牛核供体胚龄对核移植卵体外发育率的影响

本研究主要检测核共体胚龄对牛核移植卵体外发育率的影响，用体外受精后培养３．５－６．５日的胚胎卵裂球或培养７．５日的囊胚内细胞（ＩＣＭ）细胞与去核，并经电激活处理成熟的卵母细胞进行融合，融合卵与卵丘细胞体外共培养１０日，来自３．５－６．５日龄胚胎的卵裂球与去核卵母细胞的融合率（７８％－８８％）以及核移植卵发育至囊胚胎的体外发育率（６％－１０％）不受核供体胚龄的影响，然而，内细胞群细胞的融合率明显降低     

生产牛嵌合体的研究

本研究的目的是：（１）用日本黑牛精子与荷斯坦母牛卵母细胞受精和利木赞牛精子与日本红牛卵母细胞受精，通过体外胚胎聚合的方法，生产四品种嵌合体牛；（２）研究四品种嵌合公牛精子的繁殖力；（３）孤雌生殖牛胚胎的生产和体内与体外发育胚胎的成活率；（４）通过聚合从日本红牛获取的卵母细胞的孤雌生殖二倍体胚胎和用荷斯坦牛精子与荷斯坦母牛卵母细胞进行体外受精的胚胎，生产三亲本嵌合体牛。在第一组试验中，当采用显微手术     

牛胚胎的多代克隆

牛胚胎多代克隆的目的是通过重复细胞核移植产生大量的胚胎和牛犊。现已建立了一些重要的方法 ,例如 :采用体外成熟的卵母细胞为胞质受体 ;第二次减数分裂末期去核的先进技术 ;采用体外成熟、体外受精和体外培养形成的胚胎以及经冷冻保存的胚胎为核供体 ;核移植胚体外培养可发育至囊胚期 ;克隆胚可冷冻长期保存等。迄今已连续克隆 6代获得囊胚期胚胎 ,移入受体母牛产生了第 1至 3代的克隆牛。从 1枚牛胚胎通过 3代克隆获 43枚胚胎 ,通过 4代克隆获 54枚胚胎。由此可见 ,在不久的将来通过多代细胞核移植将实现牛胚胎克隆的商业性生产     

体外制备的牛胚胎移植后获得孪生犊牛

据Lu等(1987)报道,体外成熟和受精的牛卵泡卵母细胞在绵羊输卵管内培养一周后,多数胚胎发育到桑椹期和囊胚期。每头受体牛移植两枚这种胚胎,妊娠率达67％。本试验中—牛细胞胚培养到桑椹胚和囊胚的体外培养方法,使体外受精胚胎制造适于移植的牛胚的系统更方便了。在此之前,尽管用过各种培养基和培养方法作体外培养,但成绩不好。显然,胚胎在8细胞期时发育受     

牛核供体胚发育阶段对核移植卵发育率的影响试验

本试验以体外培养６８、９２、１１６、１４０小时的体外受精卵为核供体胚，以体外培养成熟的卵母细胞为核受体进行了核移植试验。结果获得了８２％－９６％的融合率；将融合后的核民牛输卵管上皮细胞共同培养，７３％－８７％发育至２细胞期胚；２２％－５３％的核移植卵发育至８细胞期胚；以１１６小时组发育率最高，１４０小时组发育率最低；核移植卵发育于囊胚的比率分别为１３％（１３／１０２）、３％（２／７１）、３５％（３     

海南黑山羊幼畜诱导卵泡发育与体外胚胎移植的应用研究

本研究旨在提高海南黑山羊幼畜诱导卵泡超数发育与体外胚胎移植扩繁后代的应用效率。比较了供体羔羊激素处理方案、羔羊卵母细胞体外成熟体系,并通过幼畜体外胚胎移植扩繁。结果发现,采用间隔12 h对供体羔羊连续6次等剂量肌肉注射FSH,在最后一次注射FSH的同时给予250 IU PMSG,获得的卵泡数、卵母细胞数以及体外受精后胚胎卵裂率均显著高于其他实验组。比较羔羊卵母细胞体外成熟体系发现,200 nM C型利钠肽预孵育4 h然后体外成熟26 h的羔羊卵母细胞,体外受精胚胎的卵裂率和囊胚形成显著优于常规成熟组和其他实验组。此外,通过幼畜体外胚胎移植获得了35只健康后代,平均产羔率达42.9%。综上,本研究对于开展JIVET技术体系在黑山羊种群扩繁的应用具有重要的意义。     

不同成熟时间对牛卵母细胞发育及去核效率的影响

本文研究了不同成熟时间对牛卵母细胞的体外成熟、体外受精及后期的体外培养的影响和不同成熟时间的极体出现率。结果表明,牛卵母细胞在成熟16h时极体出现率达69.3%、分裂率为54.7％、囊胚率仅为6.25%;而成熟24h时极体出现率达76.9%、分裂率为70.0%、囊胚率为27.7%,差异均显著（P＜0.05）。成熟16h的卵母细胞刚刚排出第一极体,细胞核与极体非常近,此时去核率较高;而成熟24h的卵母细胞核已远离第一极体。     

卵母细胞体外成熟能力及其影响因素

当前,虽然鲜胚移植已推广应用,鲜胚分割、冻胚分割和体外受精等技术正在发展,然而胚胎和成熟卵的来源却是一个严重问题。多年来,人们热衷于超排技术,期望用外源激素处理供体,以获得大量可以利用的胚胎或成熟卵,可是超排卵的质量低下,得到的卵子数也很有限,远远不能满足科研和生产的需要。近年来,越来越多的科学家致力于研究淘汰母畜或屠宰母畜的卵巢卵母细胞的体外成熟,以探索胚胎移植和胚胎生物工程所需的大量胚胎来源,使卵母细胞体外成熟的研究受到前所未有的重视。     

牛卵母细胞体外成熟培养时间对体外受精及早期胚胎体外发育的影响

本文报道了牛卵母细胞经不同时间体外成熟培养对其后体外受精及早期胚胎体外发育能力的影响。 实验用的母牛卵巢从附近的屠宰场收集。卵母细胞采用穿刺抽取法采集。将外观形态正常的卵母细胞随机分成6组,在含10％发情牛血清的TCM-199培养液中分别经12(G1)、16(G2)、20(G3)、24(G4、对照组)、28(G5)和32小时(G6)的体外成熟培养(IVM)后进行体外受精(IVF),早期胚胎(2-8细胞阶段)在采用卵泡颗粒细胞作为支持细胞的单层上皮细胞液滴中进行 复合培养至囊胚及孵化囊胚阶段。结果表明,经过12—32小时IVM的牛卵母细胞,在IVF后48小时检查,卵裂率均可达到81％以上(80.9％—91.9％);但IVM时间短至12小时(G1)及超过24小时(G5、G6)的卵裂率(分别为80.9％,83.5%和83.4％)显著地低于24小时的对照组(G4,91.9%,P>0.05)。     

培养液成分对胚胎体外发育的影响

牛体外受精、棱移植或转基因的早期胚胎需体外培养到桑椹胚或囊胚后才能非手术移植到受体母牛受孕。本文综述了体外培养液中能量培养基,血清、牛血清白蛋白（BSA）和聚乙烯醇（PVA）,生长因子、胞浆因子和细胞外基质分子,pH值,EDTA、NaN3和2,4-二硝基苯酚等对胚胎体外培养的影响。     

用无蛋白质培养液培养牛卵母细胞

许多实验室通常以体外成熟、体外受精(IVM/IVF)的牛卵母细胞中获得桑椹胚及囊胚。然而,培养液中仅添加血清时,大多数胚胎在8～16细胞期或之前停止发育。用含有卵丘细胞或输卵管单层细胞的培养液培养,可以克服这种发育阻断。另一方面,输卵管细胞在无细胞培养液,典型的有TCM-199,加血清中培养24～48小时后,同输卵     

一种可能替代超排的牛胚生产新方法

虽然多年来都是利用非手术方法从超排供体牛回收胚胎,但是,这些方法费用高,并且不能总是生产出满意数量的可移植胚胎。 未成熟的牛卵母细胞可以在体外成熟和受精,并且可在保姆母羊的输卵管内或者在体外与输卵管细胞混合培养时发育成桑椹胚或胚囊(Goto等,1988;Lu等,1988)。如果能从不管发情周期天数的同一母牛反复收     

生长因子对牛卵母细胞体外成熟、体外受精及其体外发育的影响

本研究主要检测α-转移生长因子(TGF-α)及其他生长因子的交互作用对卵母细胞体外成熟及其体外受精后体外发育的影响。从屠宰场收集卵巢,并回收卵母细胞,与生长因子共同培养。然后,通过体外受精和受精卵体外发育培养来检验是否生长因子可提高卵母细胞发育的潜力。本研究共检测了4651枚卵母细胞。试验结果表明,α-转移生长因子可增加卵母细胞发育的潜力,这一作用是通过卵丘细胞的传递进行的。此外,α-转移生长因子和类似胰岛素生长因子的交互作用显著性地增强卵母细胞的发育潜力。然而,β-转移生长因子和表皮生长因子对牛卵母细胞的发育无显著性影响。结果表明,牛卵母细胞体外发育不仅需要一般性的化学物质、氨基酸、维生素,而且需要生长因子进行自身调节。     

小鼠体外受精、胚胎培养及胚胎快速冷冻的研究

本文系统研究了小鼠受精卵的体内发育与运行规律 ,卵母细胞的体外成熟与受精、单细胞胚胎培养及胚胎快速冷冻 ,结果如下 :①注射hCG后 1 2～ 2 0h受精卵发育至原核期 ,42～ 48h为 2 -细胞期 ,48～ 6 0h为 4-细胞期 ,6 0～ 6 8h为 8-细胞期 ,以上各期受精卵均处于输卵管中 ;75～ 78h为桑椹胚 ,78～ 80h为致密桑椹胚 ,90～92h为早期囊胚 ,92～ 96h为囊胚 ,以上各期均处于子宫角中 ;②培养液中添加激素 ,能显著提高卵母细胞的体外受精率 ,添加FCS和激素组的体外受精率又显著高于单独添加激素组 ,FCS还能显著提高胚胎发育率 ;③在培养液中添加EDTA ,能有效克服小鼠胚胎的 2 -细胞阻断 ,其 2 -细胞胚的发育率达 1 0 0 % ,8-细胞胚的发育率达55%以上 ;牛、羊上皮细胞培养上清也能有效克服 2 -细胞阻断。添加乳酸钠和丙酮酸钠可使 2细胞与 8细胞的发育率显著提高 ;④以D -PBS +甘油 +蔗糖为冷冻液 ,以D -PBS +蔗糖为稀释液 ,对小鼠胚胎进行快速冷冻 ,桑椹胚的存活率为 6 9.3% ,早期囊胚的存活率为 6 0 .4%。以上研究为建立小鼠胚胎库提供了基础     

应激反应与饲养方式对新疆褐牛青年母牛超排效果的影响

在拴养和散养新疆褐牛青年母牛的超排中,两组的平均回收卵数差异显著(P=0.02),有效胚胎率,差异不显著(P=0.12).拴养供体有效胚胎率为58.48％,自由采食供体为54.88％.结果表明,应激反应与饲养方式对超排反应影响较大,但对平均有效胚胎率影响不大.     

活体采集卵母细胞技术的研究

在过去体外胚胎生产所用的卵母细胞大多来源于屠宰母畜卵巢上的卵母细胞,但随着胚胎生物技术,尤其是胚胎体外生产、冷冻保存、转基因和克隆技术的发展,卵母细胞的需求量越来越大,屠宰场已不能满足需要,人们开始把目光转向活体采卵(OPU)。本文主要是介绍了活体采集卵母细胞的方法、影响因素及现状。     

牛卵母细胞体外成熟,体外受精培养的胚胎玻璃化冷冻试验

牛卵母细胞体外成熟、受精后，培养７天，选择一级桑椹胚、囊胚和膨胀囊胚进行玻璃化冷冻试验胚解冻增大 Ｍｅｎｅｚｏ－Ｂ２液中根据胚胎复原率和孵充率说明：（１）一步平衡玻璃化冷冻的胚胎在ＦＥＳ液中平衡１分钟较适宜；（２）胚胎玻璃化 的效果与胚胎发育阶段密切相关；（３）添加ＢＯＥＣ细胞Ｍdisplay status     

牛胚胎发育早期MnSOD,Glut-1,Hsp70,IGF-II,IFN-t基因表达差异的研究

目的:研究体外受精生产的牛胚胎在发育早期各个阶段MnSOD,Glut-1,Hsp70,IGF-II,IFN-t基因的表达差异,阐明体外培养胚胎发育阻滞和胎儿发育异常的分子机理和胚胎阻滞有关的目的基因,为完善体外培养系统、提高IVP胚胎质童和确保IVP后代正常发育提供理论依据.方法:提取体外生产的不同阶段牛胚胎总RNA,以β-actin基因为内对照,用半定童RT-PCR技术检测胚胎发育各时期MnSOD,Glut-1,Hsp70,IGF-Ⅱ,IFN-t基因在mRNA水平的表达情况.结果:在卵母细胞中,MnSOD及IFN-t基因呈高表达,Glut-1,Hsp70及IGF-II呈低表达;在8-16细胞、桑葚胚及囊胚中,MnSOD及IGF-II基因呈高表达,而Glut-1,Hsp70及IFN-t基因则呈低表达.     

家畜早期胚胎的体外发育

本文概述了近年来家畜早期胚胎体外发育方面的研究进展,着重探讨了早期胚胎体外发育阻断期与胚胎基因组的激活、细胞周期对早期胚胎发育的调节、能量代谢机理与培养基的改进,不同家畜早期胚胎的体外共同培养系统以及输卵管与其它生长因子的作用。 随着胚胎工程的深入研究和商业性胚胎移植的迅猛发展,对胚胎尤其是牛胚胎需求量日益增加。目前除了超数排卵以外,体外受精技术是又一条获得胚胎的主要途径。但后者需要适宜的培养系统,使受精卵体外发育到囊胚(或桑椹胚)期,以便进行非手术移植;而判断培养方法本身的成功与否通常也是以能否发育到囊胚期来衡量的。因此,建立适宜的体外培养系统,无论是在生产上还是在科研领域都具有十分重要的意义。 早期胚胎的体外培养系统比较复杂,其中对胚胎存活起关键作用的成分有温度、湿度、光、pH值、渗透压、离子浓度、能量来源、血清成分(大分子和未确定的生长因子)、气象水质及培养器皿等。由于早期胚胎体外发育时存在着“发育阻断”现象,因此仅采用无血清的特定培养基很难有效地促进早期胚胎的发育。目前,在哺乳动物尤其牛上进行了大量的研究,一般都是采用与其他细胞共同培养的方法来促进早期胚胎的体外发育,但仍存在着下列问题:(1)囊胚发育率低,在牛上仅能达到授精卵     

牛体外受精卵核移植技术的研究

将采自屠宰场的牛卵巢中的卵母细胞以TCM-199+10％FCS培养成熟,用0.1％的透明质酸酶将卵丘细胞除去,以10微克/毫升的细胞松弛素B处理胚胎后,用固定在显微操作器上的微吸管将卵母细胞透明带内第一极体下面的细胞质吸去一部分,然后将取自体外受精后发育至8细胞期胚胎的卵裂球注入去核卵母细胞的卵周隙之中,将移入卵核的卵母细胞置于融合液中并施以110V,40微秒的脉冲刺激后,将胚胎移入TCM-199+5％OCS的培养液中培养,以观察胚胎的融合率及发育率。结果表明,核移植胚的融合率为71.1%(27/38),发育为2-8细胞期的胚胎占培养的核移植胚胎总数的42.3％(11/26),其中有1枚胚胎发育至桑椹胚阶段。