兔BMSCs成骨基因表达的影响

目的:构建Hif-1α基因(野生型、点突变型)慢病毒真核表达载体,并研究其对兔BMSCs(骨髓间充质干细胞)成骨基因表达的影响。方法:根据野生型人源Hif-1α基因序列和确定酶切位点的点突变型序列及质粒抽提、PCR等制备Hif-1α基因(野生型、点突变型)慢病毒液;转染兔BMSCs后通过免疫荧光显微镜及qPCR定量分析等检测被转染细胞目的基因Hif-1α和BMP-2的表达。结果:免疫荧光显微镜下可见,转染7d后野生型组和点突变组细胞均未见明显荧光,转染14d后两组细胞均呈现较明显的绿色荧光;qPCR定量结果显示,转染7d后即有Hif-1α和BMP-2基因的显著表达并在转染14d后仍然显示较高表达水平。讨论:免疫荧光显微镜和qPCR定量分别从定性和定量两个方面确定了转染细胞目的基因表达。结论:通过野生型人源Hif-1α基因序列信息和确定酶切位点的点突变型序列信息可以构建野生型和点突变型Hif-1α基因慢病毒真核表达载体;Hif-1α基因慢病毒转染可以促进目的细胞成骨基因表达。     

腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染肌卫星细胞诱导成骨的动物实验研究

目的观察腺病毒介导的BMP- 2基因转染肌卫星细胞后体内骨诱导能力。方法采用动物实验方法,将转染BMP- 2基因的绿色荧光蛋白（GFP）转基因鼠肌卫星细胞吸收到胶原支架上,然后将细胞胶原支架复合物移植入野生型129sv小鼠的后小腿肌肉中,应用X线片观察、组织学检查及荧光显微镜观察转染细胞的诱导成骨能力。结果用BMP- 2基因转染的肌卫星细胞复合胶原支架移植入野生型小鼠后小腿筋膜下肌肉后会产生异位骨形成,移植2周后其中有GFP阳性的成骨细胞和骨细胞,3周后形成良好的骨组织,4周时已形成成熟的骨组织,而且骨组织具有GFP荧光。对照组用胶原支架和未转染的肌卫星细胞移植,未出现诱导性异位骨形成。结论Ad- BMP2转染的肌卫星细胞以胶原为支架可以在肌肉内诱导骨组织形成。     

生长分化因子15基因过表达慢病毒载体的构建

目的 构建生长分化因子15（growth differentiation factor 15,GDF15）基因过表达慢病毒载体。 方法 根据GDF15 mRNA的基因序列,合成GDF15基因,构建至过表达载体并转化至感受态细胞,再进行测序验证。重组慢病毒载体经过测序鉴定后,转染293T细胞,包装生产慢病毒。用慢病毒转染293T细胞,再用Western blot检测GDF15的表达情况。 结果 测序结果证实GDF15 基因正确插入载体中。慢病毒转染293T细胞后,GDF15基因在蛋白质水平上表达显著增加。 结论 GDF15基因过表达慢病毒载体构建成功,并有效增强GDF15基因在293T细胞中的表达。     

E2F-1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建和鉴定靶向E2F-1基因的RNA干扰慢病毒载体。方法：体外合成两对互补并编码靶向E2F-1基因的特异性短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）序列和一个阴性对照组的寡核苷酸,克隆到pLKO.1-PURO-U6（Age I/EcoR I）质粒载体中,经酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确,将以上质粒分别和包装质粒混合物共转染293T细胞,包装产生病毒颗粒。各组病毒载体转染Tca8113细胞后,运用Real-Time PCR和Western检测三组E2F-1 mRNA和蛋白的表达水平。结果：经酶切和测序证明,pLKO.1-PURO-U6-E2F-1shRNA序列正确;转染后,各组慢病毒载体中,第一组质粒感染后的Tca8113细胞中E2F-1基因的核酸电泳条带明显减弱,Western检测出E2F-1蛋白的表达降低。结论：靶向E2F-1基因的shRNA慢病毒载体构建成功,并可特异性沉默E2F-1基因的表达,为研究E2F-1在口腔鳞癌的发生发展中的作用提供了初步的实验基础。     

microRNA-223过表达与抑制表达 慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建 microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体,并验证其过表达或抑制表达microRNA-223的效率。方法 设计针对microRNA-223前体的过表达基因片段及针对microRNA-223成熟体的反义片段,应用聚合酶链反应（PCR）调取目的基因及通过退火反应获得双链DNA寡聚核苷酸片段。并通过基因重组技术将目的 基因片段及反义片段分别克隆到GV229及GV232慢病毒载体中,进行PCR鉴定及DNA测序比对分析,构建相应的 microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体。利用荧光定量PCR法检测microRNA-223表达水平。结果 对阳性克隆进行PCR鉴定及DNA测序证明,microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体构建成功。microRNA-223过表达慢病毒载体能显著提高细胞中microRNA-223表达水平,microRNA-223抑制表达慢病毒载体能明显抑制细胞中microRNA-223表达水平。结论 成功构建microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体,为进一步研究microRNA-223对口腔癌发生发展的影响及其机制提供了稳定的细胞转染载体。     

抗STAT3shRNA对树突状细胞成熟影响研究及其靶向防龋DNA疫苗构建

目的: 研究以慢病毒为载体的抗小鼠STAT3 shRNA对树突状细胞(DC)成熟的影响,构建抗STAT3 shRNA树突状细胞靶向防龋DNA 疫苗。方法: 制备抗小鼠STAT3 shRNA慢病毒,体外转染树突状细胞系DC2.4,用Western杂交检测抑制STAT3表达的效果;用流式细胞术检测CD40、CD80和CD86表达;在抑制DC2.4的STAT3表达后,用LPS刺激,流式细胞术检测其对DCs成熟的影响;将针对STAT3的特异性shRNA整合入DC靶向防龋DNA疫苗pGJA-P/VAX,转染HEK-293细胞检测抑制STAT3表达效果。结果: 抗STAT3 shRNA慢病毒转染DC2.4后,可明显抑制STAT3表达,并增加DC表面标记物CD40、CD80和CD86的表达;用LPS刺激后,CD40、CD80和CD86表达进一步增强;抗STAT3 shRNA DC靶向防龋DNA疫苗转染HEK-293细胞后可以抑制STAT3表达。结论: 小鼠抗STAT3 shRNA慢病毒可有效抑制DC2.4 STAT3的表达,STAT3沉默后可促进DC2.4成熟。成功构建抗STAT3 shRNA DC靶向防龋DNA疫苗。     

bFGF重组慢病毒对羊骨髓间充质干细胞成骨功能影响的研究

目的:探讨碱性成纤维生长因子(basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)基因转染对体外培养的骨髓间充质干细胞(Bone Marrow mesenchymal Stem Cells, BMSCs)的增殖和骨向分化的影响,为构建组织工程骨的种子细胞做理论依据。方法:构建携带人bFGF基因的慢病毒载体,转染诱导后羊的BMSCs,得到bFGF转染组,选择未转染的BMSCs为对照组。两组细胞采用实时定量PCR技术和蛋白质印迹法技术检测Collagen-Ⅰ、OC、OPN等成骨相关基因的mRNA水平及蛋白水平相对表达量的变化情况。结果:bFGF组OPN和Collagen-Ⅰ基因mRNA水平表达量较对照组增高,差异有统计学意义(P<0.05),两组细胞在OC基因mRNA水平表达量上差异无统计学意义;bFGF组细胞在OPN、OC和Collagen-Ⅰ基因蛋白水平上表达量均高于对照组,且差异有统计学意义。结论:bFGF基因转染能增强羊BMSCs增殖和骨向分化的能力,可作为组织工程骨的种子细胞。     

右上颌骨中心性巨细胞肉芽肿1例及病变中多核巨细胞的分离

目的:本文报道了1例发生于上颌骨的中心性巨细胞肉芽肿,病变范围较大。对病变中的多核巨细胞进行了分离、培养和鉴定,同时初步探讨了对多核巨细胞进行转基因的可行性。方法:采用组织培养法和差速贴壁法分离和培养病变中的多核巨细胞,通过形态学、TRAP染色和骨吸收功能的观察对所培养的细胞进行鉴定。并以腺病毒为载体、携带EGFP基因,转染所培养的细胞。结果:所培养的细胞具有多核的形态学特点,TRAP染色阳性,并在体外具有骨吸收功能。转染后能观察到多核巨细胞表达EGFP。结论:病变中的多核巨细胞是破骨细胞样细胞。体外能通过转基因方法使破骨细胞样细胞表达外源性基因。     

骨形态发生蛋白4慢病毒载体构建及对鼠骨髓间充质干细胞成牙功能影响

目的:构建骨形态发生蛋白4(BMP4)慢病毒载体,检测其对鼠骨髓间充质干细胞成牙功能的影响,以期为组织工程牙筛选种子细胞。方法:以成熟人胎盘组织为材料来源,克隆人BMP4基因的全长cDNA,转克隆至plenti6/v5-D-TOPO表达载体,构建出BMP4-plenti6/v5-D-TOPO重组慢病毒表达载体;转染SD大鼠骨髓间充质干细胞,用MTT法检测转染前后细胞的增殖活性,实时荧光定量PCR检测Ⅰ型胶原蛋白、成釉蛋白、牙本质基质蛋白1、同源异型盒基因1成牙相关基因的mRNA水平相对表达量的变化。结果:BMP4基因转染后,细胞体外增殖活性增强,成釉蛋白、牙本质基质蛋白1、同源异型盒基因1 mRNA水平表达量增多,差异有统计学意义(P<0.05),Ⅰ型胶原蛋白 mRNA水平差异无显著性意义。结论:BMP4可提高骨髓间充质干细胞体外增殖活性和牙向分化能力。     

腺病毒介导TWEAK基因对破骨细胞影响的体外研究

目的:研究TWEAK对成熟破骨细胞的作用。方法:体外分离培养破骨细胞;以腺病毒为载体,携带TWEAK基因,转染培养体系中的细胞;3d后计数抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)阳性细胞数7,d后测量骨吸收陷窝的面积。采用t检验分析TWEAK对破骨细胞生存时间和功能的影响。结果:转染空病毒组与空白对照组没有差异;转染TWEAK组与转染空病毒组相比,TRAP阳性细胞数增加(P<0.05),骨吸收陷窝面积增加(P<0.01)。结论:腺病毒本身对破骨细胞没有作用。TWEAK在一定程度上能延长破骨细胞的生存时间并能显著促进破骨细胞的骨吸收功能。     

超声介导微泡破裂法促进外源性基因在小鼠NIH3T3细胞中的表达

目的观察超声介导微泡破裂法对目的基因重组人骨形态发生蛋白- 2（hBMP- 2）转染靶细胞NIH3T3效率的影响。方法复苏NIH3T3细胞并传至3~4代,待细胞生长状态良好后接种至六孔培养板;将六孔板中细胞随机分为2组,分别采用质粒DNA和脂质体法（脂质体组）,质粒DNA、超声和微泡法（超声介导微泡破裂组）转染目的基因;转染24~48 h后在荧光倒置显微镜下对各组细胞分别计数以计算转染效率,并采用ELISA实验测定转染后hBMP- 2蛋白质量浓度;使用SPSS 11.5软件包分析实验结果。结果脂质体组的转染效率为（7.30±1.58）%,超声介导微泡破裂组为（11.77±3.16）%（P<0.05）;脂质体组转染后hBMP- 2蛋白质量浓度为（1 164.35±724.67）pg/mL,超声介导微泡破裂组为（2 932.70±656.27）pg/mL（P<0.05）。结论超声介导微泡破裂法可以明显提高外源性基因hBMP-2在体外NIH3T3细胞中的转染效率和蛋白质量浓度,可以为牙周再生基因治疗提供一种新型基因转移系统。     

转染人骨形成蛋白2共培养条件下NIH3T3细胞生物学性状的观察

目的利用细胞共培养系统研究转基因诱导表达的分泌型人骨形成蛋白2（hBMP-2），对NIH3T3细胞超微结构和碱性磷酸酶（ALP）活性的影响。方法用阳离子聚合物转染试剂将hBMP-2真核表达载体peDNA3．1-B2导入NIH3T3细胞，G418筛选获得阳性细胞克隆。免疫组化和酶联免疫吸附试验检测BMP-2胞内和胞外的表达，并利用细胞共培养系统Transwell，将转基因细胞与NIH3T3细胞共培养。结果转染hBMP-2基因的NIH3T3细胞胞内和胞外都有BMP-2的表达。与转基因细胞共培养的NIH3T3细胞在共培养后超微结构的变化和ALP的高表达，都提示其向成骨样细胞分化的趋势。结论经转基因诱导表达的分泌型BMP-2具有诱导成纤维细胞向成骨样细胞分化的作用。     

过表达骨形态发生蛋白-4对小鼠诱导性多能干细胞生物学活性的影响

目的 构建过表达骨形态发生蛋白-4（BMP4）基因的慢病毒载体,探讨其过表达后对小鼠诱导性多能干细胞（iPS）生物学活性的影响。方法 采用慢病毒转染建立稳定过表达BMP4的iPS细胞株（BMP4过表达组）,未作任何转染的细胞为空白组,转染慢病毒阴性对照组的细胞为空载体组。CCK8检测各组细胞增殖活性,碱性磷酸酶（ALP）活性检测细胞分化程度,荧光定量聚合酶链反应检测BMP4、成釉细胞蛋白（AMBN）、细胞角蛋白（CK）14、牙本质涎磷蛋白（DSPP）、骨唾液酸蛋白（BSP）及骨细胞特异转录因子Runx2的mRNA表达。结果 与空白组及空载体组相比,BMP4过表达组的细胞增殖活性及ALP活性升高（P<0.05）,Runx2、AMBN、CK14、DSPP、BSP mRNA的表达增加（P<0.05）。结论 BMP4基因能够促进iPS的牙向分化。     

重组质粒pEGFP_BMP7的构建及在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的　体外构建重组质粒pEGFP-BMP7,并检测其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达。方法　应用RT- PCR方法从大鼠肾脏中分离、扩增目的基因片段,并进行测序,随后将所得cDNA定向克隆到真核表达载体pEGFP- N1中,进行双酶切来鉴定克隆的正确性。通过脂质体介导重组pEGFP-BMP7瞬时转染大鼠骨髓间充质干细胞,确定转染效率,并通过RT-PCR、免疫细胞化学手段检测BMP7的表达。结果　通过RT-PCR成功获得1·3 kb的cDNA 片段,该cDNA除756 bp处有一碱基从T突变成A外,其余序列与大鼠BMP7基因完全相符。重组质粒双酶切图谱显示,BMP7 cDNA被正确插入载体中。绿色荧光蛋白在大鼠骨髓间充质干细胞中早期瞬时转染效率可达33%。转染后RT-PCR和免疫细胞化学检测证实重组pEGFP-BMP7在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达。结论　成功构建重组真核表达质粒pEGFP-BMP7,并在大鼠骨髓间充质干细胞中得到表达,有助于应用BMP7行基因治疗,促进牵张成骨、骨痂形成和修复颅颌面骨缺损。