条纹斑竹鲨鱼DNA结合抑制因子cDNA的克隆、序列特征及其在肝再生过程中的表达分析

DNA结合抑制因子(Inhibitor of DNA binding,Id)又称分化抑制因子(Inhibitors of Differentiation,Id),属于负调控因子HLH家族的成员,其功能是与DNA结合并抑制细胞的分化和促进细胞的增殖。为揭示Id蛋白在鲨鱼肝脏再生过程中的作用,作者从前期构建的条纹斑竹鲨鱼肝脏cDNA文库中克隆到编码Id蛋白的cDNA全序列并预测了其编码产物(CpId)的结构,探讨了该基因在鲨鱼体内的时空表达方式,结果表明:CpId cDNA全长为1 074 bp,编码一个由135个氨基酸残基组成的无跨膜区的胞内蛋白,理论分子质量(Mr)为14 857.2,理论等电点(pI)为5.35。CpId蛋白序列与其他生物来源的Id蛋白的同源性介于42%～62%之间,其N端第31～87 aa组成一个相对保守的Myc型helix-loop-helix结构域。CpId基因在鲨鱼各种组织中均有表达,但以在肝脏、脑和生殖腺中的表达最高;肝部分切除后,CpId基因的表达迅速上调,在切除1 h后到达最高值(为正常肝组织的18倍左右),其后逐渐下降,并在24 h时恢复至正常肝组织中的水平;CpId基因的表达在肝部分切除后的第48 h出现第2个相对较高的表达峰。上述结果表明CpId基因参与了肝脏再生调控的过程,其作用可能与促进肝细胞的增殖再生过程有关。     

木榄甘油醛-3-磷酸脱氢酶全长cDNA的克隆及其序列分析

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)是糖酵解过程和卡尔文循环中的关键酶,在糖代谢和能量代谢过程中起着重要的作用。为揭示GAPDH在植物耐盐过程中的作用,研究了从前期构建的盐胁迫下木榄幼叶cDNA文库中克隆到编码GAPDH的cDNA全序列,并对其编码蛋白的理化性质、结构特点和空间分布特点进行了分析。序列分析结果表明:木榄GAPDH的cDNA全长为1482bp,编码区为1218bp,编码一个由405个氨基酸残基组成蛋白质,理论Mr为43.4k,理论等电点(pI)为8.65。基于该蛋白的氨基酸序列分析基础上的系统发育分析表明木榄的进化地位与毛果杨较为接近。结构分析和预测结果显示:木榄的GAPDH为无信号肽和跨膜区的亲水性蛋白,含有GAPDH的保守结构域NADB-Rossmann(71-222aa)和Gp_dh_C(227-383aa)。同源模建分析结果表明:该蛋白与菠菜相比具有1个高度保守的活性区,该活性区由第70～405氨基酸残基组成。     

鲨肝细胞再生刺激因子的分离纯化和特性

目的　从鲨鱼肝脏中分离纯化肝细胞再生刺激因子 ,并研究其分子特点和活性。方法和结果　健康鲨鱼肝脏经匀浆、冻融、热提、离心和超滤 ,在分子量小于 3万的组分中检出肝细胞再生刺激因子 (HRSF)的活性。此样品经DEAE Sepharosefastflow柱层析 ,FPLCResource 30Q、ResourceQ及MonoQ色谱 ,得到鲨肝细胞再生刺激因子 (sHRSF)纯品。SDS PAGE测定sHRSF的分子量为 14 6 0 0Da ,紫外扫描显示其特征吸收峰为 2 76nm ,等电点约为 5 1,含有 18种氨基酸 ,N端氨基酸序列为LVGPIGAVGPAGKDG。具有显著刺激肝再生生物活性。结论　获得了一种未知的新的活性蛋白 ,即鲨肝细胞再生刺激因子(sHRSF)     

兔抗条纹斑竹鲨IgNAR多克隆抗体的制备和应用

目的 制备条纹斑竹鲨（Chiloscyllium plagiosum）IgNAR的多克隆抗体,为条纹斑竹鲨单域抗体的开发提供工具。方法 合成条纹斑竹鲨IgNAR恒定区的一段多肽作为抗原,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体血清,采用间接ELISA法测定抗体的效价,并通过Western Blot检测多克隆抗体的特异性。此外,利用制备的多克隆抗体对条纹斑竹鲨外周血淋巴细胞进行免疫荧光和流式分析。结果 制备的抗血清效价高达1 000万,该多克隆抗体不仅能识别条纹斑竹鲨的IgNAR,还能识别护士鲨（Ginglymostoma cirratum）的IgNAR,但对条纹斑竹鲨的灵敏度更高。通过免疫荧光和流式细胞术确定了该多克隆抗体还可以识别条纹斑竹鲨外周血淋巴细胞跨膜型IgNAR。结论 成功制备了条纹斑竹鲨IgNAR的多克隆抗体,该抗体可用于Western Blot、免疫荧光和流式细胞术等实验,为条纹斑竹鲨单域抗体的开发提供了有力工具。     

内蒙古白绒山羊Izumo蛋白的基因编码区cDNA序列扩增及结构初步分析

目的  对内蒙古白绒山羊精子膜蛋白Izumo的基因编码区cDNA序列进行扩增并对其结构作初步分析。方法  以已知的内蒙古白绒山羊Izumo部分基因序列为模板,采用cDNA末端快速扩增技术扩增3′端和5′端未知序列,钓取基因编码区,并分析编码区氨基酸序列。结果  经序列扩增和拼接,得到1035 bp的Izumo编码区cDNA序列,后者编码由344个氨基酸组成的蛋白。氨基酸序列中包含免疫球蛋白样结构域。Izumo编码区的疏水性平均值为-0.181。找到4个位于Izumo蛋白胞外区的潜在磷酸化位点。结论  进一步确定Izumo属于免疫球蛋白超家族的一员,初步得出Izumo是一种亲水性蛋白,根据潜在磷酸化位点的位置,推断磷酸化可能不是Izumo蛋白发挥作用的机制。     

薏苡delta-12脂肪酸去饱和酶基因FAD2的克隆和表达分析

本文克隆了薏苡delta-12脂肪酸去饱和酶基因FAD2 (fatty acid desaturase),并对其分子结构特征和功能进行了研究.结果 表明,薏苡FAD2基因的cDNA全长序列为936 bp,编码311个氨基酸残基.生物信息学预测结果显示,该基因编码蛋白为碱性亲水不稳定蛋白,分子质量34.87 kDa,含有...     

日本蟾蜍TAGLN2 cDNA的克隆与生物信息学分析

为研究蟾蜍皮肤中多肽类有效成分,通过菌落PCR(polymerase chain reaction)对日本蟾蜍(Bufojaponicus formosus)皮肤cDNA质粒文库进行筛选,对测序结果进行分析及同源性比较,获得转胶蛋白-2(transgelin-2,TAGLN2)的5′端缺失的部分cDNA序列(GenBank登录号为JX197456),长为997 bp,包括348 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)、5’端31 bp及3’端618 bp的非翻译区(untranslated region,UTR),编码由115个氨基酸残基组成的蛋白质。推导的氨基酸序列含有一个调宁蛋白同源性结构域(calponin homology,CH)、两个可形成二硫键的半胱氨酸残基、3个α螺旋区域和5个潜在的磷酸化位点。氨基酸序列同源性分析显示,本文获得的日本蟾蜍N-端截短型TAGLN2与热带爪蟾(Xenopus(Silurana)tropicalis)和非洲爪蟾(Xenopus laevis)相对应部分的同源性分别为90%和89%,与其他7种动物的同源性介于71%～85%之间。     

FABP3对P19细胞增殖的影响及其生物信息学分析

目的 探讨脂肪酸结合蛋白(FABP)3基因过表达对P19细胞分化、增殖的影响及FABP3基因的生物信息学特征.方法 构建FABP3过表达载体及相应的空载体,转染P19细胞,经0.9%二甲基亚砜(DMSO)诱导分化为心肌细胞,定量PCR检测肌钙蛋白T(cTnT)和转录调控因子GATA4基因的表达,MTT法检测P19细胞增殖,应用在线数据库软件分析FABP3的核苷酸基本特征、蛋白质理化性质、亚细胞定位等.结果 与空载体相比,FABP3基因过表达能抑制cTnT、GATA4 mRNA表达及P19细胞增殖(P＜0.05或P＜0.01).生物信息学分析显示,FABP3基因mRNA全长1097 bp,开放阅读框长402 bp,编码133个氨基酸,相对分子质量为14 858 Da,蛋白主要位于胞浆.结论 FABP3基因过表达显著抑制心肌细胞分化、增殖,生物信息学分析为进一步研究该基因奠定了基础.     

结肠黑变病相关基因金属泛激蛋白-1cDNA和氨基酸序列分析

目的对结肠黑变病相关基因金属泛激蛋白-1(MPS-1)cDNA序列和氨基酸序列进行综合分析,为其结构和功能的研究奠定理论基础。方法从Pubmed数据库中获得目标cDNA序列,利用基因和蛋白质分析处理软件DNAMAN、NCBI ORF finder、BLAST、Conserved Domains、GOR、SWISS-MODEL等软件对该目标的基因序列和氨基酸序列进行综合分析。结果 MPS-1蛋白cDNA序列长为361 bp,编码84个氨基酸残基,基因序列比对显示该蛋白与核糖体蛋白S27(RPS27)mRNA的编码序列同源度最高,两者核苷酸的相似度为361/361(100%),氨基酸序列比对显示该蛋白与RPS27的氨基酸序列同源度最高,两者氨基酸的相似度为84/84(100%),目标序列中存在1段Ribosomal_S27e家族保守结构域,二级结构和三级结构预测显示目标蛋白中主要存在α-螺旋、β-折叠和无规卷曲的结构。结论 MPS-1蛋白与RPS27同源度高,与肿瘤的发生密切相关。     

大鼠肝再生增强因子的基因克隆

目的克隆大鼠肝再生增强因子 (ALR)编码序列 ,并在原核细胞表达。方法按文献报道大鼠肝再生增强因子核苷酸序列合成引物 ,从2周龄大鼠肝组织提取RNA ,利用RT_PCR扩增大鼠肝再生增强因子基因编码区 ;将PCR扩增片断亚克隆到pBV221质粒 ,构建原核表达重组载体 ,导入到大肠杆菌后热诱导表达目的蛋白。结果从大鼠肝脏的RNA中扩增到长约400bp的ALRcDNA编码区基因 ,序列分析表明与文献报道一致 ;重组克隆经热诱导表达出分子量约15kD大小的蛋白质 ,与预期值一致。结论从2周龄大鼠肝组织中成功克隆肝再生增强因子基因 ,并获得了原核细胞高效表达     

Fatty Acid Binding Proteins: Potential Chaperones of Cytosolic Drug Transport in the Enterocyte?

Purpose  

Several poorly water-soluble drugs have previously been shown to bind to intestinal (I-FABP) and liver fatty acid binding protein (L-FABP) in vitro. The purpose of this study was to examine the potential role of drug binding to FABPs on intestinal permeability and gut wall metabolism in vivo.     

人肝脏再生增强因子cDNA的克隆、表达及产物活性鉴定

目的通过对人源肝脏再生增强因子穴Augmenterofliverregeneration熏ALR雪cDNA进行克隆、表达及表达产物活性的初步鉴定,为基因工程大量制备重组hALR穴humanAugmenterofliverregeneration熏ALR雪及其临床应用提供资料。方法提取人胎肝总RNA,通过RT-PCR获得全长hALRcDNA,构建原核融合表达质粒pGEX-4T-3/hALRcDNA,转化大肠杆菌诱导表达融合蛋白。MTT法及小鼠CCl4肝衰竭模型检测重组hALR的生物学活性。结果测序证实克隆得到的hALR序列完全正确。SDS-PAGE检测表达产物分子量约41kD,与融合蛋白GST-hALR的预期分子量相吻合。MTT比色结果为21.9ng/mlhALR对Hep3B细胞系的促增殖作用显著高于对照组(P<0.05)。体内活性检测结果表明hALR能显著提高CCl4诱导肝功能衰竭动物的存活率(χ2=3.923熏P<0.05)。结论重组hALR的制备过程简单易行,可通过基因工程方法大量生产。活性检测表明hALR具有促肝细胞增殖和肝功能修复的作用。     

促进肝脏再生的药物及其机制

肝脏是哺乳动物中具有高度再生能力的器官。当肝脏受损时，静息的肝细胞接受刺激而重新进入细胞周期，使肝脏再生并部分恢复肝功能。然而，肝再生反应并不总是成功的，有时肝损伤会发展为进行性损伤并诱发严重的肝衰竭。对于部分肝脏切除手术后的肝硬化或癌症患者而言，寻找既能保护肝功能，又能提高肝脏再生能力的药物和方法具有重要的临床意义。本文就文献报道的促肝再生作用的药物及其作用机制作一综述，旨在为开发有效的药物治疗提供新见解。     

绞股蓝总皂苷保肝作用实验研究

目的对绞股蓝总皂苷保肝作用进行研究。方法采用四氯化碳致急性肝损伤及绞股蓝总皂苷对肝细胞再生作用模型，检测降酶率、再生度等指标。结果绞股蓝总皂苷对大白鼠急性肝损伤具有降酶作用，能促进肝细胞再生。结论绞股蓝总皂苷对四氯化碳引起的大白鼠急性肝损伤具有明显的改善作用。     

The role of hepatic stimulator substance (HSS) on liver regeneration arrest induced by cadmium

BACKGROUND: The mechanism of cadmium-induced liver regeneration arrest in relation to hepatic stimulator substance (HSS) biological activity was investigated. MATERIALS AND METHODS: In Wistar rats subjected to 65 - 70% partial hepatectomy, saline, cadmium, cadmium and HSS were administered. The rats were also subjected to 30 - 34% partial hepatectomy. Mitotic index, immunochemistry for PCNA, 3[H]-thymidine incorporation into DNA and thymidine kinase activity were used as indices of liver regeneration. HSS biological activity was evaluated in all groups of rats using a bioassay. Results: Liver regeneration and HSS activity were arrested by cadmium during the first 24 h after partial hepatectomy. Both in normal and in cadmium-treated rats, the HSS activity was increased and liver regeneration coincided. HSS activity was stable in 30 - 34% hepatectomized rats. HSS administration was able to restore liver regeneration arrest induced by cadmium. Conclusion: The biological activity of HSS increased at the time of G1/S transition of hepatocytes in the cell cycle and no increase was observed with asynchronous G1/S transition (30 - 34% partial hepatectomy). The suppression of HSS biological activity by cadmium seems to represent an important factor for liver regeneration arrest induced by the metal and HSS administration is able to restore liver regeneration.     

Change in caspase-3-like protease in the liver and plasma during rat liver regeneration following partial hepatectomy

Recent studies have shown that many factors orchestrate liver regeneration after a two-thirds partial hepatectomy (PH). However, the termination mechanism in liver regeneration has not been thoroughly studied. In this paper, we report that the activity of liver caspase-3-like protease, which is specifically activated in apoptosis, increases 18, 36, and 48 hr after PH during maximal hepatocyte proliferative activity. This is the first study that shows the activation of an apoptosis-executing enzyme during physiological liver regeneration. These results suggest that apoptosis is induced in each surge of DNA synthesis as the termination mechanism. When phenoxybenzamine, an alpha-blocker that has been reported to inhibit DNA synthesis during liver regeneration, was injected 8 hr after PH, the caspase-3-like activity in the liver peaked at 15 hr after PH and the enzyme activity also increased in plasma at 18 and 24 hr after PH in sharp contrast to the case of normal regeneration. These results indicate that extensive apoptosis is caused by phenoxybenzamine and that the secondary necrosis of apoptotic cells results in the increase of caspase-3-like protease activity in the plasma.     

Effect of Gomisin A (TJN-101) on liver regeneration.

We studied the effect of TJN-101, a lignan component of Schisandra fruits (Schisandrae fructus), on liver regeneration after partial hepatectomy. TJN-101 was given orally to male Wistar rats 30 min before partial hepatectomy. The mitotic index and the level of DNA synthesis increased after partial hepatectomy and their increase was significantly enhanced by TJN-101. Ornithine decarboxylase (ODC) activity increased in the early stages of liver regeneration and it was also significantly enhanced by TJN-101. Besides, TJN-101 enhanced the increase in hepatic putrescine. These results suggest that TJN-101 stimulates liver regeneration after partial hepatectomy by enhancing ODC activity, which is an important biochemical event in the early stages of liver regeneration.