两步法分离人脐血单个核细胞的最佳条件

背景:如何获得较为纯化、高活性的干细胞,目前未见深入研究报告,也未见一个标准化操作流程方案。目的:探讨两步法分离人脐血单个核细胞最佳分离条件。方法:观察羟乙基淀粉在20,30,40,50,60,70min不同时间沉淀脐血中红细胞的效果;使用人淋巴细胞分离液,分别在800,700,600,500,400g/min,离心30,25,20min的条件下分离人脐血单个核细胞。结果与结论:6%羟乙基淀粉沉淀脐血60min效果最好;使用密度为(1.0770±0.0001)g/mL人淋巴细胞分离液,在4℃条件下以700g/min离心力,离心30min,洗涤3次,这样获得的人脐血单个核细胞效果最好,所得细胞沉淀中混杂细胞如红细胞及其他细胞碎片较少,人脐血单个核细胞的细胞得率及活力比较高。提示应用羟乙基淀粉沉淀和人淋巴细胞分离液分离两步法,在最佳时间条件下可提高脐血干细胞的回收率。     

两步法分离人脐血单个核细胞的最佳条件

背景：如何获得较为纯化、高活性的干细胞,目前未见深入研究报告,也未见一个标准化操作流程方案。目的：探讨两步法分离人脐血单个核细胞最佳分离条件。方法：观察羟乙基淀粉在20,30,40,50,60,70min不同时间沉淀脐血中红细胞的效果;使用人淋巴细胞分离液,分别在800,700,600,500,400g/min,离心30,25,20min的条件下分离人脐血单个核细胞。结果与结论：6%羟乙基淀粉沉淀脐血60min效果最好;使用密度为（1.0770±0.0001）g/mL人淋巴细胞分离液,在4℃条件下以700g/min离心力,离心30min,洗涤3次,这样获得的人脐血单个核细胞效果最好,所得细胞沉淀中混杂细胞如红细胞及其他细胞碎片较少,人脐血单个核细胞的细胞得率及活力比较高。提示应用羟乙基淀粉沉淀和人淋巴细胞分离液分离两步法,在最佳时间条件下可提高脐血干细胞的回收率。     

分离外周血单个核细胞的条件优化

目的比较不同抗凝剂、离心力及离心时间对葡聚糖-泛影葡胺(Ficoll)密度梯度离心法分离单个核细胞的影响,优化实验方案。方法取肝素、EDTA及2种抗凝剂混合后的3种不同抗凝血,采用Ficoll法进行分离,用血细胞分析仪进行分类和计数,计算回收率和纯度;同时对EDTA抗凝血进行不同离心力及离心时间的处理,优化分离效果。结果 EDTA组获得PBMC回收率为(51.32±50.21)%,纯度为(45.38±22.14)%;肝素组获得PBMC回收率为(24.52±19.10)%,纯度为(78.46±11.91)%;EDTA+肝素组获得PBMC回收率为(56.32±24.30)%,纯度为(80.27±12.44)%。经单因素方差分析,PBMC回收率方面,EDTA组与肝素组比较差异有统计学意义(P0.05),EDTA组回收率较高,而肝素+EDTA组与EDTA组回收率比较,差异无统计学意义(P0.05);PBMC纯度方面,EDTA组与肝素组比较差异有统计学意义(P0.05),肝素组PBMC纯度较高,而肝素+EDTA组与肝素组比较,纯度则差异无统计学意义(P0.05);PBMC存活率方面,肝素+EDTA组与肝素组、EDTA组比较,均差异无统计学意义(P0.05)。对EDTA抗凝血进行单个核细胞分离实验表明,在离心力为600×g(1 800r/min),离心时间为25min时分离效果最佳。结论肝素+EDTA组回收率、纯度与单种抗凝剂实验组相比,结果差异无统计学意义(P0.05),故在实验过程中可以混合两种抗凝全血进行细胞分离。EDTA抗凝血在离心力为600g(1 800r/min)、离心时间为25min时,分离单个核细胞效果最佳。     

不同离心力分离外周血单个核细胞的条件优化

目的观察不同离心力对人外周血单个核细胞(PBMC)分离的影响。方法采用聚蔗糖密度梯度离心法分离人外周血中PBMC,不同分离离心力及洗涤离心力获取细胞,利用流式细胞仪检测细胞得率和存活状况,并进行统计学分析。结果分离离心力结果:离心力600g时获取的细胞数最多;24h检测的凋亡细胞数在离心力300～900g分离时差异无统计学意义(P0.05)且相对较少,增加离心力,凋亡细胞数增加;72h检测离心力大于1 200g或低至300g时,存活细胞数显著减少。洗涤离心力结果:离心力150g时细胞得率显著低于300～2 400g时;24h检测细胞凋亡显示离心力大于600g时,凋亡细胞数增加;72h检测显示洗涤离心力大于1 200g时,存活细胞数显著减少。结论分离离心力在600～900g及洗涤离心力在300～600g均可用于PBMC的分离。     

密度梯度离心法分离脐血干细胞：分离介质的筛选

背景：应用脐血分离干细胞的目的是获得以干细胞为主要群体的单个核细胞群,密度梯度离心法是最简单有效的方法之一。密度梯度离心法使用的分离介质以聚蔗糖泛影葡胺最为常用,但哪种浓度获得干细胞最多,目前尚未深入研究。目的：探讨密度梯度离心法分离人脐血干细胞分离介质的最佳浓度,建立临床级干细胞分离应用方案。方法：采用两步法分离脐血流程,先用羟乙基淀粉沉淀脐血红细胞,再使用质量浓度分别为（1．073O±0．0001）,（1．0750±0．0001）,（1．077O±0．0001）g／mL的分离液,分离沉淀脐血红细胞后的上清液,得到单个核细胞,分别计数细胞获得率及细胞存活率。采用流式细胞仪测定单个核细胞表面标志物,将各亚组分绘制成直方图或散点图,分析所得脐血单个核细胞中所含单个核细胞亚组分的比例和绝对数量。结果与结论：应用质量浓度（1．0730＋0．0001）g／mL的分离液可得到最大比例间充质干细胞群,是分离间充质干细胞的最佳质量浓度。使用质量浓度（1．0750±0．0001）g／mL的分离液可得到较高比例的造血干细胞群,是分离造血干细胞的最佳质量浓度。使用质量浓度（1．0770±0．0001）g／mL的分离液得到细胞总数最高,但获得的间充质干细胞、造血干细胞比例最低。采用两步法分离干细胞流程,建立严格的实验室条件和标准,可获得密度梯度离心法分离人脐血干细胞的最佳分离方案。     

脐血单个核细胞的分离及冻存

研究脐血采集后的放置,单个核细胞的分离,冻存等的影响因素。方法为血液采集后,离心分离单个核细胞,进行冷冻保存及复苏后洗涤,结果优选为采集后4℃或室温放置24小时内,羟乙基淀粉2次离心法分离单个核细胞,50%二甲亚砚加自身血浆为保护剂冻存,复苏后洗涤等程序,结论：本研究的优化方法可有效地保存脐血单个核细胞。     

外周血单个核细胞分离方法探讨

目的 探讨外周血单个核细胞(PBMC)的不同分离方法对分离效果、贴壁能力以及淋巴细胞的增殖活性的影响。方法 取肝素抗凝血，分别用羟乙基淀粉(hydrixyethylstarch，HES)自然沉降法、HES离心沉淀法、Ficoll密度梯度离心法三种方法分离单个核细胞，直接进行贴壁计数及多种细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer，CIK)培养。结果 HES自然沉降法、HES离心沉淀法、Ficou密度梯度离心法分离的PBMC回收率分别为86．4％、86．0％、85．1％。结论 羟乙基淀粉离心沉淀法可有效地分离PBMC。     

脐血单个核细胞四种细胞因子表达的检测

脐血单个核细胞四种细胞因子表达的检测习杰英韩丽邵文斌李旭陈葳刘娟为探索脐血干细胞移植的免疫和造血重建机制，我们检测了脐血单个核细胞（ＭＮＣ）表达白细胞介素２（ＩＬ－２）、白细胞介素４（ＩＬ－４）、白细胞介素６（ＩＬ－６）及粒－巨噬细胞集落刺激因子（Ｇ...     

人脐血单个核细胞体外分化为内皮细胞的初步研究

为了探讨细胞因子组合在体外定向诱导人脐血单个核细胞(mononuclear cell，MNC)分化为内皮细胞的可行性，以及脐血干细胞在缺血性疾病中应用的可能性，利用源自人脐静脉血的MNC及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor—basic，bFGF)及胰岛素样生长因子-Ⅰ(insulin—likegrowth factor—Ⅰ，IGF—Ⅰ)的细胞因子组合的培养条件，体外进行向内皮细胞的诱导分化。结果表明：在该体系条件下可诱导分化出典型梭形内皮细胞，流式细胞术检测vWF( )细胞率可达80％以上，电镜观察发现在胞浆中含有内皮细胞的Weibel—Palade小体。结论：脐血单个核细胞在VEGF等细胞因子的诱导下有可能定向分化为内皮细胞，脐血有望成为治疗缺血性疾病成体干细胞的一个供源。     

离心管贴壁细胞对人脐血单个核细胞体外培养成功率的影响

背景：在常规的脐血间充质干细胞密度梯度离心分离过程中,离心管壁有大量单个核贴壁细胞,这些早期的贴壁细胞是否与脐血间充质干细胞的体外培养成功率低存在一定的联系呢？目的：比较4种方法分离人脐血单个核细胞的体外培养成功率,观察离心管贴壁细胞对人脐血单个核细胞体外培养成功率的影响。方法：取足月健康顺产新生儿脐血36份,随机分为4组,每组9份,于采集后6h内分别采用甲基纤维素沉降法（A组）、密度梯度离心分离法（B组）、甲基纤维素联合密度梯度离心分离法（C组）、甲基纤维素联合改良密度梯度离心分离法（D组）分离出单个核细胞,锥虫蓝染色检测细胞活力,用细胞计数板进行细胞计数,调整细胞浓度为1×109L-1～2×109L-1,接种于含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中培养和传代,相差显微镜下观察脐血单个核细胞的形态。收集第3代脐血单个核细胞,采用细胞计数板进行计数,计算扩增倍数,采用流式细胞仪鉴定细胞免疫表型。结果与结论：36份脐血中,成功分离33份脐血单个核细胞,B组有3份分离失败。33份中共22份原代培养中出现大量贴壁细胞,其中A组8份,B组2份,C组5份,D组7份。9份（27%）培养出能融合且可稳定传代的成纤维样细胞,其中A组3份,B组0份,C组1份,D组5份。4组脐血单个核细胞在原代培养5～7d后均可见数量不等的贴壁细胞,呈梭形成纤维样细胞或（和）圆形巨核样细胞。A组与D组于原代培养三四周可见成纤维样细胞集落形成,细胞形态与骨髓间充质干细胞相似,呈较均一的长梭形,可稳定培养至60～90d形态无明显变化。流式细胞仪免疫检测,第3代脐血单个核细胞不表达或弱表达CD34、CD45和CD106等造血干细胞和内皮细胞标志,但显著表达CD29、CD105等间充质干细胞表面标志。结果显示离心管贴壁细胞可显著提高脐血单个核细胞的体外培养成功率,而甲基纤维素联合改良的密度梯度离心分离法,可充分回收离心管贴壁细胞,利于脐血单个核细胞的体外扩增和稳定传代。     

人脐血单核细胞诱导分化为神经样细胞的实验研究

目的探讨人脐血单核细胞向神经细胞分化的潜能,为其治疗神经系统疾病提供实验依据。方法采用HES法分离脐血单核细胞（UCBMNCs）,L-DMEM培养液原代和传代培养UCBMNCs,碱性成纤维细胞生长因子诱导细胞向神经细胞分化,应用流式细胞仪和免疫组化方法分析细胞中nestin、NSE阳性表达情况。结果原代UCBMNCs中有少量细胞表达nestin,阳性率为3.85%±0.88%;经诱导分化后原代（P0）和第10代（P10）细胞形态向神经样细胞转变：NSE阳性表达率分别为25.8%±4.6%、89.3%±8.5%;nestin阳性表达率分别为27.8%±5.8%和86.7%±6.8%。结论UCBMNCs具备神经样细胞分化潜能。     

脐血CD34+细胞及红系祖细胞扩增的实验研究

脐血是造血祖细胞的丰富来源之一,选择合适的培养条件,体外诱导其定向扩增为红系祖细胞,输入体内产生成熟红细胞。本实验旨在探讨脐血单个核细胞(MNC)体外红系定向扩增的理想因子组合(Flt3配基FL联合TPO、SCF、EPO及FL、SCF、TPO)对CD34 细胞扩增的影响。将单个核细胞接种至stemspan无血清培养液中,共分3组:A组为对照组,B组为TPO SCF FL EPO IGF1组,C组为TPO SCF FL组,C组在第6天及以后换液加入EPO和IGF1。于培养0、6、10、14天进行细胞计数,细胞集落测定,流式细胞术测定细胞的CD34、CD34CD71、CD71GPA细胞的比例。结果表明:经10天培养后,B组总细胞数扩增6.89倍,而C组3.06倍;B组CD34 细胞增加4.83,而C组2.47倍;B组集落形成细胞数增加4.3倍,而C组增加2.5倍;B组红系祖细胞BFUE和CFUE数增加5.4倍,而C组3.1倍;B组CD34 CD71 细胞数增加8.72倍,而C组3.37倍;B组CD71 GPA 细胞数增加53.4倍,而C组30.29倍。结论:脐血MNC在无血清培养液中加入FL SCF TPO实现了CD34 细胞及集落形成细胞的扩增。脐血MNC在无血清培养液中加入FL SCF TPO EPO IGF1短期液体培养获得红系祖细胞的扩增,在第0天比6天加入EPO获得更多红祖细胞(P<0.05)。由于TPO SCF FL EPO IGF1组的集落形成细胞数、CFUE和BFUE数于第10天最多,故培养后收获时     

人脐血间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的探讨来源于人脐血的间充质干细胞(MSCs)在体外分离、纯化和扩增培养的可行性和条件。方法无菌条件下收集正常足月胎儿的脐带血,经肝素抗凝,用相对密度1.077的淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,以偏酸性的M esencu ltTM作为培养基进行培养和纯化扩增,用流式细胞仪检测MSCs的表面标志。结果来源于人脐血的单个核细胞种植于特定的培养基中后,可产生贴壁细胞,主要表现为破骨样细胞和间充质样细胞,传3代后,可得纯化扩增的人脐血MSCs。6.6×105个脐血原代MSCs在体外扩增10代后,获得9.9×108个细胞。流式细胞仪检测结果显示,人脐血MSCs不表达CD34、CD11 a和CD11b,强表达CD29,弱表达CD71,与骨髓MSCs表面抗原特性一致。结论源于人脐血的MSCs在体外可以培养、扩增,可作为干细胞来源之一用于实验研究和临床。     

体外扩增的脐血单个核细胞植入NOD/SCID小鼠的研究

为了探讨在无血清、无基质培养条件下SCF、FL和TPO 3种因子组合体外扩增的脐血单个核细胞(MNC)的最佳移植时机及植入潜能,将SCF,FL和TPO 3种因子组合体外扩增的脐血单个核细胞培养14天,在0、7、10和14天检测有核细胞数(TNC),CD34 细胞数,CD34 CXCR4 细胞数,CD34 CD49d 的细胞数及集落形成单位(CFU)数,并将SCF FL TPO 3种因子组合的无血清无基质条件下扩增培养7天前后的脐血单个核细胞移植给经亚致死量照射的NOD/SCID小鼠,6周后用流式细胞术,PCR法检测存活小鼠体内的人源性细胞.结果表明,经过14天的培养,脐血细胞得到了有效的扩增,TNC数,CD34 细胞数,CD34 CD49d 的细胞数于7天达高峰,其后开始下降,而CFU数,CD34 CXCR4 细胞数于第10天达高峰.在移植6周后,扩增脐血移植组的NOD/SCID小鼠的存活率和人源性CD45 细胞的检出率分别为56.25%和(1.39±0.63)%,高于新鲜脐血移植组31.25%和(0.73±0.16)%,亦高于生理盐水移植组(0和0),差异有显著性(p＜0.05),扩增脐血移植组有6只NOD/SCID小鼠骨髓细胞中可检测到人特异ALU序列的表达.结论体外培养7-10天可能是收获细胞的最佳时机;SCF FL TPO 3种因子组合扩增7天的脐血单个核细胞能够植入NOD/SCID小鼠,其植入水平优于未扩增的脐血;上调脐血造血细胞上CXCR4,CD49d的表达可能会增加脐血造血细胞的植入能力.     

人脐血贴壁细胞生物学特点的观察

为了探讨人脐血贴壁细胞分离培养的可行性，分离人脐血CD34^ 细胞进行Dexter培养，观察贴壁细胞的生物学特点结果表明：Dexter培养9—14天(平均112天)时贴壁细胞集落开始形成。1522天(平均19．6天)时集落数量最多，培养28天贴壁细胞铺满培养皿底。细胞类型以成纤维样细胞、巨噬样细胞、“小圆”类细胞为主。细胞化学染色显示：非特异性酯酶染色(NSE)、糖原染色(PAS)100％为阳性，过氧化物酶染色(POX)为阴性，碱性磷酸酶(ALP)28％为阳性。免疫组织化学染色显示：CD106阳性达96％，CD29阳性为93％。CD44阳性为98％，CD45为阴性，CD50％阳性为62％。纤维粘连蛋白(Fn)：92％阳性；层粘连蛋白(Ln)：74％阳性；胶原Ⅳ：83％阳性。结论：人脐血CD34^ 细胞群中存在造血基质细胞的前体细胞，人脐血贴壁细胞具有造血基质细胞的某些生物学特点。     

胎肺间充质干细胞对脐血来源的单个核细胞体外扩增为巨核细胞的影响

本研究探讨胎儿肺部组织来源的间充质干细胞在无血清条件下体外对脐血单个核细胞诱导扩增为巨核细胞的影响。取脐血单个核细胞,在TPO,IL-11,肝素的扩增体系中分为2组培养。第1组为脐血单个核细胞单独培养,第2组脐血单个核细胞与间充质干细胞共培养,在第7,10,14天时进行活细胞计数,用流式细胞仪分析CD41a和CD61的表达情况。采用免疫组织化学和透射电子显微镜观察第14天细胞的形态与结构,用流式细胞仪分析细胞DNA含量。结果表明,第2组在第10天时获得的CD41^＋细胞和CD61^＋细胞数量最多,分别为第1组的4．5倍和4．7倍;但免疫组织化学和电子显微镜显示,2个组的CD41a^＋和CD61^＋细胞的核发育不成熟。结论：胎肺间充质干细胞能有效刺激CD41a^＋和CD61^＋细胞生成,但不能促进幼巨核细胞核的发育。     

脐带血单个核细胞分离及保存的优化研究

目的优化脐带血单个核细胞的分离制备及保存的方法。方法采集符合要求的足月顺产或剖宫产新生儿脐带血,采用二次回浆法分离制备脐带血有核细胞并与传统离心法比较。对分离制备的脐血有核细胞采用不同的降温速率进行低温保存研究,优化降温速率及程序降温终止温度。结果采用二次回浆法和传统离心法分离制备脐带血有核细胞,其总数(×109)分别为1.52±0.89和1.11±0.35,回收率(%)分别为92.12±5.78和86.94±7.34,差异有统计学意义(P<0.05)。脐血造血干细胞在4℃～-40℃降温过程中,采用1℃/min和5℃/min的降温速率,细胞回收率(%)分别为92.4±2.3和84.7±2.4,P<0.05;在-40℃～-90℃时,采用l℃/min或5℃/min的降温速率,细胞回收率(%)分别为91.1±1.9和90.3±2.8,P>0.05。在程序降温仪降至-90℃和-130℃后移至液氮,细胞回收率(%)分别为91.1±2.1和92.3±1.9,P>0.05。结论二次回浆法能提高脐带血制备有核细胞数;脐血干细胞保存优化的方法为4℃～-40℃时采用1℃/min的降温速率,再以5℃/min的降温速率降至-90℃后...     

人脐血清代替胎牛血清体外培养脐血树突状细胞

目的　探讨人脐血清取代胎牛血清对脐血来源的树突状细胞体外诱导的影响。方法　无菌采集脐血 ,密度梯度离心法获取界面细胞 ,采用Mini MACS分离技术 ,分离CD34+ 造血干细胞 ,分成 3组 :脐血清组 (加入含 10 %UCS的RPMI 16 4 0培养液及细胞因子 ) ,胎牛血清组 (加入含 10 %FCS的RPMI 16 4 0培养液及细胞因子 ) ,对照组 (含10 %FCS但不含细胞因子 )。细胞因子为IL 4、GM CSF和TNF α ,第 8天收集部分细胞做细胞表型分析、形态学观察。结果　脐血清培养的DC(UCS DC)表面CD80、CD5 4和HLA DR的表达率与胎牛血清培养DC(FCS DC)比较无明显差异 ,UCS DC、FCS DC表达率与对照组比较均明显增高。结论　脐血清代替胎牛血清体外培养脐血来源的DC前体细胞 ,可以诱导出成熟DC ,为临床应用提供了一种新的选择。     

脐血来源的两种内皮祖细胞的分离、培养和鉴定

为了建立从人脐血分离培养两种内皮祖细胞的方法和培养体系，从脐血分离单个核细胞，在含有内皮细胞条件培养液的体系中培养得到两种细胞，利用摄取乙酰化低密度脂蛋白（acetylated low-density lipoprotein，DiI-Ac—LDL）和结合欧洲荆豆凝集素（Ulex European Agglutinin 1，UEA—1）进行鉴定，并进一步用免疫细胞化学、RT-PCR、流式细胞术对它们进行内皮细胞相关的表型检测。结果表明，这两种细胞均能摄取DiI-Ac-LDL和结合UEA—1，表达内皮细胞的标志如CD31、CD144和血管假性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF），有CD31、酪氨酸激酶受体（kinase tyrosine insert domain receptor，KDR）、CD144和内皮一氧化氮合成酶（endothelial NO synthase。ENOS）的基因转录。但是，它们的增殖能力明显不同，分别称为循环成血管细胞和高增殖潜能内皮祖细胞。流式细胞计数结果显示，这两种细胞在一些表面标志表达方面也存在明显的差异。结论：利用含内皮细胞条件培养液的培养体系，成功地从脐血分离的单个核细胞中培养得到了两种内皮祖细胞。