同病异证H22肝癌小鼠脾脏细胞周期通路基因表达的特征

目的 观察同病异证H22肝癌小鼠脾脏细胞周期通路基因转录的特征.方法 运用小鼠计量化四诊及辨证方法及Affymetrix GeneChip Mouse Exon 1.0 Array等技术,从接种H22肝癌昆明种小鼠出瘤早期筛选邪毒壅盛证、气虚证小鼠,检测其脾脏细胞周期通路基因的表达.结果 与正常组比较,邪毒壅盛证和气虚证小鼠脾脏细胞周期通路相关基因一致发生了明显的上调,其中,邪毒壅盛证上调更明显.结论 肿瘤发生后,小鼠脾脏细胞周期通路总体处于比较活跃的状态,细胞增殖加速,邪毒壅盛证、气虚证等同病异证小鼠差别不大.     

荷瘤小鼠早期邪毒壅盛和气虚证睾丸下调的基因

目的:观察H22荷瘤小鼠早期邪毒壅盛和气虚证睾丸组织一致下调的基因。方法:采用荷瘤小鼠标准化四诊和辨证方法,以及GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array等技术,检测H22荷瘤小鼠早期邪毒壅盛证和早期气虚证睾丸组织基因表达谱的差异,重点关注早期阶段2个证候一致下调且表达量较大的基因。结果:筛选出早期邪毒壅盛和气虚证一致下调的基因共150个,其中有11类可以简单归类的基因;气虚与邪毒壅盛证这些基因的表达量差异不大,前者略高于后者;中晚期荷瘤小鼠这些基因表达接近正常对照组,甚至上调。结论:肿瘤发生的早期睾丸基因改变以下调为主,一些基因涉及精子发生,提示荷瘤小鼠生殖受到影响;鉴于两个证候这些基因表达的差异不大,及中晚期表达有增加趋势,提示这些基因下调可能与肿瘤早期应激有关;多数基因在睾丸组织中的功能还不清楚,提示有大量探索工作。     

邪毒壅盛证H22荷瘤小鼠肿瘤组织基因的表达特征研究

目的揭示H22荷瘤小鼠邪毒壅盛证肿瘤组织基因表达的特征。方法采用GeneChipMouseExon1．0STArray等技术及芯片分析方法,观察H22荷瘤小鼠邪毒壅盛、早期气虚、中期阳气虚及中晚期气阴阳虚证肿瘤组织基因表达的差异。结果筛选到邪毒壅盛证独特性高表达的基因32个,其中包括Tete3、Phf7、Ldhc等参与睾丸发育、精子或卵子发生的基因22个,Adipoq、Nream、Tnfaip6等与肿瘤有关的基因4个,以及Atp8b3、Pnpla3、Retn等其他功能的基因6个。筛选到邪毒壅盛证独特性低表达的基因2个,有Cort和LOC668417。结论邪毒壅盛证H22荷瘤小鼠肿瘤组织中存在大量独特性表达的基因,可能是该证候与其他证候区别的内在特征。     

邪毒壅盛证H22荷瘤小鼠甲状腺独特上调和下调基因的检测

我们以往的研究一再发现,荷瘤小鼠在肿瘤发生后,会自发形成证候及其演变,早期以邪毒壅盛证、气虚证多见,且发现邪毒壅盛证动物预后差,带瘤生存时间短.鉴于学术界以往的研究观察到中医证候的形成与甲状腺密切相关,那么,邪毒壅盛证发生时,甲状腺是否存在独特的基因表达特征,是否与该证候形成有关?因此,我们通过业已建立的小鼠四诊工作站及其系列标准[1-2],对H22荷瘤小鼠进行辨证,筛选出早期邪毒壅盛证、气虚证、中期阳气虚证、中晚期气阴阳虚证等4个常见证型,继而采用GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array等技术对以上各证候荷瘤小鼠甲状腺等组织的基因进行了检测,本文重点报道邪毒壅盛证甲状腺独特上调与下调且表达量较高的基因.     

同病异证H22肝癌小鼠甲状腺AC-cAMP信号通路基因差异表达的特征

目的 观察同病异证H22肝癌小鼠甲状腺AC-cAMP信号通路基因差异表达的特征.方法 采用小鼠计量化四诊和辨证方法及GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array等技术,观察肿瘤邪毒证、气虚证甲状腺激素生成和释放相关AC-cAMP信号通路及相关基因表达特征.结果 ①一些基因相对关键,Tg和转录因子Pa...     

乳酸脱氢酶C4在早期邪毒壅盛证荷瘤小鼠肿瘤组织中的表达及意义

目的探讨乳酸脱氢酶C4(LDH-C4)在邪毒壅盛证荷瘤小鼠肿瘤组织的表达水平及其意义。方法采用Affy-metrix Gene Chip Mouse Exon 1.0 ST Array及其方法检测乳酸转运和氧化相关基因在H22荷瘤小鼠早期邪毒壅盛、早期气虚、中期阳气虚及中晚期气阴阳虚证肿瘤组织基因表达的差异,芯片重复两次;并采用实时荧光定量PCR对两种高乳酸亲和力的脱氢酶基因Ldhb和Ldhc在各种证候中的表达量进行检测。结果乳酸转运相关基因的表达要高于氧化相关基因,尤其以H22接种后早期最明显;Ldhb基因的表达在H22接种后早期、中期和晚期变化不明显,而Ldhc基因在H22接种后早期气虚、中期和晚期的表达也不明显,且与Ldhb表达量相近,但它在早期邪毒壅盛证荷瘤小鼠肿瘤组织中表达量显著升高。结论在荷瘤小鼠肿瘤组织中,尤其是H22接种后早期,肿瘤细胞产生的乳酸作用不仅在于氧化产能;LDH-C4可能代替LDH-B4参与了早期邪毒壅盛证荷瘤小鼠肿瘤组织缺氧肿瘤细胞的代谢拯救途径。     

正常与不同证候H22荷瘤小鼠肾上腺高表达的基因

目的:揭示正常与不同证候昆明种荷瘤小鼠肾上腺高表达的基因.方法:采用昆明种正常小鼠与腋下接种H22腹水瘤细胞的小鼠,取接种肿瘤后第8天(早期)邪毒壅盛证与气虚证、第21天(中期)阳气虚证、第29天(中晚期)气阴阳虚证荷瘤小鼠与正常对照组小鼠肾上腺,抽提RNA、纯化及Gene Chip Mouse Exon 1.0 ST Array检测.结果:筛选到402条高表达的基因,其中有1个及以上组别芯片读数计算值大于5 000的有88条.这些基因主要参与代谢和基因表达的调控,部分参与化学合成、化学加工修饰、运输和信号转导,以及部分参与免疫、细胞周期和细胞凋亡、发育:另有许多基因功能未知.结论:这些在正常与疾病小鼠肾上腺内持续且稳定表达的基因,可能对于维持肾上腺的正常生理功能具有重要的生物学意义;鉴于气虚证荷瘤小鼠这些基因大多表达量低于正常小鼠和同期的邪毒壅盛证小鼠,反映出气虚证候的本质及特征;再次,4个不同证候荷瘤小鼠肾上腺这些基因表达差异分别有集中的趋势,印证了中医学“同病异证“的理论及其本质,要求辨证论治.     

不同证候H22荷瘤小鼠肿瘤ABC转运蛋白家族基因转录特征

目的:观察不同证候H22荷瘤小鼠肿瘤组织ABC转运蛋白家族基因表达的特征。方法:对来源于早期邪毒壅盛和单纯气虚、中期阳气虚和中晚期气阴阳虚四种证候小鼠H22肿瘤组织4张Affymetrix GeneChip Mouse Exon 1.0 STArray数据标准化处理后,筛选其中的ABC转运蛋白基因进行差异分析。结果:从芯片中共筛选出与ABC转运蛋白有关的基因47个,以邪毒壅盛小鼠肿瘤基因转录最活跃,气虚次之,阳气虚最低;四种常见证候间共有25个基因转录具有明显差异;Abce1和Abcf1等7个基因中在四种常见证候肿瘤中转录水平最高。结论:Tap1(Abcb2)和Abcd2等6个高表达基因可能是邪毒壅盛型小鼠肿瘤增长快的重要因素;不同证候荷瘤小鼠肿瘤组织中的ABC转运蛋白基因转录既存在一定共性又存在很大差异,进一步证明了H22荷瘤小鼠证候客观存在的物质基础,为中医辨证论治提供分子依据。     

荷瘤小鼠常见证候在神经-内分泌-免疫网络组织基因转录的特征

目的:揭示邪毒壅盛证、气虚证、阳气虚证、气阴阳虚证等4个同病异证荷瘤小鼠在神经-内分泌-免疫网络组织差异转录基因的总体特征。方法:对2006和2009年2批实验所检测以上4个证候及正常对照小鼠下丘脑、垂体、肾上腺、睾丸、胸腺、脾脏等60张芯片,近100万个核心基因进行分析,观察其一致性上调或下调的基因数与量的特征。结果:肿瘤发生后脾脏、胸腺、睾丸等组织基因一致性差异表达的数量大,其次是垂体和肾上腺,与疾病的关系密切;早期气虚证荷瘤小鼠突出表现为下丘脑基因表达趋于活跃;而同期的邪毒壅盛证荷瘤小鼠则突出表现为肾上腺基因表达趋于抑制,这可能与该证候荷瘤小鼠预后差有关。结论:荷瘤小鼠同病异证在神经-内分泌-免疫网络组织转录组方面有其特征性的物质基础。     

不同程度邪毒证H22肝癌小鼠血液激素含量动态变化分析

目的 研究不同程度邪毒证肝癌小鼠血液激素含量动态变化的特点。方法 220只小鼠腋下接种H22肝癌腹水细胞,于接种后第9天筛选邪毒壅盛证与邪毒微弱证小鼠,另设正常组(30只)。分别在接种后第10、11天(第1、2时间窗口)处死小鼠,称量肿瘤和胸腺、脾脏湿重;ELISA法检测血浆促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质酮、醛固酮、睾酮、甲状腺激素T3与T4,以及TNF α、IFN γ含量,并对上述指标进行相关分析。结果 同一时间窗口,邪毒壅盛证小鼠肿瘤质量明显大于邪毒微弱证(P≤0.05)。与正常组比较,2个时间窗口的邪毒壅盛证小鼠胸腺明显萎缩(P≤0.05),而脾脏明显肿大(P≤0.05),血浆ACTH含量显著升高(P≤0.05),而邪毒微弱证ACTH升高幅度小;血浆醛固酮含量呈现类似ACTH的趋势。在第1时间窗口,2个邪毒证组血浆皮质酮含量均显著升高(P≤0.05)。邪毒壅盛证小鼠血浆睾酮与T4均呈下降趋势。2个邪毒证组小鼠血浆TNF α和IFN γ水平均呈现升高趋势。相关分析发现,邪毒程度分别与气虚程度和T4呈负相关(r=－0.766,－0.738,P≤0.05),与ACTH呈正相关(r=0.635,P≤0.05);气虚程度与阳热程度呈正相关(r=0.632,P≤0.05);ACTH与T4呈负相关(r=－0.504,P≤0.05),睾酮与TNF α呈正相关(r=0.619,P≤0.05)。结论 在H22肝癌小鼠疾病进展过程中,邪毒证会自然发生且表现出程度上的差异,不同程度的邪毒证小鼠神经内分泌激素的紊乱与免疫功能的抑制随病程的进展呈动态变化趋势。     

荷瘤小鼠虚证、实证垂体基因表达的差异

目的:揭示荷瘤小鼠实证与虚证垂体基因表达的差异.方法:采用四诊计量检测方法及计量辨证方法,运用GeneChipMouseExon1.0 STArray等技术,检测H22荷瘤小鼠早期邪毒壅盛证和气虚证、中期阳气虚证、中晚期气阴阳虚证共3阶段4个证候垂体基因表迭的差异,重点关注那些表达量大、差异显著的基因.筛选出邪毒壅盛证较其他三个证候一致上调或下调的基Igl.结果:筛选出邪毒壅盛较其他三证一致上调的基因121个.介绍了邪毒壅盛证芯片读数大于1500的9个基因:Gabra6、DOH4S114、Ales2、Pvalb、Plpl、Itprl、Narg2、LOC627016、Gpm6b;一致下调的基因340个.介绍了正常小鼠芯片读数大于1500的21个基因:Abpg、Pip、Dlkl、Car6、Eif3s5、Gnb2、Pcskln、Aplpl、S1c22a17、Dnpep、Rnfl87、IOC639100、Rablb、Aldh2、Pten、Tapbp、2310044H10Rik、Cxxc5、Gamdl、Renl、Lrpll.结论:H22荷瘤小鼠的实证与虚证.其垂体基因存在大量的表达差异.其中部分可能是实证与虚证的标志基因.     

H22荷瘤小鼠不同阶段及证候的甲状腺上下调高表达基因

目的:揭示荷瘤小鼠甲状腺不同阶段上下调高表达基因特征.方法:采用荷瘤小鼠及其标准化四诊及辨证方法,以及GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array等技术,检测H22荷瘤小鼠早期邪毒壅盛证和气虚证、中期阳气虚证、中晚期气阴阳虚证4个证候甲状腺上下调基因,重点关注那些高表达量的基因.结果:早期邪毒壅盛证和气虚证同时上调高表达基因1个即Ifi27,下调高表达基因2个即AY036118和Dub2a;中期阳虚证上调高表达基因25个,如Clec2g和Probe号6809296的基因等,下调高表达基因5个即Klklb27,Crispl,Fas,H2-Ea和GOs2;中晚期气阴阳虚证上调高表达基因1个即Miff,下调高表达基因3个即Spare,Col4al和Col3al.结论:部分基因表达量改变及功能特征呈现一定的趋势,如中期阳气虚证上调高表达基因数量明显多于早期及中晚期,且与细胞构造、运动、增殖、凋亡相关基因较多,推测可能与肿瘤发生相关,以上绝大部分基因,以往在甲状腺生理与病理研究中较少涉及.这些基因具体功能如何,及甲状腺在肿瘤发生中所起的作用,有待进一步研究.     

不同证候小鼠肾上腺皮质激素与细胞因子表达的关系

目的 研究细胞因子在不同证候小鼠肾上腺中的表达及其与血清皮质激素的关系。方法 采用实验小鼠及其标准化四诊及辨证方法,对60只正常小鼠与190只H22肝癌荷瘤小鼠予以辨证分型,用ELISA方法检测血清皮质酮、醛固酮含量,以及实时荧光定量PCR技术检测肾上腺细胞因子表达。结果 获得正常无证、正常气盛证、正常气虚证小鼠,以及邪毒壅盛证、邪毒居中证、邪毒微弱证、邪毒气虚证荷瘤小鼠。荷瘤小鼠血清皮质激素显著高于正常小鼠（P<0.05),荷瘤小鼠4个证候组间,以邪毒壅盛证升高最显著（P<0.05)。相对于正常小鼠而言,白细胞介素（IL)-1β、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12α、IL-12β和肿瘤坏死因子-α（TNF-α)等细胞因子在荷瘤小鼠不同证候中表达升高,仅IL-1α和IL-5在荷瘤小鼠中表达下降,而IL-13和转化生长因子-β1（TGF-β1)表达呈无规律性。其中IL-4与干扰素-α（INF-α)在正常与荷瘤小鼠肾上腺中均未检测到其表达。值得注意的是,邪毒程度越严重者,皮质酮与醛固酮水平及IL-6表达越高,而IL-1β、IL-2、IL-5、IL-12α、IL-12β、TNF-α表达越低。结论荷瘤小鼠血清皮质激素水平升高可能是在肿瘤慢性应激诱导下,部分细胞因子参与肾上腺皮质激素的合成与分泌,其中IL-6可能正向调控邪毒证荷瘤小鼠皮质激素分泌,而IL-1β、IL-2、IL-5、IL-12α、IL-12β、TNF-α则可能起到负性调控作用。     

不同证候小鼠下丘脑-垂体-甲状腺轴基因表达的特征

目的：观察不同证候小鼠下丘脑-垂体-甲状腺轴（HPTA）相关主要已知基因表达的特征。方法：采用小鼠计量化四诊和辨证方法、及GeneChip Mouse Exon 1.0 STArray等技术,观察正常偏气虚证小鼠、早期邪毒壅盛证和早期气虚证荷瘤小鼠HPTA相关基因表达差异。结果：（1）正常小鼠气虚证者,甲状腺机能减退,Atp1a1、Atp1a2、Atp1a3、Atp1b1、Atp1b2、Pax8、Tg、Tpo、NIS等与甲状腺素合成有关基因的表达水平一致下降;而垂体、下丘脑处于积极的代偿之中,TRH、TSH等激素表达增加。（2）肿瘤发生后的早期,荷瘤小鼠亦出现甲状腺机能的减退,垂体、下丘脑亦处于积极的代偿之中,TRH、TSH等激素表达增加。但是,该阶段邪毒壅盛证小鼠,垂体已出现失代偿的征兆,TSHb的表达量已显著低于同期的气虚证以及正常气虚小鼠。结论：甲状腺机能减退可能是气虚证发生的重要基础,而非下丘脑和垂体。荷瘤小鼠早期邪毒壅盛证垂体继发的失代偿表现,可能与该证候荷瘤小鼠带瘤生存期短、预后差有关。