密度梯度离心法分离脐血干细胞：分离介质的筛选

背景：应用脐血分离干细胞的目的是获得以干细胞为主要群体的单个核细胞群,密度梯度离心法是最简单有效的方法之一。密度梯度离心法使用的分离介质以聚蔗糖泛影葡胺最为常用,但哪种浓度获得干细胞最多,目前尚未深入研究。目的：探讨密度梯度离心法分离人脐血干细胞分离介质的最佳浓度,建立临床级干细胞分离应用方案。方法：采用两步法分离脐血流程,先用羟乙基淀粉沉淀脐血红细胞,再使用质量浓度分别为（1．073O±0．0001）,（1．0750±0．0001）,（1．077O±0．0001）g／mL的分离液,分离沉淀脐血红细胞后的上清液,得到单个核细胞,分别计数细胞获得率及细胞存活率。采用流式细胞仪测定单个核细胞表面标志物,将各亚组分绘制成直方图或散点图,分析所得脐血单个核细胞中所含单个核细胞亚组分的比例和绝对数量。结果与结论：应用质量浓度（1．0730＋0．0001）g／mL的分离液可得到最大比例间充质干细胞群,是分离间充质干细胞的最佳质量浓度。使用质量浓度（1．0750±0．0001）g／mL的分离液可得到较高比例的造血干细胞群,是分离造血干细胞的最佳质量浓度。使用质量浓度（1．0770±0．0001）g／mL的分离液得到细胞总数最高,但获得的间充质干细胞、造血干细胞比例最低。采用两步法分离干细胞流程,建立严格的实验室条件和标准,可获得密度梯度离心法分离人脐血干细胞的最佳分离方案。     

脐血混合培养纯化人间充质干细胞及生物学特性研究

目的探讨体外分离、混合培养纯化人脐血间充质干细胞的适宜体系,观察该人脐血间充质干细胞生物学特性。方法收集孕足月新生儿脐血,每3份脐血[(70—100)ml/份]混合;采用1.077 g/ml的淋巴细胞分离液(Ficoll)以1 500 r/min密度梯度离心法分离脐血中的单个核细胞,在Mesencult培养基中贴壁培养筛选人脐血间充质干细胞,显微镜下观察细胞生长形态变化,细胞计数并绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞抗原表达,分析细胞周期;体外诱导脐血间充质干细胞成脂、成骨分化。结果密度梯度离心法所获得的单个核细胞,在培养基中培养约3—5 h开始出现贴壁生长,24 h后贴壁细胞增多,呈明显纺锤状,10 d后开始出现细胞克隆,3周后呈漩涡状生长。原代培养时间为15 d,P1代倍增时间为26 h。流式细胞仪鉴定:贴壁生长的细胞表达CD29、CD44和CD105,不表达CD34、CD45。分化潜能鉴定体外培养细胞可以成脂、成骨分化。结论所贴壁培养出的细胞的生长形态、流式表形、分化潜能具有人脐血间充质干细胞生物学特征,混合培养可以提高间充质干细胞培养成功率,实验中采用的培养体系适宜人脐血间充质干细胞的分离培养。     

离心管贴壁细胞对人脐血单个核细胞体外培养成功率的影响

背景:在常规的脐血间充质干细胞密度梯度离心分离过程中,离心管壁有大量单个核贴壁细胞,这些早期的贴壁细胞是否与脐血间充质干细胞的体外培养成功率低存在一定的联系呢?目的:比较4种方法分离人脐血单个核细胞的体外培养成功率,观察离心管贴壁细胞对人脐血单个核细胞体外培养成功率的影响。方法:取足月健康顺产新生儿脐血36份,随机分为4组,每组9份,于采集后6h内分别采用甲基纤维素沉降法(A组)、密度梯度离心分离法(B组)、甲基纤维素联合密度梯度离心分离法(C组)、甲基纤维素联合改良密度梯度离心分离法(D组)分离出单个核细胞,锥虫蓝染色检测细胞活力,用细胞计数板进行细胞计数,调整细胞浓度为1×109L-1～2×109L-1,接种于含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中培养和传代,相差显微镜下观察脐血单个核细胞的形态。收集第3代脐血单个核细胞,采用细胞计数板进行计数,计算扩增倍数,采用流式细胞仪鉴定细胞免疫表型。结果与结论:36份脐血中,成功分离33份脐血单个核细胞,B组有3份分离失败。33份中共22份原代培养中出现大量贴壁细胞,其中A组8份,B组2份,C组5份,D组7份。9份(27%)培养出能融合且可稳定传代的成纤维样细胞,其中A组3份,B组0份,C组1份,D组5份。4组脐血单个核细胞在原代培养5～7d后均可见数量不等的贴壁细胞,呈梭形成纤维样细胞或(和)圆形巨核样细胞。A组与D组于原代培养三四周可见成纤维样细胞集落形成,细胞形态与骨髓间充质干细胞相似,呈较均一的长梭形,可稳定培养至60～90d形态无明显变化。流式细胞仪免疫检测,第3代脐血单个核细胞不表达或弱表达CD34、CD45和CD106等造血干细胞和内皮细胞标志,但显著表达CD29、CD105等间充质干细胞表面标志。结果显示离心管贴壁细胞可显著提高脐血单个核细胞的体外培养成功率,而甲基纤维素联合改良的密度梯度离心分离法,可充分回收离心管贴壁细胞,利于脐血单个核细胞的体外扩增和稳定传代。     

离心管贴壁细胞对人脐血单个核细胞体外培养成功率的影响

背景：在常规的脐血间充质干细胞密度梯度离心分离过程中,离心管壁有大量单个核贴壁细胞,这些早期的贴壁细胞是否与脐血间充质干细胞的体外培养成功率低存在一定的联系呢？目的：比较4种方法分离人脐血单个核细胞的体外培养成功率,观察离心管贴壁细胞对人脐血单个核细胞体外培养成功率的影响。方法：取足月健康顺产新生儿脐血36份,随机分为4组,每组9份,于采集后6h内分别采用甲基纤维素沉降法（A组）、密度梯度离心分离法（B组）、甲基纤维素联合密度梯度离心分离法（C组）、甲基纤维素联合改良密度梯度离心分离法（D组）分离出单个核细胞,锥虫蓝染色检测细胞活力,用细胞计数板进行细胞计数,调整细胞浓度为1×109L-1～2×109L-1,接种于含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中培养和传代,相差显微镜下观察脐血单个核细胞的形态。收集第3代脐血单个核细胞,采用细胞计数板进行计数,计算扩增倍数,采用流式细胞仪鉴定细胞免疫表型。结果与结论：36份脐血中,成功分离33份脐血单个核细胞,B组有3份分离失败。33份中共22份原代培养中出现大量贴壁细胞,其中A组8份,B组2份,C组5份,D组7份。9份（27%）培养出能融合且可稳定传代的成纤维样细胞,其中A组3份,B组0份,C组1份,D组5份。4组脐血单个核细胞在原代培养5～7d后均可见数量不等的贴壁细胞,呈梭形成纤维样细胞或（和）圆形巨核样细胞。A组与D组于原代培养三四周可见成纤维样细胞集落形成,细胞形态与骨髓间充质干细胞相似,呈较均一的长梭形,可稳定培养至60～90d形态无明显变化。流式细胞仪免疫检测,第3代脐血单个核细胞不表达或弱表达CD34、CD45和CD106等造血干细胞和内皮细胞标志,但显著表达CD29、CD105等间充质干细胞表面标志。结果显示离心管贴壁细胞可显著提高脐血单个核细胞的体外培养成功率,而甲基纤维素联合改良的密度梯度离心分离法,可充分回收离心管贴壁细胞,利于脐血单个核细胞的体外扩增和稳定传代。     

脐血单个核细胞成功培养的相关影响因素

目的:脐血来源丰富且免疫原性低,移植后排斥反应低的特性决定其具有临床应用的可行性。实验拟验证脐血单个核细胞数量与孕妇年龄条件、脐血量及制备因素的相关性,并证实其在体外培养的最佳条件。方法:实验于2006-03/2007-01在辽宁省血液中心输血医学研究所细胞研究中心完成。①实验材料:300份脐血均来源于足月分娩的健康孕妇,全部签署知情同意书。孕妇年龄20～35岁,其中≤25岁36例,>25岁264例;脐血采集量15～130mL,其中<33mL18例,≥33mL282例;采集到制备时间差为2～24h,其中>12h30例,≤12h270例。红细胞裂解液由本实验室自制,主要成分为高渗盐水和三蒸水。②实验方法:人脐血用枸橼酸钠抗凝,采用密度梯度离心法分离得到脐血单个核细胞,锥虫蓝染色结果表明活细胞比率达95%～100%。将脐血单个核细胞分别按1×106,5×106,1×107的密度接种,以未加细胞因子作为对照组,在无血清DMEM/F12培养液中加入20μg/L神经生长因子和2%神经营养因子B27作为扩增诱导组,于培养后的1,3,7d进行换液,培养周期选择5d、7～10d和15d。③实验评估:分别对脐血单个核细胞数与孕妇年龄、脐血采集量、采集到制备时间差的相关性进行分析。倒置荧光显微镜下观察细胞形态、细胞因子作用及最佳的种植密度、首次换液时间、培养周期。观察使用红细胞裂解液后对脐血单个核细胞增殖和分化的影响。结果:①脐血细胞的生长及形态特征:脐血单个核细胞刚接种时为散在的圆形细胞,2d贴壁,为散在的单个或数个细胞,呈长梭形,形态均一。3d左右细胞突起增加,细胞数量增多。随着培养时间的延长,可见多个细胞之间形成网络,诱导后出现神经样细胞形态。②脐血单个核细胞数的影响因素:脐血单个核细胞数与孕妇年龄不相关(r<0.3),与脐血量、采集到制备时间差均具有相关性(r>0.8)。③脐血单个核细胞培养影响因素:种植密度为5×106L-1、首次换液时间在3d左右、培养周期为7～10d的细胞生长状态较好。扩增诱导组脐血单个核细胞增殖和分化状态好于对照组。④红细胞对脐血单个核细胞生长分化的影响:红细胞裂解的最佳时间为45～50s,并发现红细胞对脐血单个核细胞的生长有一定程度影响,且破骨细胞较多。红细胞裂解后的脐血单个核细胞增殖分化较好,细胞形态较为均一。结论:①采集量为33mL、且采集到制备的时间差为12h的脐血制备单个核细胞数量超过1×108的成功例数较高。②5×106L-1接种密度、首次换液时间为3d、培养周期7～10d的脐血单个核细胞生长状态较好,神经细胞生长因子可促进其增殖分化。③红细胞裂解后脐血单个核细胞增殖分化更好,破骨细胞较少。     

人脐血间质干细胞向神经元样细胞分化的诱导因素

背景:研究证明脐血间质干细胞可向神经元样细胞分化,要同时保证脐血间质干细胞的扩增能力与分化潜能.其培养和诱导分化条件的优化显得尤为重要.目的:分析筛选人脐血间质干细胞向神经元样细胞体外诱导分化过程的影响因素.设计、时间及地点:随机对照实验,于2006-08/2007-05在河南省红十字血液中心血液成分应用研究所完成.材料:脐血来自郑州市妇幼保健院正常足月分娩的胎儿,平均采血量95mL.重组人表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子购自Sigma公司:分离细胞所用的四联袋为山东威高集团公司产品.方法:取采集6h内的脐血,采用四联袋密度梯度离心法分离脐血单个核细胞,以5×109L-1接种于DMEM/F12培养基中.[1]细胞因子实验:单独细胞因子组加入20μg/L B27、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子:细胞因子联合组在此基础上加入5μg/L重组人表皮生长因子.[2]红细胞混入量实验:裂解组加入红细胞裂解液1mL,裂解后红细胞混入量为(0.44 ±0.13)×108/份:少红细胞组红细胞混入量为(0.51±0.21)×108/份,多红细胞组红细胞混入量为(2.65±1.28)×108/份.[3]首次换液时间实验:分别于接种后48h、7d首次换液.[4]诱导分化:将碱性成纤维细胞生长因子、重组人表皮生长因子共诱导7d的细胞爬片进行巢蛋白免疫组织化学染色.主要观察指标:观察不同因素对脐血间质干细胞增殖分化的影响.检测诱导分化后神经干细胞巢蛋白的表达.结果:培养7d后,表皮生长因子与碱性成纤维细胞生长因子联合诱导促细胞增殖的效果优于单独应用碱性成纤维细胞生长因子(t=2.880,P<0.05);红细胞裂解液组、多红细胞组贴壁细胞数明显低于少红细胞组(t=7.332～7.550,P<0.05),即混入的红细胞总量不大于108/份对细胞增殖无影响:接种后7d首次换液所获贴壁细胞数明显多于接种后48h首次换液(P<0.05).两种细胞因子共诱导后,神经干细胞巢蛋白呈阳性表达.结论:在脐血间质干细胞向神经元样细胞诱导分化过程中,细胞因子、红细胞混入量及首次换液时间都是重要的影响因素.     

FKN影响动脉粥样硬化信号传导机制的研究及NF-κB在其中的作用

目的通过研究FKN对单个核细胞合成NF-κB、TNF-α的影响，探索了FKN-CX3CR1可能存在的一条信号传导机制，并探讨了核因子．加在其中的作用。方法（1）抗凝血用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞。（2）将每份提取的单个核细胞分3组分别为：空白对照组、FKN组,PDTC组。（3）应用免疫组化检测各组单个核细胞中NF-KB表达情况．（4）应用酶联免疫法检测各组培养液中TNF-α的表达水平。结果（1）FKN诱导组较空白组NF-κB、TNF-α表达明显增多。（2）NF-κB阻断剂PDTC组较FKN组TNF-α表达明显减少。结论（1）FKN—CX3CR1有促进动脉粥样硬化形成的作用，其机制之一可能是通过增加单个核细胞表达NF-κB、TNF-α而实现的。（2）FKN可能通过激活NF-κB，进而促进TNF-α的表达。     

外周血单个核细胞分离方法探讨

目的 探讨外周血单个核细胞(PBMC)的不同分离方法对分离效果、贴壁能力以及淋巴细胞的增殖活性的影响。方法 取肝素抗凝血，分别用羟乙基淀粉(hydrixyethylstarch，HES)自然沉降法、HES离心沉淀法、Ficoll密度梯度离心法三种方法分离单个核细胞，直接进行贴壁计数及多种细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer，CIK)培养。结果 HES自然沉降法、HES离心沉淀法、Ficou密度梯度离心法分离的PBMC回收率分别为86．4％、86．0％、85．1％。结论 羟乙基淀粉离心沉淀法可有效地分离PBMC。     

两种分离人骨髓单个核细胞方法的比较

目的:探讨外周动脉性疾病患者自体骨髓移植治疗骨髓单个核细胞最佳的分离方法.方法:行自体骨髓移植外周动脉性疾病患者39例,分别采取羟乙基淀粉沉淀法和密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,观察骨髓丢失的单个核计数及CD34+细胞比率的差异.结果:羟乙基淀粉沉淀法得到的分离物的单个核细胞及CD34+细胞丢失率低于密度梯度离心法[羟乙基淀粉沉淀法为(55.08±6.00)%,(54.71±7.58)%;密度梯度离心法为(82.38±4.79)%,(73.30±3.68)%,P<0.01].结论:经比较,羟乙基淀粉沉淀法明显优于密度梯度离心法,在外周动脉性疾病患者自体骨髓移植治疗中建议使用羟乙基淀粉沉淀法分离骨髓单个核细胞.     

人脐带血间充质干细胞体外分离培养研究

目的:探讨人脐带血来源间充质干细胞体外分离及培养方法.方法:采用Ficoll-paque(1.077 g/ml)分离液密度梯度离心法结合直接贴壁分离人脐带血单个核细胞中间充质干细胞(MSCs),20?S/DMEM培养,培养至48 h换液并将其上清加入另一培养皿继续培养.观察2个时期细胞贴壁情况;应用流式细胞仪检测各时期细胞.结果:密度梯度法分离来脐血单个核细胞进行培养,可观察12 h即可见少量细胞贴壁生长,绝大部分MSCs在96 h内完成贴壁,经传代纯化第1、2个48 h贴壁细胞均可培养出形态呈较均一长梭形细胞.流式细胞仪检测:单个核细胞中CD44 细胞比例占7.1%、CD34 占28.9%,而在第1个48 h贴壁细胞CD44 、CD34 比例分别占47.2%、6.7%;而第2个48 h贴壁细胞CD44 、CD34 分别占53.3%、4.6%.结论:人脐血间充质干细胞能在体外分离培养,贴壁细胞稳定表达MSCs相关抗原.     

韶关市农村留守儿童孤独感状况调查

目的了解广东省韶关市农村地区留守儿童孤独感现状及其影响因素。方法对韶关市某地区两所农村小学3～6年级学生中的489名留守儿童采用儿童孤独量表和自编调查表进行问卷调查。结果17．6％留守儿童存在孤独感，不同性别孤独感发生率无差异性，不同年龄及不同年级间孤独感发生率差异均有极显著性（P〈0.01）；随年级增加，孤独感发生率呈下降趋势（X^2趋势=5．970，P〈0.05）。留守儿童孤独感与健康状况、学习成绩、学习困难程度、父母教育方式、父母间关系和老师教育方式等因素显著相关（P〈0.01～0．05）。结论农村地区留守儿童中存在一定程度的孤独感问题，老师和家长应以正确的态度和方法对待留守儿童，以减少其孤独感的发生。     

产科新生儿不同部位经皮测黄报警预值的可靠性观察

目的对比观察产科新生儿不同部位经皮胆红素（TCB）报警预值的可靠性。方法132例产科新生儿采取随机数字分组法分为正常产组和剖宫产组各66例,新生儿均于产后第4天同一时间点应用KJ8000经皮测黄仪分别测量额、胸、腹、额胸、额胸腹TCB值,TCB〉12．9mg／dl者,取得亲属同意抽取静脉血检测血清胆红素（SB）,对比分析不同部位TCB及其与sB值的差异。结果两组分别有17例或21例达到TCB报警预值。两组TCB或sB相同方法及相同部位比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;两组TCB不同部位对比,额部值最低、胸部值最高,且与其他部位同组对比差异均有统计学意义（P〈0．01）;两组sB值对比差异无统计学意义（t=1．53,P〉0．05）,与不同部位TCB对比均以胸部数值差异无统计学意义（P〉0．05）,而与其他部位TCB两组差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论正常产与剖宫产新生儿术后sB对比差异无意义;TCB动态监测以胸部结果更接近SB。     

Determination of loss of quality of life

Physiatrists are a valuable resource in legal settings, where assessment of functional capacity to perform work and of future medical needs must be determined. Physiatrists help determine what future medical care is needed to restore and maintain an individual at the maximum level of life function. This article focuses on the use of a quality of life (QOL) rehabilitation model, rather than a medical model, for enhancing functional performance, modifying environments, and facilitating patient coping. We discuss use of the QOL model to describe and influence a patient's physical, psychological, cognitive, vocational/economic, and social/leisure domains.     

血液透析患者家庭护理提供者的生活质量调查

目的:了解江汉油田血液透析(血液透析)患者家庭护理提供者(护理者)的生活质量。方法:对60例血液透析患者的家庭护理提供者进行一般情况和生活质量综合评定问卷(QOLI-74)调查,并进行相关性和多因素回归分析。结果:家庭护理提供者各维度的主观生活满意度与其客观指标相关,但也与其需求、年龄、文化程度、与患者的关系有关。结论:客观状态是影响主观生活满意度的重要因素,同时应考虑护理者的需求、年龄、文化程度、与患者的关系对护理者主观生活满意度的影响。     

星状神经节阻滞治疗失眠疗效观察

失眠症又称不寐，指入睡困难，或维持睡眠障碍（易醒、早醒和再入睡困难）导致睡眠时间减少或睡眠质量下降，不能满足身体生理需要，明显影响日间社会功能和生活质量。现将星状神经节阻滞治疗失眠疗效观察总结如下。