DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂研究进展

DNA拓扑异构酶Ⅰ(TopoⅠ)参与DNA复制、转录、重组、修复等所有关键的细胞核内过程,已成为极其重要的抗癌药物研究新靶点.目前,美国国立癌症研究所药物机制分析电脑网络系统已将TopoⅠ抑制剂列为重点研究的六大类抗肿瘤药物之一.近年来,Topo Ⅰ抑制剂研究出现了新的高潮,已有数个喜树碱类化合物进入临床研究,还发现了一些结构新颖、活性较好的非喜树碱类TopoⅠ抑制剂.本文简单介绍TopoⅠ的拓扑结构与活性位点,重点了各类Topo Ⅰ抑制剂研究的最新进展.     

CXCR4启动子的克隆及在MCF-7乳腺癌细胞中的特异转录活性

目的 证实CXCR4启动子在乳腺癌细胞MCF-7中的特异转录活性.方法 采用PCR方法 扩增CXCR4启动子序列.将其分别克隆到含有报告基因增强绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒载体pEGFP-1和含有Luciffrase的质粒载体pGL3-Basic,经脂质体分别转染人正常乳腺上皮细胞系HBL-100和乳腺癌细胞MCF-7,荧光显微镜下观察EGFP的表达情况,同时测定两种细胞中荧光素酶表达的差异.结果 CXCR4基因的启动子在肿瘤细胞中呈现高的转录活性;而在正常细胞中转录活性极低.结论 CXCR4启动子在乳腺癌MCF-7细胞中具有很强的特异性,为进一步开发肿瘤的特异性基因治疗奠定了实验基础.     

拓扑异构酶及其抑制剂研究进展

真核细胞DNA的拓扑结构由两类关键酶拓扑异构酶(topoisomerase)TOPOⅠ及TOPOⅡ调节，这两类酶在DNA复制、转录、重组，以及在形成正确的染色体结构、染色体分离和浓缩中发挥重要作用。     

CYP3A4基因启动子受AFB1调控位点的鉴定

目的 构建不同长度人CYP3A4基因启动子荧光素酶报告质粒并予鉴定,检测L02细胞中各荧光素酶报告质粒相对荧光素酶活性,并分析AFB1处理对其影响,找出AFB1调控人CYP3A4基因可能的启动子区域.方法 采用PCR技术扩增不同长度人CYP3A4基因启动子片段,将其插入荧光素酶报告质粒pGL3-basic中荧光素酶编码序列之前,构建含不同长度CYP3A4启动子的报告质粒pGL3-basic-CYP3A4-1～7,将报告质粒转染L02细胞,检测其荧光素酶活性来表示CYP3A4对应启动子片段的转录活性.检测各报告质粒在AFB1处理下与DMSO对照相比荧光素酶活性上升的比例,找出AFB1上调CYP3A4启动子转录活性的作用区域.结果 报告质粒测序结果证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功.将报告质粒转染L02细胞,AFB1和DMSO处理后检测结果表明pGL3-basic-CYP3A4-1～6和pGL3-basic-CYP3A4-7相对荧光素酶活性受AFB1上升比率差异有统计学意义(P＜0.05),pGL3-basic-CYP3A4-1至pGL3-basic-CYP3A4-6这6个报告质粒相对荧光素酶活性受AFB1上升比率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 成功构建了人CYP3A4基因不同长度启动子片段的荧光素酶报告质粒,并初步确定AFB1可以通过调控CYP3A4启动子-200～0 nt的结合位点来上调CYP3A4的转录活性.     

DNA拓扑异构酶在卵巢癌细胞拓扑替康耐药中的作用

目的 探讨DNA拓扑异构酶(Topoisomerase,Topo)在卵巢癌拓扑替康(TPT)耐药细胞A2780/TPT中的作用.方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测该细胞株对TPT、米托蒽醌(MX)、喜树碱(CPT)、阿霉素(ADM)、鬼臼乙叉甙(VP-16)、顺铂(cDDP)的耐药指数.Western blot法检测Topo Ⅰ及TopoⅡ的蛋白含量,超螺旋DNA松解法检测Topo Ⅰ的酶活性.结果 A2780/TPT细胞对Topo Ⅰ抑制剂TPT及CPT的耐药指数分别为25.1及3.1,对MX的耐药指数为19.0,对cDDP及Topo Ⅱ抑制剂ADM、VP-16仍保持敏感.耐药株的Topo Ⅰ含量约为亲本细胞的40%,且Topo Ⅰ活性下降(P<0.05),而TopoⅡ含量约为亲本细胞的2.2倍(P<0.05).结论 Topo Ⅰ含量的下降及TopoⅡ含量的增加是卵巢癌TPT耐药细胞对Topo Ⅰ抑制剂及Topo Ⅱ抑制剂产生不同药敏情况的原因.     

热休克因子1对FasL的调控作用

目的研究人热休克因子1(HSF1)对Fas配体(FasL)启动子转录活性的影响。方法用在线启动子分析软件分析FasL启动子区转录因子结合位点;凝胶阻滞实验(EMSA)研究内源性HSF1与FasL启动子区的热休克元件(HSE)结合能力;将组成型活化的HSF1突变体与FasL启动子表达载体FasL-luc共同转染HeLa细胞,采用双荧光素酶报告基因检测系统,检测荧光索酶活性。结果在FasL启动子区发现HSE核心序列(nGAAnnTTCn),HSF1可以与该HSE体外结合;荧光素酶活性测定发现HSF1明显上调FasL-luc转录活性,突变该HSE,则转录激活作用消失。结论 HSF1对FasL具有转录调控作用。     

GAL4/VP16融合人工转录因子的活性研究

目的 构建含有融合转录因子GAL4/VP16的表达载体和含有上游激活序列(UAS)启动子驱动报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达载体组成的GAL4/VP16-UAS系统,观察融合转录因子GAL4/VP16的活性.方法 构建含有融合转录因子GAL4/VP16的表达载体pcDNA3-GAL4/VP16,含有5个拷贝UAS串联排列序列和腺病毒E1b基因核心启动子的人工杂合启动子驱动报告基因EGFP的表达载体pGL3-G5E1b-TATA-EGFP,利用脂质体将两种载体瞬时转染Hep3B和HEK293细胞,48 h后采用RT-PCR和流式细胞术检测EGFP的表达,观察GAL4/VP16融合转录因子对G5E1B-TATA的转录调节作用.结果 在GAL4/VP16融合转录因子存在的情况下,G5E1b-TATA启动子活性明显上调,甚至可以达到巨细胞病毒(CMV)启动子的活性程度.结论 GAL4/VP16融合转录因子具有上调G5E1B-TATA启动子转录活性的作用,并且该转录活性足以达到驱动下游目的基因高效表达的水平,在基因治疗和基因功能的研究中具有一定的应用潜力.     

基于报告基因系统的肝细胞核因子4α活性检测体系的建立

目的 建立一个基于荧光素酶报告基因系统的肝细胞核因子4α(HNF4α)活性检测系统,筛选可调控HNF4α活性的小分子化合物.方法 采用亲和层析法纯化HNF4α蛋白,行蛋白热迁移实验检测相关DNA片段及小分子化合物与HNF4α蛋白的直接相互作用.分别构建含有3个拷贝和9个拷贝的Ninjurin 1(NINJ1)基因启动子区HNF4α反应元件的荧光素酶报告基因质粒pGL3-NINJ1-3p和pGL3-NINJ1-9p,转染肝癌细胞,采用荧光素酶报告基因法检测肝癌细胞内HNF4α转录活性的改变,qPCR检测小分子化合物木犀草素或阿尔维林处理后肝癌细胞中HNF4α及下游基因的表达情况,荧光素酶报告基因法检测小分子化合物处理后细胞内HNF4α转录活性的改变.结果 蛋白热迁移实验证实,NINJ1基因启动子区HNF4α的DNA结合片段可与HNF4α蛋白结合.在过表达HNF4α的肝癌细胞中,pGL3-NINJ1-3p和pGL3-NINJ1-9p均可检测到肝癌细胞中HNF4α活性的改变,且pGL3-NINJ1-9p较pGL3-NINJ1-3p的检测灵敏度更高(P＜0.01).木犀草素和阿尔维林与HNF4α蛋白存在直接相互作用,分别下调和上调HNF4α靶基因;pGL3-NINJ1-9p可检测到木犀草素和阿尔维林对HNF4α转录活性的影响.结论 利用报告基因载体pGL3-NINJ1-9p成功建立了HNF4α活性的检测系统,为筛选调控HNF4α活性的小分子化合物等提供了基础工具.     

E2F4对CDK2和CyclinA在肝癌细胞系中的转录调控特异性研究

目的研究E2F4对细胞周期素依赖性激酶2(CDK2)和细胞周期素A(CyclinA)在肝癌细胞系中的转录调控活性。方法扩增并克隆不同片段长度的CDK2和CyclinA启动子序列,E2F4表达质粒序列,转染肝癌细胞系(HepG2、QGY1007),双荧光报告系统检测荧光素酶表达活性,实时定量反转录-聚合酶链反应检测肝癌细胞系中CDK2和CyclinA mRNA的表达水平。结果双荧光报告系统、实时定量反转录-聚合酶链反应显示,在肝癌细胞系中转染E2F4表达质粒组CDK2和CyclinA启动子活性明显低于未转染E2F4表达质粒组,CDK2和CyclinA mRNA的表达水平降低。结论E2F4在肝癌细胞系中可以抑制CDK2和CyclinA的转录活性。     

AP-1在转录水平调控氧化低密度脂蛋白诱导的转化生长因子-β_1表达(摘要)

目的 了解转录激活蛋白-1(AP-1)是否参与调控氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱导转化生长因子-β_1(TGF-β_1)基因的表达,探讨Ox-LDL激活AP-1可能的信号转导途径。方法 首先利用SD大鼠TGF-β_1启动子缺失体-荧光素酶(luciferase)报告基因瞬时转染系细胞并检测虫荧光素酶相对活性,找出可能的应答区域;然后对AP-1结合位点进行突变并加入c-Jun/AP-1抑制剂,比较启动子活性的变化情况。利用Western印迹检测Ox-LDL对系膜细胞p38有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)总蛋白和磷酸化水平的影响。最后,用凝胶阻滞法(EMSA)观察在特异性蛋白激酶抑制剂处理下的AP-1活性的变化。结果对Ox-LDL刺激应答,TGF-β_1启动子-1550到-845之间是一个正调控区域,-629到-422之间则是一个负调控区。AP-1结合位点突变和c-Jun/AP-1抑制剂均导致TGF-β_1启动子活性显著降低。在Ox-LDL刺激下p38mPAK表现出的不是     

鉴定AP-4是在非激素依赖型前列腺癌中上调L-plastin表达的转录因子

【目的】鉴定AP-4是在非激素依赖型前列腺癌中调控L-plastin表达的转录因子，进一步阐明非激素依赖型前列腺癌的发病机制。【方法】在鉴定L-plastin启动子近3’端-216到1序列片段存在明显的转录活性的基础上，利用TFSEARCH软件分析该片段的序列，寻找可能调控L-plastin表达的非甾体激素类转录因子，并用凝胶滞后实验和超滞后实验证实结合于该片段的转录因子，利用PCR定点突变法构建删除该转录因子结合位点的重组子，并检测切除该片段序列后荧光素酶活性，研究该转录因子在非激素依赖型前列腺癌中调控L-plastin表达的作用。【结果】TFSEARCH软件分析表明在距转录起始点-199-194bp处含有AP-4转录因子结合位点CAGCTG，凝胶滞后实验和超滞后实验表明AP-4是结合于L-plastin启动子3’端序列CAGCTG的转录因子，删除AP-4结合位点后荧光素酶活性下降。【结论】AP-4是促进L-plastin在非激素依赖型前列腺癌中表达的重要调控因子。     

ANGPTL4 基因调控黑色素瘤细胞醛缩酶 A 表达水平的机制

目的：探讨黑色素瘤细胞血管生成素样蛋白4(angiopoietin-like 4，ANGPTL4)对醛缩酶A(aldolase A， ALDOA)表达水平的影响及其机制。方法：分别扩增和沉默黑色素瘤细胞系WM-115及WM-266-4 ANGPTL4基因，运 用PKC激动剂及阻断剂处理转染细胞。检测ALDOA在人黑色素瘤细胞中mRNA及蛋白质水平的表达，荧光素酶测定 ALDOA基因启动子活性。结果：ANGPTL4基因扩增的黑色素瘤细胞组，ALDOA在mRNA及蛋白质的水平的表达均 增高，ALDOA基因的启动子活性增加，且可被PKC阻断剂抑制(P<0.05)。而在ANGPTL4基因沉默细胞组中ALDOA 在mRNA及蛋白质水平的表达均减低，ALDOA基因的启动子活性降低，且可被PKC激动剂恢复(P<0.05)。结论： ANGPTL4基因可通过PKC依赖途径从ALDOA基因转录及翻译水平上调人黑色素瘤细胞中ALDOA的表达。     

HMGB2启动子报告基因载体的构建、活性验证及与其结合的转录因子的预测

目的: 构建高迁移率族蛋白B2(high mobility group box2,HMGB2)启动子荧光素酶报告基因载体,并对其进行活性验证,预测可能与HMGB2启动子结合的转录因子。方法: 在NCBI Genbank数据库中查询HMGB2基因启动子区域序列,运用PCR扩增HMGB2启动子序列片段,将其克隆至pGL3-Basic载体中,构建重组质粒pGL3-HMGB2-promoter,并通过双酶切和测定核酸序列鉴定。采用虫荧光素酶报告实验验证pGL3-HMGB2-promoter重组质粒的活性,进一步通过在线软件PROMO预测可以与HMGB2启动子序列结合的转录因子。结果： 经限制性内切酶酶切鉴定和核酸序列比对,证实pGL3-HMGB2-promoter重组质粒构建成功。虫荧光素酶报告实验结果显示,构建的重组质粒具有启动子活性。PROMO在线软件分析结果表明,有72个转录因子可能与HMGB2启动子序列结合。 结论： 成功构建了含有HMGB2启动子序列的荧光素酶报告基因重组质粒,该质粒具有启动子活性,且有72个转录因子可能与HMGB2启动子序列结合,促进HMGB2的转录。     

人EFTUD2启动子的鉴定及初步分析

目的：鉴定并分析EFTUD2（elongation factor Tu GTP?binding domain?containing 2）基因的启动子区域。方法：应用生物信息学技术对EFTUD2基因结构及潜在启动子区域进行分析,预测4个EFTUD2启动子序列。使用全基因合成技术以及高保真PCR扩增得到目的启动子序列,通过BglⅡ和NheⅠ双酶切,将目的条带克隆到双荧光素酶报告基因载体psiCHECK?2中,得到4个长度不同并覆盖EFTUD2基因转录起始位点附近约2 kb的EFTUD2基因启动子双荧光素酶报告基因重组体。荧光素酶分析检测启动子活性。结果：经酶切、测序鉴定,成功构建了人EFTUD2启动子荧光素酶报告基因重组质粒。通过荧光素酶活性检测,重组体EFTUD2?0.5的相对荧光素酶活性增加（P < 0.05）,提示EFTUD2基因核心启动子序列位于转录起始位点附近约500 bp的区域内。结论：EFTUD2基因转录起始位点上游500 bp具有启动子活性,初步判定其核心启动子位于该区域。     

鉴定AP-4是在非激素依赖型前列腺癌中上调L-plastin表达的转录因子

 【目的】鉴定AP-4是在非激素依赖型前列腺癌中调控L-plastin表达的转录因子，进一步阐明非激素依赖型前列腺癌的发病机制。【方法】在鉴定L-plastin启动子近3’端-216到1序列片段存在明显的转录活性的基础上，利用TFSEARCH软件分析该片段的序列，寻找可能调控L-plastin表达的非甾体激素类转录因子，并用凝胶滞后实验和超滞后实验证实结合于该片段的转录因子，利用PCR定点突变法构建删除该转录因子结合位点的重组子，并检测切除该片段序列后荧光素酶活性，研究该转录因子在非激素依赖型前列腺癌中调控L-plastin表达的作用。【结果】TFSEARCH软件分析表明在距转录起始点-199-194bp处含有AP-4转录因子结合位点CAGCTG，凝胶滞后实验和超滞后实验表明AP-4是结合于L-plastin启动子3’端序列CAGCTG的转录因子，删除AP-4结合位点后荧光素酶活性下降。【结论】AP-4是促进L-plastin在非激素依赖型前列腺癌中表达的重要调控因子。     

同型半胱氨酸对FABP 4 启动子活性的影响

目的 通过克隆脂肪酸结合蛋白4（FABP4）基因启动子,确定其活性核心区和功能片段,分析 心血管疾病独立危险因子同型半胱氨酸（Hcy）对FABP 4 启动子活性的影响。方法 应用生物信息学预测 FABP 4 基因启动子区顺式转录作用元件和反式作用因子,以pGL3-Basic 为载体,采用基因重组法构建启动子 截取片段,转染HEK-293A 细胞,观察不同截取片段的荧光素酶活性变化,确定活性最强的片段。进一步将 核心启动子片段（-2000/-1）转染巨噬细胞,观察不同浓度Hcy 和DNA 甲基化抑制剂5- 氮杂胞苷（AZC） 对FABP 4 基因启动子活性的影响。结果 不同长度截取片段转染HEK-293A 细胞后检测荧光素酶活性结果 显示,与pGL3 对照组比较,-2000/-1 片段转录活性最强。将核心启动子片段（-2000/-1）转染巨噬细胞并 用不同浓度Hcy 干预后,与0μmol/L Hcy 组比较,100 和200μmol/L Hcy 组启动活性升高;与100μmol/L Hcy 组比较,在100μmol/L Hcy 基础上用AZC 干预后,FABP 4 基因启动活性升高（P <0.05）。结论 成功克 隆FABP 4 启动子的4 个片段,且确定FABP 4 基因核心启动子位于-2000/-1 片段;Hcy 可以促进FABP 4 基 因核心启动子片段活性,补充AZC 后可以进一步促进Hcy 引起的FABP 4 启动子活性升高。     

AP-1在转录水平调控氧化低密度脂蛋白诱导的转化生长因子-β1表达(摘要)

目的 了解转录激活蛋白-1(AP-1)是否参与调控氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱导转化生长因子-β1(TGF-β1)基因的表达，探讨Ox-LDL激活AP-1可能的信号转导途径。方法 首先利用SD大鼠TGF-β1启动子缺失体-荧光素酶(1uciferase)报告基因瞬时转染系细胞并检测虫荧光素酶相对活性，找出可能的应答区域；然后对AP-1结合位点进行突变并加入c-Jun／AP-1抑制剂，比较启动子活性的变化情况。利用Western印迹检测Ox-LDL对系膜细胞p38有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)总蛋白和磷酸化水平的影响。最后，用凝胶阻滞法(EMSA)观察在特异性蛋白激酶抑制剂处理下的AP-1活性的变化。结果对Ox-LDL刺激应答，TGF-β1启动子-1550到-845之间是一个正调控区域，-629到-422之间则是一个负调控区。AP-1结合位点突变和c-Jun／AP-1抑制剂均导致TGF-β1启动子活性显著降低。在Ox-LDL刺激下p38 mPAK表现出的不是量的变化，而是其磷酸化水平的增加。PKC抑制剂明显地抑制了Ox-LDL诱导的AP-1活性；与之相反，p38 MPAK抑制剂则对AP-1活性无显著影响。结论 在大鼠肾系膜细胞，AP-1在转录水平参与调控Ox-LDL诱导TGF-β1表达的过程，且Ox-LDL可能部分是通过PKC信号转导途径激活AP-1中的c-Jun蛋白，再由c-Jun／AP-1从转录水平上调TGF-β1的表达。