肝细胞生长因子对人舌鳞癌 Tca8113细胞 VEGF-C 表达的影响及作用机制的初步研究

目的：研究 HGF 对人舌鳞癌 Tca8113细胞中 VEGF-C 表达的影响并探讨其作用机制。方法：体外培养 Tca8113细胞,应用 ELISA 方法测定不同浓度 HGF 作用下以及分别用 LY294002、U0126、SP600125、SB203580信号通路抑制剂阻断PI3K/Akt、P44/P22MAPK、JNK、P38MAPK 信号通路后 VEGF-C 的表达水平。结果：随着培养液中 HGF 浓度的增加,Tca8113细胞中 VEGF-C 的表达水平出现先增高后降低的趋势,当 HGF 浓度为40 ng/ml 时,VEGF-C 表达水平最高。PI3K/Akt 信号通路抑制剂（LY294002）和 P42/44MAPK 信号通路抑制剂（U0126）显著抑制了 HGF 刺激下 Tca8113的 VEGF-C 蛋白的表达（P ＜0．01）;而 JNK 信号通路抑制剂（SP600125）和 P38MAPK 信号通路抑制剂（SB203580）对 HGF 刺激下 Tca8113的 VEGF-C 蛋白的表达影响甚微（P ＞0．05）。结论：在人舌鳞癌 Tca8113细胞中,随着 HGF 浓度的增加,VEGF-C 的表达先增高后降低。PI3K/Akt 和 P44/P22MAPK 信号通路在口腔鳞状细胞癌淋巴转移中可能发挥作用。     

唑来膦酸对体外破骨细胞性骨吸收影响的研究

目的：研究唑来膦酸（zoledronicacid,ZOL）对体外培养的破骨细胞骨（osteoclastic0C）吸收的抑制作用。方法：体外培养兔破骨细胞,通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色破骨细胞计数、图像分析计算骨吸收陷窝面积、吖啶橙染色计算破骨细胞凋亡比率观察不同浓度唑来膦酸对细胞影响。结果：随着唑来膦酸浓度增高,TRAP阳性破骨细胞数量减少,骨吸收陷窝数量、陷窝面积亦减少;凋亡OC数目增多,凋亡率亦升高。结论：唑来膦酸通过抑制OC活性而直接抑制OC骨吸收功能,随其浓度增加而抑制作用增强。     

牙髓干细胞对牙周炎中破骨细胞的作用

目的研究牙髓干细胞（DPSC）对牙周炎中破骨细胞形成及牙槽骨再生的影响,并初步探索DPSC对小鼠破骨细胞的作用机制。 方法体外诱导小鼠骨髓单核细胞破骨分化,观察破骨细胞组（OC组）及其与DPSC共培养组（OC+DPSC组）的抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色情况,实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测破骨分化相关基因包括活化T细胞核因子（NFATc1）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）及TRAP的表达差异。体内构建小鼠慢性牙周炎模型,通过微计算机体层摄影（micro-CT）扫描后三维重建,比较慢性牙周炎+0.9%氯化钠溶液注射组（NS组）和慢性牙周炎+DPSC注射组（DPSC组）釉牙骨质界至牙槽嵴顶（CEJ-ABC）距离,并对标本进行苏木精-伊红和TRAP染色,观察DPSC对小鼠破骨细胞及牙槽骨再生的影响。采用SPSS 20.0软件进行数据统计分析,采用独立样本t检验及校正t检验分析组间差异。 结果体外TRAP染色发现,与DPSC共培养明显抑制成熟破骨细胞形成,OC+DPSC组成熟破骨细胞均数（4.2 ± 0.2）少于OC组均数（6.8 ± 0.2）,差异有统计学意义（t= 15.922,P<0.001）;破骨细胞表面积均数（0.046 ± 0.007）mm²也明显小于OC组（0.763 ± 0.015）mm²,差异有统计学意义（t = 83.174,P<0.001）。相对OC组,OC+DPSC共培养组的MMP-9、NFATc1及TRAP的mRNA相对表达量明显降低,均值分别为0.38 ± 0.17（t = 6.217,P = 0.003）、0.24 ± 0.12（t = 10.569,P = 0.003）和0.55 ± 0.13（t = 6.077,P = 0.026）。micro-CT扫描结果显示,DPSC注射组CEJ-ABC的平均距离为（0.215 ± 0.017）mm,明显小于0.9%氯化钠溶液组（0.311 ± 0.022）mm,差异有统计学意义（t= 10.921,P<0.001）,组织学观察下DPSC组炎症反应较0.9%氯化钠溶液组轻,且破骨细胞更少。 结论DPSC可通过抑制牙周炎破骨细胞的形成从而促进牙槽骨再生,有望作为一种可局部注射的骨代谢双向调节生物制剂,治疗临床上包括牙周炎等因骨代谢失衡引起的炎症性骨吸收疾病。     

JNK抑制剂对鼠实验性牙周病后基质金属蛋白酶影响的研究

目的 研究JNK特异性抑制剂SP600125对大鼠实验性牙周病后基质金属蛋白酶的影响。方法 18只雄性SD大鼠随机分为对照组、生理盐水组(腹腔注射生理盐水)和SP600125组(腹腔注射SP600125),每组6只。每只大鼠右侧下颌第一磨牙牙颈部结扎钢丝,4周后去除钢丝,对照组在全麻下切取牙龈组织。此后生理盐水组每天腹腔注射生理盐水,SP600125组每天腹腔注射SP600125稀释液,连续7d后分别在全麻下切取牙龈组织。利用明胶酶谱法,分别检测对照组、生理盐水组和SP600125组牙龈组织中MMP-2的酶活性。结果 SP600125组牙龈组织中MMP-2酶活性较对照组和生理盐水组明显降低,差异有统计学意义。结论 JNK特异性抑制剂SP600125能够降低实验性鼠牙周病牙龈组织中的MMP-2酶活性,进一步证实JNK传导通路在牙周病的形成和发展中起到重要作用,本研究可为牙周病的治疗提供一条新的途径。?     

牙齿萌出过程中 RANKL mRNA 的表达与破骨细胞的关系

目的:探讨核因子κB受体活化剂配体 RANKL 在大鼠下颌第一磨牙牙胚冠方组织中 mRNA 的表达及破骨细胞的分化情况.方法:运用原位杂交法检测大鼠下颌第一磨牙牙胚冠方组织中 RANKL mRNA 的表达;TRAP 染色观察破骨细胞分化情况.结果:出生1、3、5、7 d大鼠下颌第一磨牙牙胚冠方牙囊成纤维细胞、成釉细胞 RANKL mRNA的阳性表达强于对照组牙龈成纤维细胞(p<0.01).大鼠下颌第一磨牙牙胚冠方出生后1 d破骨细胞多为单核,3 d时多核破骨细胞增多.结论:RANKL mRNA 在大鼠出生后1、3、5、7 d下颌第一磨牙牙囊成纤维细胞、成釉细胞中有表达,可能通过促进破骨细胞的分化及成熟参与牙齿的萌出.     

基于RANKL/OPG通路探讨GsMTx4对大鼠正畸牙齿移动过程中压力侧牙周组织改建的影响

目的：从核因子-κB受体活化因子配体（RANKL）/骨保护素（OPG）通路探讨Piezo1蛋白通道的抑制剂GsMTx4对大鼠正畸牙齿移动过程中压力侧牙周组织改建的影响。方法：75只健康SD雄性大鼠构建正畸模型,随机分为对照、加力、加力+GsMTx4组。测量第一磨牙近中移动距离,HE染色观察上颌第一磨牙近中根压力侧牙周组织病理变化,免疫组化染色观察RANKL、OPG在压力侧牙周组织的表达量及定位,并观察RANKL/OPG比值的变化,抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察压力侧牙周组织中破骨细胞数量变化。结果：随着加力时间的延长,牙齿移动距离逐渐增加,加力组牙齿移动距离高于加力+GsMTx4组（P<0.05）;加力组与加力+GsMTx4组RANKL、RANKL/OPG比值以及破骨细胞数量均呈现先升高后降低的趋势,OPG呈现逐渐上升的趋势,且加力+GsMTx4组的值低于加力组（P<0.05）。结论：GsMTx4能够降低大鼠正畸牙齿移动过程中压力侧牙周组织中RANKL、OPG蛋白的表达,并且能够抑制破骨细胞的分化,从而降低骨吸收活动,进而抑制牙齿移动。     

失神经支配对牙周组织中P物质及破骨细胞的影响

目的 探讨切断大鼠下牙槽神经后,牙周组织中P物质的表达变化及其对破骨细胞的影响。方法 将30只雄性Wistar大鼠随机分为6组,每组5只,分为正常组（0 d）和术后第3、7、14、21、28天组。在下颌孔处切断大鼠左侧下牙槽神经,分别在相应的观测时点取材,常规制备大鼠牙周组织石蜡切片,行免疫组织化学染色观察P物质的表达情况,同时行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色观察破骨细胞的分布,并对免疫组织化学染色的平均光密度值和破骨细胞计数进行统计分析。结果 切断大鼠下牙槽神经后牙周组织中的P物质在第3天表现出明显的下降趋势,第7天达到最低值,第21天恢复到正常水平;破骨细胞的变化趋势与P物质的变化具有一致性。结论 切断大鼠下牙槽神经后,牙周组织中P物质与破骨细胞的变化呈正相关。P物质可能具有刺激并调节破骨细胞分化的作用,参与牙槽骨的代谢。     

可溶性白细胞介素-1和肿瘤坏死因子受体对大鼠正畸牙移动影响的研究

目的研究局部注射重组人类可溶性受体对大鼠正畸牙移动进程的影响。方法选取64只雄性SD大鼠,从加力第1天起在大鼠牙齿局部分别注射重组人类可溶性白细胞介素- 1受体Ⅱ（sIL- 1- RⅡ）、可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅰ（sTNF- RⅠ）、两者混合物,测量磨牙移动距离,用苏木精- 伊红（HE）染色观察被移动磨牙牙周组织形态学变化,并应用抗酒石酸盐酸性磷酸酶（TRAP）组织化学染色对破骨细胞和破牙骨质细胞的数量及分布的时相性改变进行分析。结果各受体组大鼠磨牙牙周组织形态学时相性变化与对照组相似,但各时间点牙槽骨吸收程度均较轻微,多数大鼠牙根表面很少或几乎没有明显牙骨质吸收迹象。与对照组相比,在第14天所有受体注射组牙槽骨及牙根表面TRAP染色阳性细胞降低了约50%（P<0.05）,但受体组组间差异无统计学意义（P>0.05）。结论在大鼠正畸牙局部注射重组人类可溶性白细胞介素- 1和肿瘤坏死因子受体,可以减少牙齿移动距离并减少牙根吸收。     

无翅型MMTV整合位点家族成员5A/受体酪氨酸激酶样孤儿受体2在大鼠牙囊细胞中的表达及其意义

目的 观察在牙齿正常萌出过程中无翅型MMTV整合位点家族成员5A（Wnt5A）/受体酪氨酸激酶样孤儿受体2（Ror2）信号在大鼠体内外牙囊细胞表达的特点,探讨其与成熟破骨细胞形成及牙齿萌出的相关性。方法 分离出生后1~13 d的SD大鼠下颌骨,苏木精-伊红染色观察牙囊及牙槽骨生长发育过程,免疫组织化学法观察在下颌第一磨牙萌出过程中Wnt5A和Ror2在牙囊细胞中的表达。体外培养出生后5~6 d的SD大鼠第一磨牙牙囊细胞,免疫组织化学法观察Wnt5A、Ror2在牙囊细胞中的表达。结果 SD大鼠出生后第2天牙囊开始分化为牙周组织,1~3 d牙槽骨变化不明显,第4天起,破骨细胞数量明显增多。Wnt5A在出生后第1~3天的大鼠牙囊组织内无明显表达,第4天开始出现阳性表达,并持续表达至第13天。Ror2在出生后第1~3天的大鼠牙囊组织表达呈强阳性,而在第4~13天呈弱阳性。结论 Wnt5A、Ror2在牙萌出过程中有特定的时间分布,提示其可能参与牙齿萌出的调控。     

布鲁顿酪氨酸激酶对破骨细胞增殖及分化作用的实验研究

目的 观察布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）对破骨细胞增殖及分化的影响,探讨BTK对根尖周炎骨破坏的作用。方法 破骨前体细胞RAW264.7经100 ng·L ^-1核因子κB受体活化因子配体（RANKL）诱导5 d后,通过观察细胞形态、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色及实时荧光定量PCR（RT-qPCR）的方法,验证破骨细胞是否诱导成功。破骨细胞诱导成功后,转染BTK-小干扰RNA（siRNA）24 h,利用RT-qPCR检测TRAP mRNA的表达,采用CCK-8和TRAP酶活性检测法检测破骨细胞的增殖及分化情况。结果 RAW264.7细胞经RANKL诱导5 d后,可见大量体积较大,外观呈圆形、椭圆形,周围有不规则突起及TRAP染色阳性的多核破骨细胞。经BTK-siRNA转染24 h后,破骨细胞TRAP mRNA的表达水平显著降低（P<0.05）,其增殖及分化能力也明显受到抑制（P<0.05）。结论 抑制BTK表达,可以抑制破骨细胞的增殖及分化;BTK可作为抑制破骨细胞的新靶点。     

小檗碱通过JNK信号通路调控大鼠脂肪干细胞成骨向分化

目的:探讨小檗碱(C20H18NO4)对大鼠脂肪干细胞(ADSCs)的成骨分化作用及其相关机制.方法:以5、10、20 μmol/L浓度小檗碱培养液处理ADSCs,未处理组为对照组,通过MTT法检测细胞增殖活性,应用碱性磷酸酶(ALP)染色及半定量、钙结节染色分析小檗碱对ADSCs成骨分化的影响,采用Western印迹...     

大鼠正畸牙移动过程中牙周膜骨硬化蛋白的表达

目的 观察正畸牙移动过程中大鼠牙周组织中骨硬化蛋白（Sclerostin）的表达及分布,研究Sclerostin在正畸牙移动骨改建中的作用。方法 选取24只Wistar大鼠,安装加力装置,加载50 g力近中移动左侧第一磨牙,分别于安装加力装置后的0、1、3、5、7、14 d处死大鼠,用苏木精-伊红（HE）染色观察第一磨牙牙周组织形态学变化,抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色观察破骨细胞的数量变化,免疫组织化学染色方法探究第一磨牙牙周膜中Sclerostin的表达变化。结果 HE染色显示随加力时间的延长压力侧骨组织破坏逐渐加重,免疫组织化学染色显示Sclerostin的表达逐渐增加,5 d时达到高峰,之后又逐渐降低,压力侧表达多于张力侧。结论 Sclerostin可能通过Wnt信号通路或者直接或间接控制骨形态发生蛋白参与了正畸牙移动骨改建过程。     

降钙素对小鼠牙齿萌出途中破骨细胞的影响

目的:在体研究降钙素对正常小鼠牙齿萌出过程中破骨细胞的影响,并分析其机制。方法:同一窝10只出生3d小鼠随机分成对照组和降钙素组,后者皮内注射鲑鱼降钙素每日1U/100g,连续3d。自注药起7d取其下颌骨,分别用酶组织化学和免疫组织化学的方法检测破骨细胞、RANKL阳性细胞在牙胚周围组织中的变化情况。结果:降钙素组的平均破骨细胞数、RANKL表达较对照组明显降低。结论:降钙素对正常小鼠牙齿萌出过程中的破骨细胞可能有抑制作用,这可为牙齿萌出的研究提供一定参考。     

Immunolocalization of CSF-1, RANKL and OPG in the enamel-related periodontium of the rat incisor and their implications for alveolar bone remodeling

The enamel-related periodontium (ERP) in rat incisors is related to bone resorption. In these teeth the face of the socket related to the enamel is continuously removed at the inner side and newly formed at the outer side. CSF-1, RANKL and OPG are regulatory molecules essential for osteoclastogenesis. To verify the effects of impeded eruption on bone remodeling, the tooth eruption was prevented by immobilization of lower rat incisor and CSF-1, RANKL and OPG distribution in the ERP was analyzed after 18 days of immobilization and in normal eruption. The region of the alveolar crest of the rat incisor was used. Immunohistochemistry and tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) were performed. The immunostaining of the dental follicle was quantified using Leica QWin software. Positive-TRAP osteoclasts were counted, and both groups were compared. In the normal incisor, the number of osteoclasts was significantly greater than in the immobilized tooth. In the dental follicle, there was no significant difference in the immunostaining intensity for CSF-1 and OPG between the groups (p > 0.05), but for RANKL the immobilized incisor group showed immunostaining intensity smaller than the normal incisor group (p < 0.01). These findings suggest that changes in the ERP, in the immobilized incisor, modify the RANKL/OPG ratio, in the presence of CSF-1, altering the metabolism of cells that participate in the bone remodeling.     

JNK抑制剂对鼠实验性牙周病后基质金属蛋白酶-2mRNA影响的研究

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双氢青蒿素对人口腔鳞癌细胞KBV200多药耐药的影响

目的 检测双氢青蒿素（dihydroartemisinin,DHA）对人口腔鳞癌细胞KBV200多药耐药的作用,并探讨其与ROS-MAPK通路的关系。方法 利用MTT法检测不同浓度DHA对KB、KBV200细胞增殖的影响,顺铂（cisplatin,DDP）、长春新碱（vincristine,VCR）、阿霉素（adriamycin,ADM）、依托泊苷（etoposide,VP-16）对KB、KBV200细胞的增殖抑制率及加入DHA后的变化;分别联合ROS诱导剂3-AT、ERK抑制剂UO126、JNK抑制剂SP600125、p38MAPK抑制剂SB203580,观察干预前、后的逆转差异。利用流式细胞术检测各组细胞内ROS的荧光强度,采用SPSS 17.0软件包对数据进行统计学分析。结果 与KB细胞相比,KBV200细胞对VCR、VP-16、ADM药物的耐药性显著提高（P<0.05）,10、20、30 μg/mL DHA作用后,KBV200细胞对VCR、VP-16、ADM的IC₅₀显著降低,呈浓度依赖性（P<0.05）。与KB组细胞相比,KBV200组细胞ROS荧光强度显著降低（P<0.05）;DHA处理后,ROS荧光强度显著增高,VCR、VP-16、ADM IC50 显著降低（P<0.05）,与ROS促进剂效果一致。与KB细胞相比,KBV200细胞p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK水平显著升高（P<0.05）;DHA处理后,p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK水平显著降低,VCR、VP-16、ADM IC₅₀ 显著增高（P<0.05）;加入ERK抑制剂UO126、JNK抑制剂SP600125、p38MAPK抑制剂SB203580后,KBV200细胞VCR、VP-16、ADM IC₅₀ 进一步降低。结论 双氢青蒿素可能通过促进ROS生成、抑制MAPK通路而逆转KBV2001细胞的多药耐药性。     

Inhibition of osteoclastogenesis by the secretion of osteoprotegerin in vitro by rat dental follicle cells and its implications for tooth eruption

Tooth eruption requires the presence of the dental follicle, a loose connective tissue sac that surrounds each unerupted tooth. Early postnatally in the rat, the follicle secretes colony-stimulating factor-1 (CSF-1) and monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1), chemotactic molecules that are probably responsible for the recruitment of mononuclear cells. These cells, in turn, fuse to form osteoclasts, which are required for alveolar bone resorption to form an eruption pathway. Recent studies have shown that the osteoprotegerin (OPG) gene is expressed in the dental follicle, but in the first mandibular molar of the rat, that expression is reduced at day 3, the time of maximal osteoclast numbers on the alveolar bone. Inhibition of OPG expression at this time would allow osteoclast formation/activation. To determine if the dental follicle cells do secrete OPG that inhibits osteoclastogenesis, spleen cell cultures were established and soluble osteoclast differentiation factor (ODF) and CSF-1 added to some of them to promote osteoclast formation. In other cultures, dental follicle cells were added in an insert, such that they did not touch the spleen cells. Using a quantitative, tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) assay, it was shown that ODF and CSF-1 promoted osteoclastogenesis in the spleen cell cultures, but the addition of the follicle cells inhibited this and returned the TRAP activities to those seen in cultures of spleen cells only. Adding anti-OPG to these cultures, however, negated the effect of the follicle cells, demonstrating that OPG was the inhibitory molecule secreted by those cells. The follicle cells also immunostained for OPG, confirming that they synthesize OPG. These findings, coupled with those of other studies which show that the periodontal ligament (a derivative of the dental follicle) also secretes OPG, indicate that, except for the period of time in tooth eruption, where osteoclast formation is needed to form an eruption pathway, secretion of OPG would be the norm, presumably to prevent resorption of alveolar bone and subsequent disruption of the periodontal ligament.