胎鼠海马神经元原代培养及转染条件的优化

目的 建立一种稳定的大鼠胎鼠海马神经元培养方法并能够有效的鉴定其纯度,探讨用化学转染试剂体外转染大鼠胎鼠海马神经元的最佳转染条件.方法 分离Wista大鼠E18d胚胎并取海马组织,无血清培养基培养并做MAP2荧光染色鉴定其纯度.应用lipofectamine <'TM>2000转染试剂盒,大鼠神经元电转试剂盒,lipo...     

一种同时培养原代皮质及海马神经元的实验方法北大核心

背景:近年来原代神经元细胞模型在颅脑疾病中扮演着重要的角色,此类细胞模型特性更加贴近于疾病细胞,可用于模拟研究各类神经系统疾病。目的:建立一种便捷实用的可同时提取皮质及海马原代神经元的培养方法。方法:取新生24 h内的SD大鼠,麻醉后断脊法处死,采用体积分数为75%乙醇消毒,用镊子分离出颅骨及脑膜,解剖出完整大脑,剥离脑血管膜,游离出大脑皮质及海马组织,采用木瓜蛋白酶及适量DNA酶顺序消化方案,吹打、离心、过滤,然后接种于左旋多聚赖氨酸包被的6孔板和爬片内,以含体积分数10%胎牛血清的DMEM-F12培养基为种植液,6 h后换用含有B27的Neurobasal无血清专用培养基,持续培养7 d后,显微镜下观察细胞形态及生长状态。分别采用β-Tubulin免疫荧光法、Neun抗体免疫组化法鉴定皮质神经元与海马神经元,以及采用MAP2免疫荧光法鉴定其纯度。结果与结论:①接种24 h后细胞体积变清晰,呈不规则圆形、周围环绕光晕,少数细胞已有细小突起,均已贴壁生长;持续培养3 d后,胞体逐步增大,部分呈聚团性生长,突触延长,细胞间出现交联;持续培养7 d后,胞体成熟饱满,细胞质显著增多,光晕增强,形成更为密集的神经元网络;②经Neun抗体免疫组化法、β-Tubulin免疫荧光法鉴定为神经元,神经元标志物MAP2免疫荧光法鉴定皮质神经元和海马神经元纯度分别为(94.00±0.34)%和(91.00±0.26)%,可用于后期实验;③结果表明,采用同一批24 h内新生SD大鼠分离大脑皮质和海马组织,经木瓜蛋白酶与DNA酶顺序消化后,可提取到优质的海马神经元及皮质神经元。该方案得到的神经元纯度高,操作简化,可作为研究各类神经系统疾病细胞模型的基础。     

新生大鼠海马神经元原代无血清培养与鉴定

 摘要:目的 建立一种简单、易行的海马神经元无血清体外培养方法以获得高纯度、高活力的海马神经元。方法 取新生24h内SD大鼠,分离海马,经消化后种植于包被有Matrigel基膜的玻片上,24h后换含有N2、B27的neurobasal无血清培养基,于不同时间在倒置相差显微镜下观察细胞的生长状态;采用β-tublinⅢ免疫荧光细胞化学技术鉴定海马神经元纯度。结果 大部分海马神经元于3-24h贴壁且可长出细长突起,3d细胞具有典型神经元的形态特征, 5d神经突起进一步增多并形成稠密的网络连接,7d神经元胞体丰满,趋于成熟。经β-tublinШ免疫荧光技术鉴定纯度为（94.2±3.6）%。结论 此方法简单有效,可获得高纯度的海马神经元。     

大鼠海马神经元培养与鉴定

探索适用于膜片钳记录的大鼠海马神经元的分离及原代培养方法,并检测其电生理特性。采用钝性分离1日龄SD大鼠双侧海马,经酶消化及吸管吹打,用含胎牛血清、马血清的DMEM体外培养,并经阿糖胞苷处理24h,第9—15d用于膜片钳全细胞模式检测神经元电生理特性。结果显示培养的海马锥体神经元表面光洁,膜片钳记录封接成功率90％,具有正常神经元的电生理及反应特性。表明本分离及原代培养方法,有益于大鼠海马锥体神经元生长,并适用于膜片钳记录。     

新生大鼠离体海马神经元原代培养方法及鉴定

目的:建立一种稳定的生后大鼠离体海马神经元的培养方法。方法:无菌环境下将出生24 h内SD大鼠断头取脑分离海马,经消化后差速贴壁,采用无血清培养基进行培养,倒置显微镜下观察不同时间段细胞生长形态变化:采用Hoechst33258与NeuN抗体双染方法鉴定神经元。结果:采用差速贴壁后,使用无血清培养基培养的神经元生长良好,纯度较高,12 d时经鉴定神经元纯度可以达到92%以上。结论:差速离心法后可以采用无血清培养神经元,培养的神经元具有纯度高,结果稳定的优点,该方法为以后进行相关的研究奠定了基础。     

一种稳定高效的新生大鼠皮质神经元原代培养方法

目的:建立一种稳定、高效、简单可行的新生大鼠大脑皮质神经元原代培养方法。方法:取新生24 h内的SD大鼠,分离皮质,采用木瓜蛋白酶消化、实验前多聚赖氨酸铺板、不同机械吹打次数及细胞接种2 h后全量换为添加B-27的Neurobasal A培养基的培养方法,MTT比色法分析检测神经元细胞成活率;于不同时间在倒置相差显微镜下观察细胞的生长状态;利用神经元特异性标志物微管蛋白相关标志物2(microtubule associated protein 2,MAP2)鉴定神经元纯度。结果:木瓜蛋白酶明显增加原代培养神经元细胞活力(P0.01),采用适度的机械吹打、实验前多聚赖氨酸铺板及细胞接种2 h后全量换为添加B-27的Neurobasal A培养基,对神经细胞的活力没有明显的影响(P0.05)。大部分皮质神经元具有典型的神经元形态特征,经MAP2免疫荧光技术鉴定神经元所占比例达95%以上。结论:该方法操作简单高效,方便可行,结果稳定。     

一种同时培养原代神经元和原代星形胶质细胞的实验方法

目的 建立一种简便实用的可同时提取原代神经元和原代星形胶质细胞的培养方法.方法 选用出生24 h的SD乳鼠,75％乙醇消毒,断脊法处死.用眼科镊拨开脑膜各层,取出完整大脑.游离海马,剥离血管,木瓜蛋白酶消化,然后吹打、离心、过滤,以合适密度种植于相应培养皿.4h后更换培养基,以后每2天半量换液培养.第5天用免疫荧光法鉴...     

新生SD大鼠大脑皮质神经元的原代培养及鉴定

背景：培养神经元的质量是研究中枢神经系统疾病的关键所在,但培养方法一直没有统一的标准。目的：探究取材部位及阿糖胞苷处理对原代培养神经元活性、纯度及成熟度的影响。方法：选取新生24 h内的SD乳鼠,取大脑皮质表面2.0-3.0 mm处细胞,培养后24,48,72 h,用5μmol/L或10μmol/L阿糖胞苷处理48 h;另取全部大脑皮质细胞,培养后48 h用5μmol/L阿糖胞苷处理48 h。培养至第7天,倒置显微镜下观察细胞形态,采用CCK-8法检测阿糖胞苷对神经元活性的影响,免疫荧光和Western blot检测神经元的纯度及成熟度。结果与结论：（1）倒置显微镜：10μmol/L阿糖胞苷24,48,72 h组神经元密度分别低于同时间下的5μmol/L阿糖胞苷组,该6组神经元突起相互之间均可连接成紧密的网状结构,神经元胞体丰满并充满折光特性;全皮质组细胞密度低于正常对照组,并可明显观察到非神经元;（2）CCK-8检测：各阿糖胞苷组细胞活性均低于正常对照组（P <0.001）, 10μmol/L阿糖胞苷24,48,72 h组神经元活性低于同时间下的5μmol/L阿糖胞苷组（P &...     

新生大鼠海马神经元的体外原代培养

目的研究体外原代培养新生大鼠海马神经元的方法,并观察其发育分化过程中形态学的变化。方法取出生24 h内的Wistar大鼠分离海马,消化后差速贴壁,种植在涂有多聚-L-赖氨酸的盖玻片上,于不同时间在倒置相差显微镜下观察形态变化;采用NSE免疫细胞化学技术鉴定神经元。结果神经元12~24 h后大部分贴壁,随时间延长形态多变,突起逐渐增多,神经元突起间互相接触形成网络。培养第7~10天时细胞最为丰满,至28天时培养液中有悬浮的细胞碎片。NSE鉴定结果显示神经元纯度为(92.3±6.8)%。结论该方法简单易行,神经元纯度较高,可作为神经元体外培养的良好模型用于以后的研究。     

SD乳鼠原代皮质神经元及星形胶质细胞同时培养的实验方法

背景：目前获取原代皮质神经元和星形胶质细胞的方法很多,传统方法通常是分别获取这两种细胞,但实验方法过于繁琐且浪费实验材料。找到一种简单、经济、可行并同时提取这两种细胞的培养方法尤为重要。目的：观察同时提取培养SD乳鼠大脑皮质神经元及星形胶质细胞的效果及注意事项。方法：选用出生24 h内的SD乳鼠,用体积分数为75%乙醇浸泡消毒,待乳鼠昏迷后断脊处死,沿乳鼠颈部用剪刀离断头颅并放入装有高糖DMEM的小烧杯中,沿矢状缝打开头颅并取出大脑放入盛有高糖DMEM的培养皿中。在冰上剥出脑膜及血管,夹取皮质表面2.0-3.0mm的脑组织,通过木瓜酶和DNA酶进行消化20 min,用含有体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12终止消化。以细胞浓度为1.0×10⁹L^-1种植于含有爬片(用多聚赖氨酸处理)的6孔板中,分别于1,3,5,7 d通过倒置荧光显微镜下观察神经元的形态变化,使用Calcien-AM进行活细胞染色观察细胞活性,β-Tubulin、MAP2免疫荧光染色对神经元进行鉴定。将剩余大脑皮质进行星形胶质细胞的提取,经过胰酶消化、过滤、吹打,以适宜的...     

体外获得高纯度大鼠背根神经节神经元的原代培养

目的：建立一种切实可行的胚胎大鼠背根神经节神经元培养及纯化方法。方法：用显微解剖获取足够数量的胚胎大鼠背根神经节,通过胰蛋白酶+EDTA消化、交替使用NB培养基与加入了5-氟-2-脱氧尿嘧啶核苷酸/尿苷的抗有丝分裂NB培养基等方法,在体外获得纯化的背根神经节神经元,采用神经丝蛋白免疫细胞化学染色法与DAPI染核的方法鉴定并测定神经元的纯度。结果：获得的背根神经节神经元在体外生长良好,纯度可达到96%以上。结论：本实验方法可以获得大量高度纯化的大鼠背根神经节神经元。     

蝎毒耐热蛋白对原代培养海马神经元NPY表达的影响

探讨具有抗癫痫反复发作作用的蝎毒耐热蛋白(scorpion venom heat-resistant protein,SVHRP)对大鼠海马神经元神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)表达的影响。采用免疫细胞化学ABC法与HPIAS系列彩色病理图文定量分析系统相结合,检测NPY-免疫阳性产物(NPY-IR)表达的变化,用RT-PCR技术观察NPY mRNA表达水平的变化。终浓度范围为0.2、2、20和200μg/ml的SVHRP分别与培养10d的海马神经元共孵育24h后,NPY阳性神经元的反应强度明显增强,具有剂量-反应关系。终浓度为20μg/ml的SVHRP分别与培养10d的海马神经元共孵育3、6、9、12和24h,NPY阳性反应强度增强,并呈时间-反应关系。RT-PCR结果显示,20μg/ml的SVHRP与原代培养海马神经元共孵育24h后,NPY mRNA的表达明显增加。以上结果提示SVHRP可诱导原代培养海马神经元NPY阳性反应和NPY mRNA的表达。     

原代培养大鼠海马细胞随培养时间早期凋亡和死亡增加

神经细胞在原位组织已经完成分裂和分化,培养的神经元将不会分裂、增殖,其数目也会随着培养时间的延长而减少,但目前还没有见到对原代培养过程中神经细胞凋亡以及死亡情况的研究。利用Annexin V-PI双染法可以将凋亡早期与凋亡晚期和死亡细胞区分开,本研究将分别收获第0、1、3、5、8、11及18d细胞进行Annexin V-PI染色,利用流式细胞仪来研究在原代培养过程中神经元的早期凋亡和死亡。     

一种高纯度多巴胺神经元原代培养方法的建立

目的:通过胚胎中脑祖细胞(MPC)体外培养获得高纯度的多巴胺神经元培养体系.方法:取自E12鼠胚中脑腹侧的MPC悬液在添加bFGF的DMEM/F12/N2/L-抗坏血酸-2-磷酸酯倍半镁盐(AA-2P)培养液中扩增培养,5 d后停用bFGF,促进细胞分化,4 d后通过Neurobasal/阿糖胞苷(Ara-c)抑制胶质细胞生长,获得纯神经元,使用TH鉴定细胞,计数细胞比例和纯度,β-tubulin III鉴定成熟神经元,并计数细胞比例和纯度.结果:在添加了bFGF 20 μg/L的DMEM/F12/N2/AA-2P培养液中MPC增殖良好,体外培养7 d后细胞数量扩增到培养前的(16.54±1.25)倍;使用Neurobasal/阿糖胞苷后胶质细胞受抑制,神经元占94%以上,其中多巴胺(DA)能神经元的比例约(35.56±4.13)% .结论:E12鼠胚MPC原代培养合并使用阿糖胞苷是获取高纯度DA能神经元培养体系的可靠途径.     

单纯疱疹病毒Ⅰ型感染胎鼠原代神经元细胞模型的建立

目的 建立单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-Ⅰ)感染胎鼠原代皮质神经元细胞模型。方法 取孕14～16d昆明小鼠皮质神经元进行细胞培养并感染HSV-Ⅰ。观察倒置光学显微镜下神经元形态变化，并应用流式细胞仪检测二者的百分比。应用间接免疫荧光方法观察正常及病毒感染组神经元和星形胶质细胞的变化。用特异性HSV-Ⅰ荧光抗体检测神经元受染情况，并利用MTT比色实验检测细胞活性。结果 原代培养神经元数量、形态良好。用阿糖胞苷抑制星形胶质细胞生长后，神经元纯度较高。培养3d时加入HSV-Ⅰ感染神经元，HSV-Ⅰ特异性免疫荧光反应阳性，受染神经元形态变化，活性降低。结论 HSV-Ⅰ可直接感染原代培养神经元细胞，为进一步研究单纯疱疹病毒脑炎的发病机制提供了较好的体外模型。     

探讨阿糖胞苷在原代大鼠海马神经元培养中的纯化方法

目的　探讨阿糖胞苷(Ara-C)在原代大鼠海马神经元早期纯化培养中的优化方法。 方法　新生1d SD大鼠海马神经元原代培养48 h后,不同浓度（0、2.5、5.0、7.5、10 mmol/L）Ara-C 处理0、6、12、24 h,光镜下观察细胞形态,采用MTT检测细胞活性,并通过细胞形态学分析神经元纯度,筛选出最优纯化浓度与时间;采用免疫荧光及Western blot技术检测微管相关蛋白2（MAP2）进一步检测神经元纯度,台盼蓝染色分析神经元存活率。 结果　大鼠原代海马神经元培养48 h,5 mmol/L Ara-C处理24 h得到的神经元纯度及活性最佳;MAP2免疫荧光染色结果显示,Ara-C处理组神经元纯度为(74.28±10.13) %,显著高于对照组(34.82±8.15)% (P=0.000);Western Blot结果显示Ara-C处理组MAP2蛋白水平显著高于对照组(P=0.008);台盼蓝染色显示Ara-C处理组与对照组间海马神经元存活率无差异,分别为(93.2±3.82)%和(95.6±2.37)% (P=0.109)。 结论　在大鼠原代海马神经元的早期培养过程中,5 mmol/L Ara-C处理24 h得到的海马神经元的纯度与活性最佳。     

体外培养乳鼠海马神经元的扫描电镜观察

目的：研究体外培养海马神经元的表面超微结构。方法：用扫描电镜对海马培养细胞进行形态学观察。结果：体外培养的海马神经元具有梭形、锥体形、多角形等多种形态，细胞突起长短不一，粗细不匀，可见形态不同，大小不均的膨体样结构，树突上可见树突棘，突起末端可见生长锥，突起之间有连接。结论：体外培养的海马神经元具有与在体细胞相似的形态学特征。     

阿糖胞苷对原代培养的大鼠大脑皮层神经元的影响

阿糖胞苷(1-β-D-arabinofuranosylcytosine,Ara-C)是治疗急性白血病最常用的药物之一。Ara-C可诱导细胞凋亡。体外神经元的原代培养中,常在适当时间加入一定剂量的Ara-C作为细胞分裂抑制剂以抑制非神经元的增殖,从而提高神经元的产率。但Ara-C对正常培养的细胞的活性有一定的毒性,且随时间和剂量呈正相关。     

大鼠胚胎原代海马神经元两种转染方法的比较

目的:原代海马神经元是原代细胞中比较难转染的细胞,为了得到比较高的转染效率,通过比较Li-pofectamine2000转染法和大鼠神经元核电转法(rat neuron nucleofector kit)转染效率及转染前后细胞的存活率,来探讨Nucleofector Kit核电转法的高效性。方法:选取胚胎18 d(E18)大鼠的海马神经元进行原代培养,获取海马神经元单细胞悬液后,于种植前和种植24 h后分别采用Nucleofector Kit和Lipofectamine 2000转染红色荧光蛋白(red fluorescence protein,DsRed)质粒。神经元转染48 h后分别采用轴突标记物Tau-1进行免疫荧光染色鉴定神经元。神经元的存活率采用台盼兰进行检测。结果:Lipofectamine2000的基因转染率仅为5.34%,而大鼠神经元Nucleofector Kit的转染率为44.54%,后者为前者的8.34倍。Lipofectamine2000转染细胞前后的存活率分别为98.56%和91.44%,而Nucleofector Kit组分别为98.26%和74.02%。结论:大鼠神经元核电转法能高效稳定的转染原代海马神经元。