质粒重编程诱导多潜能干细胞及定向分化神经干细胞

目的 　探讨游离质粒载体重编程诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)为非整合型诱导多潜能干细胞,并在体外定向分化为神经干细胞(neural stem cells, NSCs), 为神经干细胞移植治疗神经损伤提供稳定、安全的细胞来源。 方法　使用电转仪将质粒pEP4-EO2S-ET2K转入小鼠MEFs, 经诱导培养重编程为诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs), iPSCs在不同诱导培养基中经2次悬浮及贴壁培养分化为NSCs,在体内及体外实验鉴定iPSCs多向分化潜能特性及NSCs特性。 结果　体内外实验显示iPSCs具有与胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)相似的多向分化潜能, 且不整合外源性基因。iPSCs进一步分化的NSCs其相关标志基因表达与野生型NSCs相近,且较iPSCs显著增加,免疫荧光显示NSCs高表达NSC标志物 NESTIN及PAX6,在体外存活能分化为神经元、少突胶质细胞及星形胶质细胞。 结论　游离质粒能重编程诱导非整合型iPSCs, 并定向分化为神经干细胞及神经元, 是神经损伤修复的理想种子细胞。     

促红细胞生成素对小鼠诱导多能干细胞源性神经干细胞向功能性神经元样细胞分化的影响

目的:探讨促红细胞生成素体外对小鼠诱导多能干细胞(iPSCs)来源的神经干细胞神经分化的影响。方法:神经干细胞培养基培养诱导iPSCs分化为神经干细胞,设4个浓度加入含促红细胞生成素的培养基,免疫细胞化学荧光鉴定神经元标志物微管相关蛋白2(MAP-2)、神经干细胞标志物巢蛋白的表达。FM 1-43染色技术观察FM 1-43染色颗粒消失的情况。结果:iPSCs在条件培养液的诱导下形成神经干细胞克隆,15 U/ml促红细胞生成素处理后神经干细胞克隆球向神经元方向分化,呈MAP-2阳性细胞。新分化的神经元有大量FM 1-43绿色阳性颗粒。结论:iPSCs体外诱导可获得神经干细胞,促红细胞生成素浓度为15 U/ml时可促进iPSCs源性神经干细胞向功能性的神经元方向分化。     

人诱导性多能干细胞向神经干细胞分化的方法探讨

目的:探讨人诱导性多能干细胞(iPS细胞)体外定向分化为神经干细胞(NSCs)的方法。方法:人iPS细胞悬浮培养4 d形成的拟胚体(EB)经维甲酸(RA)诱导4 d,诱导后的EB在无血清培养基中筛选并扩增培养。倒置显微镜下观察诱导后细胞的形态变化,RT-PCR检测iPS细胞多能性基因Nanog、Oct4和Sox2的表达,免疫荧光法检测NSCs特异性标志物Nestin、神经元标志物β-tubulinⅢ和神经胶质细胞标志物GFAP的表达。结果:(1)人iPS细胞在饲养层细胞上稳定传代,表达多能性基因Nanog、Oct4和Sox2,去除饲养层后悬浮培养能形成球形EB;(2)经RA诱导后的EB在无血清培养基中筛选培养第1 d贴壁生长,周围爬出细胞;第3 d,在高倍镜下可见中央聚集的细胞呈环形的rosette结构,rosette结构增多到第7 d达高峰。对照组未观察到rosette结构。随后大部分rosette细胞脱离瓶壁悬浮生长,形成神经球样克隆。免疫荧光显示神经球呈nestin阳性表达。贴壁培养的神经球能分化成β-tubulinШ和GFAP阳性细胞。结论:RA诱导结合无血清培养基筛选法能诱导iPS细胞高效分化为NSCs。     

Sox2诱导小鼠胚胎成纤维细胞直接重编程为神经干细胞

目的:探讨Sox2诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)直接重编程为神经干细胞的方法,为诱导神经干细胞(induced neural stem cells,i NSCs)作为种子细胞治疗脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)奠定实验基础。方法:逆转录病毒感染Sox2转录因子的MEFs在神经干细胞培养基中贴壁培养10 d。随后,悬浮、贴壁反复循环培养3次。Real-time PCR检测神经干细胞标志基因和多潜能标志基因的表达。i NSCs在分化培养基中贴壁培养7~14 d,免疫荧光分别检测神经干细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的标志物nestin、MAP2、GFAP和MBP的表达。将i NSCs显微注射至小鼠大脑皮质,7~14 d后免疫荧光检测神经细胞标志物nestin、MAP2、GFAP和MBP的表达。结果:Real-time PCR显示i NSCs的多种神经干细胞标志基因nestin、Blbp、Pax6和zbtb16表达较诱导前显著增高(P0.05),且i NSCs不表达多潜能相关基因Nanog、Oct4和zfp42。免疫荧光显示i NSCs高表达神经干细胞标志物nestin。免疫荧光同时表明i NSCs可在体内外存活并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论:Sox2可以诱导MEFs直接重编程为神经干细胞。i NSCs具有自我更新的能力,且在体内外都具有三向分化潜能,可作为修复SCI合适的种子细胞。     

神经干细胞体外培养鉴定及诱导分化的表型特征

背景：神经干细胞促进受损中枢神经系统结构和功能再修复具有广阔的应用前景,而进行神经干细胞体外培养鉴定及诱导分化表型的研究是实现这一应用的基础。 目的：观察神经干细胞在体外培养条件下的生物学特性和分化表型特点。 方法：从新生小鼠海马、嗅球提取神经干细胞。选取3代后稳定的神经干细胞采用BrdU进行标记,并进行BrdU+巢蛋白+Hochest33258免疫荧光复合染色对神经干细胞进行鉴定。体外诱导促使神经干细胞贴壁分化,对分化产生的子代细胞进行BrdU、β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白、Hochest33258复合免疫荧光染色确定分化表型。 结果与结论：来源于新生鼠海马及嗅球的细胞连续传代培养后可形成稳定悬浮的类球状细胞团,且BrdU+巢蛋白免疫荧光双染阳性。神经干细胞体外诱导贴壁分化后可产生β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白阳性的子代细胞。以上结果表明体外培养的神经干细胞具有很强的自我增殖更新的能力,在培养过程中趋向于形成稳定的神经球,经体外诱导通过不对称细胞增殖、分化产生神经元和星形胶质细胞等细胞表型。     

序贯培养法诱导小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化的研究

目的诱导小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化。方法通过"序贯培养法"诱导小鼠胚胎干细胞分化为神经细胞,并应用RT-PCR、免疫荧光、端粒酶活性及基因芯片等对诱导结果进行检测。结果分化细胞表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)、低分子量神经微丝蛋白(NF-L)、神经细胞粘附分子1(NCAM1)、微管相关蛋白Tau等多种神经元标志物,免疫荧光显示NSE阳性率为(81±9.2)%,而神经胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)几乎不表达。基因芯片分析结果显示,在3张芯片中有8179个基因共表达,另有998个基因的表达完全不同,且有多种神经元基因的标志物表达明显升高。结论通过"序贯培养法"能有效地诱导小鼠胚胎干细胞向神经元分化。     

人胚胎纹状体来源神经干细胞的体外培养

背景：目前神经干细胞多由动物获得,不适合人类临床移植治疗。 目的：探索体外环境下人胚胎纹状体来源神经干细胞的培养方法,同时观察其生物学特性。 方法：取经水囊引产的孕8-16周人胚胎纹状体,体外用无血清DMEM培养基进行培养,待细胞形成神经球后进行传代,并应用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/ F12培养液进行诱导分化。 结果与结论：体外培养的人胚胎纹状体来源神经干细胞生长迅速,表达神经干细胞标志物nestin。克隆形成实验显示细胞克隆形成率为6.0%-7.0%;BrdU掺入实验显示细胞增殖率为37.9%。免疫荧光染色显示经诱导分化的细胞表达神经元标志物Ⅲ型β微管蛋白、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白及神经干细胞标志物nestin,但不表达少突胶质细胞标志物髓鞘碱性蛋白。可见人胚胎纹状体来源神经干细胞在体外无血清条件下可保持其生物学特点,具有自我更新能力,经胎牛血清诱导后可向神经元及星形胶质细胞分化。     

人脐血干细胞定向分化为多巴胺能神经元的实验研究

目的 探讨人脐血干细胞定向分化为多巴胺(DA)能神经元的最佳诱导条件.方法 体外分离、原代培养人脐血干细胞,流式细胞仪检测其表面标志,分别以EGF bFGF、ATRA、ATRA EGF bFGF、纹状体条件培养液、纹状体星形胶质细胞条件培养液对其进行诱导,倒置相差显微镜观察细胞形态的变化.应用免疫荧光染色技术检测DA能神经元标志物酪氨酸羟化酶(TH)的表达.结果 比较各组对人脐血干细胞定向分化为DA能神经元的诱导作用,纹状体星形胶质细胞条件培养液＞纹状体条件培养液＞ATRA EGF bFGF组＞ATRA组＞EGF bFGF组＞对照组.结论 纹状体组织对人脐血干细胞定向分化为DA能神经元的诱导作用优于其他各组,并且此作用可能主要源于纹状体的星形胶质细胞.     

体外诱导人脐带间充质干细胞向神经干细胞的分化

背景：人脐带间充质干细胞较骨髓、脂肪等来源的间充质干细胞易取材、更为原始,并不受伦理、法律的限制,是中枢神经系统损伤修复最具治疗潜力的细胞来源之一。 目的：探讨重组人碱性成纤维生长因子、重组人表皮生长因子定向诱导人脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的潜能。 方法：采用碱性成纤维生长因子、表皮生长因子作为诱导剂,体外诱导人脐带间充质干细胞;在倒置显微镜下动态观察细胞形态学变化,并用免疫荧光法检测人脐带间充质干细胞向神经干细胞分化的情况,实时荧光定量PCR技术检测诱导前后神经干细胞标记蛋白巢蛋白在mRNA水平的相对表达量。 结果与结论：形态学观察经诱导后的人脐带间充质干细胞呈神经干细胞球改变;免疫荧光法及实时荧光定量PCR技术均可检测到神经干细胞标记物巢蛋白,并可进一步分化表达神经元标志蛋白神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2 以及神经胶质细胞蛋白、神经胶质原纤维酸性蛋白。碱性成纤维生长因子、表皮生长因子可定向诱导人脐带间充质干细胞向神经干细胞及神经元、神经胶质细胞分化。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

小鼠诱导性多能干细胞的神经细胞分化与突触连接的建立及其功能分析

目的探讨小鼠诱导性多能干细胞(i PSCs)在体外某些因素的诱导下能否分化成功能性的神经细胞,以及神经细胞之间突触的发生与建立。方法首先将i PSCs悬浮培养形成拟胚体,利用维甲酸(RA)将其诱导分化成神经前体细胞,最后撤去RA贴壁培养,利用免疫荧光染色技术观察小鼠i PSCs在体外分化成神经细胞以及神经细胞之间突触发生的形态特征,利用FM1-43染色技术分析突触末端的功能活性。结果小鼠i PSCs能够在RA的诱导下向神经细胞分化,这些神经细胞可以被成熟神经元与胶质细胞标记物标记,新分化的神经元还可以观察到树突棘及突触连接的形成,在去极化刺激下突触活动增强,表现为轴突末端大量FM1-43阳性内吞颗粒。结论由小鼠i PSCs分化而来的神经细胞在体外形成突触连接的过程,提示其可以进一步分化为功能性的神经元和神经胶质细胞。     

不同鼠龄生后大鼠海马神经干细胞的传代和分化

目的研究不同鼠龄大鼠海马神经干细胞(NSCs)的传代增殖和分化情况。方法将生后SD大鼠分为3d、10d、20d 3组,应用胰酶消化法将海马组织制成单细胞悬液,用含碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、B27的无血清细胞培养技术进行体外培养,单克隆培养后通过Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞、神经元、星形胶质细胞;细胞传3代后,在各组培养基中加入终浓度为10%的血清诱导分化,1周后进行NSE免疫细胞化学染色,计数阳性细胞比例,进行统计学分析。结果3组SD大鼠海马组织细胞,单克隆培养后表达Nestin,诱导分化后分别表达NSE和GFAP。生后3d大鼠神经干细胞在传1-6代时每代均快于生后10d和20d大鼠,传6代后,3组细胞传代时间间隔几近一致;生后3d组大鼠海马神经干细胞分化为神经元的比例较其它2组高(P<0.05)。结论生后3d大鼠神经干细胞增殖速度和分化为神经元的数量都高于10d和20d大鼠。     

鼠巨细胞病毒影响神经干细胞分化及分化基因的表达

目的： 研究鼠巨细胞病毒（MCMV）感染对体外培养神经干细胞（NSCs）分化及分化基因表达的影响,探讨CMV先天感染致脑发育异常的机制。方法: 体外分离培养和鉴定BALB/c胎鼠NSCs,检测细胞分化潜能,用感染复数（MOI）为5、1和0.1 MCMV smith毒株感染NSCs并进行分化培养,倒置显微镜下观察细胞形态学改变,流式细胞术检测分化细胞比率,免疫荧光法观察NSCs及其分化细胞标记物nestin、GFAP和NSE表达的变化,采用MCMV 早期抗原（EA）示踪感染过程（MOI=1）,实时定量RT-PCR检测分化早期NSCs Wnt信号途径关键分化基因Neurog2、Myc及Ccnd1 mRNA水平的动态变化。结果: 体外培养的NSCs呈球样生长,神经干细胞特异性标记nestin表达阳性,并可进一步分化为NF-200阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞;分化培养后,感染组NSCs不能贴壁分化生长并逐渐出现肿胀,细胞nestin表达下调缓慢并显著高于正常对照组,GFAP和NSE表达显著低于正常对照组（P<0.05）,可检测到MCMV EA（早期抗原）的阳性表达;分化培养3-9 d,感染组nestin阳性细胞比率显著高于正常对照组,GFAP和NSE阳性细胞比率显著低于正常对照组（P<0.05）;感染组Neurog2 mRNA水平在分化培养后第1 d明显低于正常对照组（P<0.05),感染组Myc mRNA表达水平在第1-4 d显著低于正常组（P<0.05),感染组Ccnd1 mRNA水平在第0.5-1 d明显低于正常组;感染组和正常组的差异随病毒MOI的增加而更明显。结论: (1)MCMV感染可明显抑制NSCs向神经元和星形胶质细胞方向分化,导致分化细胞比率减少;(2)MCMV可下调或干扰NSCs Wnt信号途径分化基因Neurog2、Myc和Ccnd1的表达;(3)MCMV抑制NSCs分化及其分化基因表达的效应与MOI大小存在一定量效依赖关系;(4)MCMV可能通过抑制NSCs分化基因的表达来抑制其分化,这可能是CMV感染致脑发育异常的重要机制之一。     

无血清培养新生Wistar大鼠神经干细胞及免疫荧光鉴定

目的在无血清条件下,分离培养新生1d的Wistar大鼠神经干细胞,观察其生长及分化情况,并对其生物学特性进行鉴定。方法取新生1d的大鼠海马组织,机械分离法分离神经干细胞,加入含有表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、B27的DMEM/F12无血清培养基中培养、增殖。倒置显微镜下观察神经干细胞的增殖分化情况,采用免疫荧光染色鉴定其生物特性。结果从新生大鼠海马组织分离培养的神经干细胞在无血清培养基中不断增殖,免疫荧光染色显示巢蛋白呈阳性表达。诱导分化后,免疫荧光染色可见高分子量神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白和髓鞘碱性蛋白阳性表达细胞。结论无血清条件分离培养的神经干细胞具有自我更新和增殖能力,能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。     

联合应用EGF和NGF对成年大鼠海马神经干细胞分化的影响

目的探讨联合应用表皮生长因子(EGF)和神经生长因子(NGF)对成年大鼠海马神经干细胞(NSCs)分化的影响。方法用含碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子、B27的无血清细胞培养技术体外培养成年大鼠海马神经干细胞,单克隆培养细胞行Nestin免疫细胞化学染色,诱导分化1w后细胞行GFAP和NSE免疫细胞化学染色;根据培养基中所加营养因子的不同将第4代细胞分为4组培养:EGF组、EGF+NGF组、NGF组、对照组,此4组细胞培养1w后行NSE免疫细胞化学染色,计数阳性细胞比例后进行统计学分析。结果单克隆培养后克隆球表达Nestin,诱导分化1w后细胞表达NSE、GFAP。与空白对照组相比,EGF组、NGF组和EGF+NGF组细胞分化为神经元的比例较高(P<0.05),其中EGF+NGF组细胞的比例最高。结论单独或联合应用EGF、NGF可以促进成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化。     

人胚脑神经干细胞的分离培养、克隆和分化

探讨从人胚脑分离培养的神经干细胞在增殖和分化方面的生物学特点。用无血清培养技术从 4月龄人胎中脑组织中分离培养出神经干细胞 ,用有限稀释法获得单细胞克隆球 ,消化后用含 Brd U的培养液培养 ,待形成神经干细胞球后 ,进行 Brd U和nestin免疫荧光检测。取第 4代神经干细胞球用含 10 % FBS的培养液诱导分化 ,3周后分别进行神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞特异性标记物 MAP-2、GFAP和 CNP免疫荧光检测。结果显示 ,单细胞悬液培养 2周后可形成神经干细胞球 ;神经球 Br-d U和 nestin免疫荧光检测均呈阳性 ;神经干细胞分化后呈 MAP-2、GFAP和 CNP阳性的三种类型细胞 ,但分化的神经元数量较少、胞体较小、突起较少。提示从人胚中脑组织中分离得到的神经干细胞具有增殖和自我更新能力 ,并具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的多分化潜能 ;与啮齿类动物相比 ,人神经干细胞增殖速度较慢 ,分化的神经元较少且稍欠成熟     

Neural stem cells directly differentiated from partially reprogrammed fibroblasts rapidly acquire gliogenic competency

Neural stem cells (NSCs) were directly induced from mouse fibroblasts using four reprogramming factors (Oct4, Sox2, Klf4, and cMyc) without the clonal isolation of induced pluripotent stem cells (iPSCs). These NSCs gave rise to both neurons and glial cells even at early passages, while early NSCs derived from clonal embryonic stem cells (ESCs)/iPSCs differentiated mainly into neurons. Epidermal growth factor-dependent neurosphere cultivation efficiently propagated these gliogenic NSCs and eliminated residual pluripotent cells that could form teratomas in vivo. We concluded that these directly induced NSCs were derived from partially reprogrammed cells, because dissociated ESCs/iPSCs did not form neurospheres in this culture condition. These NSCs differentiated into both neurons and glial cells in vivo after being transplanted intracranially into mouse striatum. NSCs could also be directly induced from adult human fibroblasts. The direct differentiation of partially reprogrammed cells may be useful for rapidly preparing NSCs with a strongly reduced propensity for tumorigenesis.     

Retinoic acid induced the differentiation of neural stem cells from embryonic spinal cord into functional neurons in vitro

Retinoic acid is an important molecular taking part in the development and homeostasis of nervous system. Neural stem cells (NSCs) are pluripotent cells that can differentiate into three main neural cells including neuron, astrocyte and oligodendrocyte. However, whether retinoic acid can induce NSCs derived from embryonic spinal cord differentiating into functional neurons and its efficiency are not clear. In this experiment, NSCs were isolated from embryonic 14 d spinal cord of rats. The growth and neuronal differentiation of NSCs induced by 500 nM RA was examined in vitro. It was indicated that compared with the control group, there were more differentiated cells with longer cytodendrites in the medium treated with RA at different time. And more, there were more neuronal marker positive cells in 500 nM RA group than the control group seven days after differentiation. At the same time, the expression of β-tublin III protein in RA group was higher than those in control group, which was contrary to the expression of astrocyte marker GFAP protein at seven days after differentiation. However the differentiated neurons, whether treated with RA or not both exhibited biological electrical reactivity after stimulated by glutamine. Therefore, these findings indicated that RA could promote growth of cellular dendrites and neuronal differentiation of NSCs, which also induce functional maturation of differentiated neurons finally.