和厚朴酚对癫痫小鼠学习记忆能力的改善作用

目的: 探索和厚朴酚对癫痫小鼠学习记忆能力的改善作用并探讨其机制。方法: 5周龄雄性ICR小鼠采用腹腔注射红藻氨酸（38 mg/kg）的方式建立癫痫模型。治疗组小鼠腹腔注射和厚朴酚（3、10、30 mg/kg）10 d。Fluoro-Jade B染色法检测神经元活性;Morris水迷宫和Y迷宫实验观察小鼠学习记忆能力;蛋白质印迹法检测乙酰化超氧化物歧化酶（SOD）、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）和P62蛋白表达水平;硫代巴比妥酸法和WST-1法分别测定丙二醛和SOD等氧化应激产物的含量。结果: 与对照组比较,模型组神经元凋亡数量增加,学习记忆能力下降,乙酰化SOD和丙二醛表达量增加,SOD活性下降,LC3-Ⅱ和P62蛋白表达量增加（P < 0.05或P < 0.01）;与模型组比较,和厚朴酚10 mg/kg和30 mg/kg均可减少神经元凋亡数量,改善学习记忆能力,并可逆转癫痫发作所致的丙二醛和SOD乙酰化水平,降低LC3-Ⅱ和P62的表达量（P < 0.05或P < 0.01）,且药物剂量为30 mg/kg时效果更加显著。结论: 和厚朴酚可缓解癫痫发作导致的氧化应激和自噬降解障碍,减少神经元凋亡,从而改善癫痫小鼠的学习记忆能力。     

雷帕霉素对帕金森病小鼠的保护作用

目的: 探索雷帕霉素对帕金森病模型小鼠的保护作用及机制。方法: 60只SPF级成年健康雄性C57/B6小鼠随机分为对照组、模型组和治疗组。模型组和治疗组采用1-甲基4-苯基-1、2、3、6-四氢吡啶（MPTP）诱导建立帕金森病模型。治疗组在第7天MPTP注射后1 h开始腹腔注射雷帕霉素（3 mg/kg,1次/d,共7 d）,模型组和对照组均予腹腔注射等体积的溶剂。CatWalk步态分析系统分析小鼠运动功能;免疫荧光法检测小鼠脑黑质部酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元数量;蛋白质印迹法检测mTOR信号通路相关蛋白及自噬相关蛋白的表达;试剂盒测定谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛和超氧化物歧化酶（SOD）等氧化应激产物的浓度。结果: 与对照组比较,模型组小鼠行走速度和步频变慢,速度变化率增加（P < 0.05或P < 0.01）,被系统识别的落脚模式减少;小鼠脑黑质中TH阳性染色神经元数量减少,Akt、S6K、S6及UNC-51样激酶（ULK）磷酸化水平升高,LC3-Ⅱ/Ⅰ比值降低,氧化应激相关的SOD和GSH-Px含量减少而丙二醛含量增加（均P < 0.01）。与模型组比较,治疗组步态规律性恢复,落脚模式被系统识别的数量增加,行走速度和步频加快,速度变化率减小（P < 0.05或P < 0.01）;小鼠脑黑质中TH阳性染色神经元数量增加,mTOR信号通路相关蛋白及ULK磷酸化水平降低,LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高,SOD、GSH-Px含量增加而丙二醛含量减少（P < 0.05或P < 0.01）。结论: 雷帕霉素可以抑制帕金森病小鼠mTOR信号通路活性,通过增强大脑黑质部自噬活性和降低氧化应激水平来减轻多巴胺能神经元损伤,改善帕金森病小鼠行为学异常。     

姜黄素诱导人肝癌细胞系Huh7自噬和凋亡

目的 探讨姜黄素诱导人肝癌细胞Huh7自噬和凋亡的作用,以及抑制自噬对姜黄素诱导凋亡的影响。方法 将姜黄素（5、10、20、40 μmol/L）加入人肝癌细胞系Huh7的培养液中,用CCK-8检测细胞增殖水平变化。Huh7细胞用5~40 μmol/L姜黄素培养48 h,通过蛋白质印迹法检测自噬微管相关蛋白1轻链3（LC3）-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值,免疫荧光法检测自噬小体的形成,评估Huh7细胞自噬水平的变化。通过流式细胞术检测Huh7细胞凋亡情况。加入5 mmol/L自噬抑制剂3-甲基嘌呤（3-MA）和20 μmol/L姜黄素培养Huh7细胞,检测Huh7细胞凋亡水平和自噬水平的变化。结果 CCK-8检测显示姜黄素能抑制Huh7细胞的增殖（P<0.05,P<0.01）,且细胞凋亡率随着姜黄素浓度的升高而上升;蛋白质印迹检测显示加入姜黄素后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值上升（P<0.05,P<0.01）,免疫荧光检测显示加入20 μmol/L姜黄素后自噬小体增多。与单独使用20 μmol/L姜黄素培养的Huh7细胞相比,姜黄素联用3-MA培养的Huh7细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值下降（P<0.01）,自噬小体减少。流式细胞术检测发现5~40 μmol/L姜黄素促进了Huh7细胞凋亡（P<0.05,P<0.01）,而联用3-MA后与单独使用20 μmol/L姜黄素培养相比引起的Huh7细胞凋亡减少（P<0.05）。结论 姜黄素能诱导Huh7细胞凋亡、抑制细胞增殖并促进细胞自噬,抑制自噬能减弱姜黄素对Huh7细胞的诱导凋亡效应。     

饥饿对Beclin-1依赖的Ana-1细胞自噬和凋亡的影响

目的：研究饥饿对Ana-1细胞自噬和凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法：体外培养Ana-1细胞,将细胞分为对照组（饥饿0h）和饥饿3、6、9、12、24h组（饥饿组）,观察饥饿对细胞自噬与凋亡的影响;将Ana-1细胞分为空白对照组、饥饿组、3-甲基腺嘌呤（3-MA）组、3-MA联合饥饿组,孵育24 h,采用Western blotting法检测各组细胞中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1蛋白表达水平和凋亡相关蛋白Caspase-3蛋白水平,采用倒置显微镜观察饥饿6、12和24 h组细胞形态表现。结果：与对照组比较,饥饿6、12和24h组Ana-1细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值,饥饿3、6、9、12和24 h组Ana-1细胞中Beclin-1蛋白表达水平均明显升高（P<0.05或P<0.01）,饥饿3、6、9、12和24 h组Ana-1细胞中Caspase-3水平明显降低（P<0.01）,呈时间依赖性;倒置显微镜下观察,与对照组比较,不同时间饥饿组细胞形态发生改变,细胞皱缩、出现碎片,随着时间的延长,细胞变化更加明显。与饥饿组比较,3-MA联合饥饿组Ana-1细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1蛋白表达水平及Caspase-3蛋白水平均明显降低（P<0.05或P<0.01）。结论：饥饿可诱导Beclin-1依赖的Ana-1细胞自噬并引起细胞凋亡。     

敲除Sirt3后激活自噬对阿尔茨海默病有保护作用

目的: 探究Sirt3在阿尔茨海默病（AD）发生发展中的作用及可能机制。方法: 体内实验以C57BL/6野生型小鼠和Sirt3基因敲除小鼠为对象,采用腹腔注射D-半乳糖联合脑定位注射β-淀粉样蛋白（Aβ）_1-40建立AD小鼠模型。莫里斯（Morris）水迷宫实验、自发活动开场实验和悬尾实验观察造模前后小鼠学习记忆和焦虑抑郁状态的改变,免疫荧光染色观察脑内海马区域Aβ沉积情况,蛋白质印迹法检测小鼠脑组织中自噬和凋亡相关蛋白表达。体外实验选小鼠皮层原代细胞作为对象,给予Aβ_1-40建立AD体外模型,MTT法检测细胞活性。结果: 体内实验结果显示,野生型小鼠诱发AD后平台潜伏期延长（P < 0.05）,穿越平台次数减少、目标象限停留时间缩短（均P < 0.05）,提示造模后小鼠的学习记忆能力下降;而Sirt3敲除能够缓解AD所致的学习记忆障碍（均P < 0.05）。相较于野生型小鼠,Sirt3基因敲除小鼠脑内海马区域的Aβ沉积减少（P < 0.05）,凋亡蛋白cleaved caspase 3表达减少（P < 0.05）。另外,野生型小鼠诱发AD后LC3-Ⅱ和P62蛋白表达增加（均P < 0.05）,提示自噬流受阻;而Sirt3基因敲除小鼠诱发AD后LC3-Ⅱ蛋白表达增加,P62蛋白表达减少（均P < 0.05）,提示自噬被激活。小鼠皮层原代细胞AD模型中,Sirt3基因敲除的细胞较野生型细胞死亡减少（P < 0.05）;加用自噬抑制剂氯喹后,Sirt3基因敲除的保护作用消失（P < 0.05）。结论: Sirt3敲除对于D-半乳糖联合Aβ_1-40诱发的AD有保护作用,这种保护作用可能与自噬流活化有关。     

七氟烷预处理对缺氧/复氧损伤的心肌细胞H9c2 LC3蛋白表达的影响

目的观察七氟烷预处理对缺氧/复氧（H/R）损伤的H9c2大鼠心肌细胞自噬相关蛋白LC3表达的影响,探讨自噬在七氟烷预处理延迟性保护中的作用。方法 H9c2心肌细胞随机分为5组：空白对照组（CON）;缺氧/复氧组H/R（缺氧2 h,复氧1 h）;七氟烷预处理组（SEVO）予2.5%七氟烷预处理1 h,24 h后进行H/R;3-MA＋SEVO组,七氟烷预处理前15 min在培养液内加入3-MA（10 mmol/L）,24 h后进行H/R;3-MA组,即在培养液内加入3-MA（10 mmol/L）,25 h后进行H/R。取复氧后心肌细胞,MTT法检测各组H9c2心肌细胞存活率,Western blot法检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达。结果与CON组相比H/R组和SEVO组细胞存活率均降低（均P〈0.05）;与H/R组相比SEVO组、3-MA组和3-MA＋SEVO组细胞存活率均增高（均P〈0.05）。Western blot结果显示,与CON组相比SEVO组、H/R组自噬蛋白LC3-Ⅱ表达均上调（均P〈0.05）,与H/R组相比SEVO组LC3-Ⅱ蛋白表达均下调（均P〈0.05）,而3-MA组和3-MA＋SEVO组表达均显著下调（均P〈0.01）。结论七氟烷预处理对H/R损伤H9c2心肌细胞具有延迟性保护作用,自噬可能参与了七氟烷预处理的延迟性保护机制。     

丹参酮ⅡA在体外对海马神经元细胞放射性损伤的保护作用

目的探讨丹参酮ⅡA在体外对海马神经元细胞放射性损伤的影响,以及其在放射性损伤保护过程中的相关机制。方法体外培养海马神经元细胞株HT-22,实验分为对照组(Control)、照射组(RT)、照射+丹参酮ⅡA处理组(RT+Tan)、照射+丹参酮ⅡA+自噬抑制剂3-Methyladenine(3-MA)处理组(RT+Tan+3-MA)。采用MTT法检测各组细胞的存活分数,流式细胞技术检测细胞凋亡,Western blot检测自噬相关蛋白LC3-I、LC3-Ⅱ的表达水平。结果照射后海马神经元细胞存活分数下降,而丹参酮ⅡA能提高放射线照射后海马神经元细胞的存活分数,并减少细胞凋亡。相对于单纯照射组,RT+Tan组的海马神经元细胞HT-22的自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达上升。而加入自噬抑制剂3-MA后,放射处理后的海马神经元细胞LC3蛋白表达下降,且存活分数明显下降。结论丹参酮ⅡA能明显减轻放射线在体外对海马神经元细胞的放射损伤作用,其保护机制可能与调节放疗过程中自噬相关。     

杨梅素对人卵巢癌SKOV3细胞自噬的诱导作用及线粒体分裂的促进作用

目的：观察杨梅素作用于人卵巢癌SKOV3细胞后细胞自噬的发生和线粒体分裂程度,探讨杨梅素对其线粒体分裂的影响及自噬的诱导作用。方法：体外培养SKOV3细胞,杨梅素给药剂量按0、20、40和60 g·L^-1分为对照组和低、中、高剂量杨梅素组,均作用12 h。流式细胞术检测各组细胞线粒体膜电位变化,MitoTracker Red荧光探针特异性标记线粒体观察其形态,Western blotting法检测动力相关蛋白1（Drp1）、线粒体分裂蛋白1（Fis1）和自噬相关蛋白LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ蛋白表达水平,采用间接免疫荧光法检测自噬相关蛋白LC3表达强度。结果：与对照组比较,各剂量杨梅素组细胞线粒体膜电位下降比例明显升高（t=3.27,t=6.85,t=5.49,P<0.05）。与对照组比较,各剂量杨梅素组细胞中线粒体数目增加,且线粒体砂砾感增强。与对照组比较,各剂量杨梅素组细胞中Drp1（t=4.35,t=3.28,t=6.17,P<0.05）和Fis1（t=8.32,t=6.74,t=9.27,P<0.05）蛋白表达水平明显升高,中和高剂量杨梅素组细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显升高（t=3.28,t=4.21,P<0.05）。间接免疫荧光检测,与对照组比较,随着杨梅素给药剂量增加,LC3表达强度逐渐增强。结论：杨梅素能够诱导人卵巢癌SKOV3细胞发生自噬,并对线粒体动分裂有明显促进作用。     

头孢曲松对蛛网膜下腔出血大鼠海马神经细胞的保护作用及其机制

目的：探讨头孢曲松对蛛网膜下腔出血（SAH）大鼠的治疗作用,并阐明其作用机制。方法： 48只成年雄性SD大鼠随机分为假手术组、SAH组、3-甲基腺嘌呤（3-MA）组和头孢曲松（CEF）组,每组12只。血管内穿刺法建立SAH模型,腹腔注射给药,3-MA给药剂量为15 mg·kg^-1,CEF给药剂量为500 mg·kg^-1。造模后24h处死大鼠,HE染色观察大鼠脑组织病理表现,TUNEL染色法检测神经细胞凋亡情况,免疫组织化学Western blotting法检测各组大鼠海马组织中自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ阳性细胞数和蛋白表达水平及凋亡因子Caspase-3蛋白表达水平。结果：与SAH组比较,CEF组大鼠神经功能评分明显升高（P<0.01）;HE染色检测,SAH组大鼠海马区神经细胞肿胀,胞质疏松,核明显固缩、碎裂和溶解;与SAH组比较,CEF组大鼠神经变性有所逆转,出现较多正常神经组织形态;3-MA组神经细胞损伤更为严重,满视野死亡神经细胞,细胞层次紊乱。定量分析显示,与SAH组比较,CEF组坏死神经细胞数明显降低（P<0.05）,3-MA组坏死神经细胞数明显升高（P<0.05）。免疫组织化学法检测,与SAH组比较,CEF组大鼠海马组织中Beclin-1和LC3-Ⅱ阳性细胞数明显升高（P<0.05）,3-MA组大鼠海马组织中Beclin-1和LC3-Ⅱ阳性细胞数明显降低（P<0.05）。TUNEL染色法检测,与SAH组比较,CEF组凋亡细胞数明显减少（P<0.05）,3-MA组凋亡细胞数明显升高（P<0.05）。Western blotting法检测,与SAH组比较,CEF组大鼠海马组织中Caspase-3蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,3-MA组Caspase-3蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。结论：头孢曲松对蛛网膜下腔出血大鼠神经损伤具有保护作用,其作用机制可能与上调神经细胞自噬和减少细胞凋亡有关。     

保肾通络方含药血清调节线粒体自噬对高糖诱导下足细胞氧化损伤的影响

目的 观察保肾通络方含药血清对高糖培养下足细胞氧化损伤的影响,并对保肾通络方的作用机制进行探讨。方法 以体外培养的肾小球足细胞为研究对象,给予高浓度葡萄糖刺激,采用CCK-8法分析足细胞活力以确定最佳模型及给药浓度,分为正常对照组、高糖组、保肾通络方组,采用鬼笔环肽进行细胞骨架染色,Western blotting法检测足细胞裂孔膜蛋白nephrin,自噬相关蛋白5(autophagy-related protein 5,ATG5)、ATG7、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)的表达,流式细胞术检测足细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)及线粒体膜电位,免疫荧光共标LC3B及线粒体,观察各组足细胞内线粒体自噬泡的生成情况。结果 30 mmol/L高糖干预48 h可显著降低足细胞活力(P＜0.05),保肾通络方含药血清可使高糖诱导的足细胞活力明显提升(P＜0.01);与正常对照组相比,高糖组足细胞骨架褶皱呈多边形,应力纤维束被破坏,ROS生成显著增多(P＜0.01),足细胞nephrin、ATG5、ATG7表达显著降低,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低(P＜0.05),LC3B与线粒体共标减少,线粒体膜电位下降(P＜0.01);与高糖组相比,保肾通络方组足细胞骨架改善,ROS生成减少(P＜0.01),nephrin、ATG5、ATG7表达显著增加(P＜0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上升(P＜0.05),LC3B与线粒体荧光共标增多,线粒体膜电位升高(P＜0.01)。结论 保肾通络方含药血清能够减轻高糖诱导的足细胞氧化损伤,其作用可能与改善足细胞线粒体自噬有关。     

帕金森病模型小鼠海马神经炎症、凋亡及自噬蛋白的表达研究

目的 观察MPTP诱导的帕金森病模型小鼠海马区域神经炎症,细胞凋亡和自噬相关蛋白的表达。方法 雄性C57BL/6J小鼠连续腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)30 mg/kg 5 d,对照组小鼠腹腔注射生理盐水5d,与模型组小鼠同日处死取材。用RT-PCR、Western blot和免疫荧光等方法检测小鼠海马内神经炎症相关因子NF-κB,凋亡相关因子PARP1、Caspase-3、Drp1和细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达情况。结果 模型组海马NF-κB表达水平(1.81±0.62)较对照组(1.21±0.28)明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05);模型组海马Caspase-3表达水平(1.05±0.22)较对照组(0.81±0.14)明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05);模型组海马Drp1表达水平(1.18±0.21)较对照组(0.85±0.24)明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05);模型组海马LC3-Ⅱ表达水平(1.76±0.71)较对照组(1.16±0.27)明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05);模型组海马PARP1表达水平(1.17±0.35)较对照组(1.62±0.45)明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 MPTP造模可以诱导NF-κB介导的海马神经炎症发生,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP1、Drp1参与其中。     

癫痫持续状态后小鼠海马组织神经元中微管蛋白和内体-溶酶体系统表达的变化及其意义

目的：探讨癫痫持续状态（SE）后小鼠海马组织神经元中微管蛋白β-tubulin和内体-溶酶体系统表达的变化，阐明神经元迟发性死亡过程中微管和内体-溶酶体系统的变化规律。方法：40只雄性ICR小鼠分为对照组（n=7，给予生理盐水）和实验组（n=33，给予匹鲁卡品），实验组中达到SE标准的SE小鼠根据SE后时间分为SE1d、SE2d、SE3d和SE7d组（n=5）。Nissl和Fluoro-Jade B （F-JB）染色检测各组小鼠海马组织神经元损伤情况，免疫荧光法检测各组小鼠海马组织神经元中微管蛋白β-tubulin、内体蛋白Rab5和溶酶体结构蛋白LAMP1表达强度及β-tubulin、Rab5和LAMP1阳性面积百分比；双重荧光法检测各组小鼠海马组织CA1区β-tubulin与Rab5和LAMP1表达的关系。结果：与对照组比较，SE1d组小鼠海马CA1和CA3区神经元数减少（P<0.01），F-JB阳性细胞数增加（P<0.01）；SE2d、SE3d和SE7d组小鼠海马组织中Nissl阳性神经元数明显减少（P<0.01）。与对照组比较，SE2d、SE3d和SE7d组小鼠海马组织中F-JB阳性神经元数增加（P<0.01）。与对照组比较，SE2d、SE3d和SE7d组小鼠海马CA1和CA3区神经元树突中β-tubulin阳性面积百分比明显降低（P<0.05），其变化趋势与神经元损伤相似。与对照组比较，SE1d、SE 2d、SE 3d和SE 7d组小鼠海马组织神经元中Rab5和LAMP1表达强度随着时间延长呈下降趋势；Rab5阳性面积百分比明显降低（P<0.05或P<0.01）；LAMP1阳性面积百分比在SE后第1天出现一过性增多，之后逐渐减少（P<0.05或P<0.01）。双重荧光染色检测，SE后1 d是早期内体减少和溶酶体一过性增多的关键点，并与神经元微管损伤的出现时间极为一致。结论：SE引起神经元迟发性死亡的同时神经元微管骨架受损，内体-溶酶体系统的定位和功能也发生异常改变。     

不同亚型的帕金森病及多系统萎缩患者血浆α-突触核蛋白寡聚体浓度分析

目的 比较不同亚型帕金森病（Parkinson's disease,PD）和多系统萎缩（multiple system atrophy,MSA）患者血浆促进α-突触核蛋白（α-synuclein,α-Syn）寡聚体形成的能力。方法 选择性别与年龄匹配的健康受试者（Control）、震颤为主型PD（tremor dominant,PD-TD）、姿势不稳与步态困难为主型PD（postural instability gait difficulty,PD-PIGD）、小脑萎缩型MSA（MSA of cerebellar type,MSA-C）和混合型MSA（MSA between cerebellar and parkinsonism type,MSA-C+P）患者各10例,抽取血浆,与重组人α-Syn振荡孵育。Western blotting法和ELISA法检测各组α-Syn寡聚体形成量。结果 PD和MSA组α-Syn寡聚体形成量显著高于对照组（P<0.05）。虽然PD组α-Syn寡聚体形成量略高于MSA组,但差异无统计学意义。亚型分析显示,α-Syn寡聚体形成量在PD-PIGD组高于PD-TD组（P<0.05）,在MSA-C组高于MSA-C+P组（P<0.05）。结论 PD与MSA及其不同亚型患者血浆促进α-Syn寡聚体形成的能力不同。     

帕金森病患者血浆增强α-突触核蛋白细胞毒性及其机制研究

目的 研究帕金森病（Parkinson's disease,PD）患者血浆对α-突触核蛋白（α-synuclein,α-Syn）细胞毒性的影响及其机制。方法 将重组人α-Syn加入PD和对照血浆中,采用免疫印迹法及酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法鉴定α-Syn寡聚体和磷酸化形成情况。在原代神经培养基中加入终浓度为5 μmol/L的α-Syn单体及寡聚体,同时添加30%（体积分数）PD血浆、正常人血浆和胎牛血浆,孵育14 d后,MTT及流式细胞技术观察细胞死亡情况。酶活力试剂盒检测各组原代神经元中蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A,PP2A）酶活力。结果 PD患者血浆较正常受试者（normal subject,NS）血浆可促使更多的α-Syn磷酸化和寡聚化。与NS血浆相比,添加到原代神经元培养物中的PD血浆导致更多细胞在细胞外α-Syn存在下死亡,同时伴有PP2A活力降低。结论 PD患者血浆中可能通过降低PP2A酶活力使α-Syn发生磷酸化,导致其聚集并进一步使得原代培养神经元死亡。