H1N1亚型流感病毒血凝素Th和B细胞表位预测及抗原性分析

目的:应用生物信息学方法预测H1N1亚型流感病毒血凝素Th和B细胞相关抗原表位,并初步分析其抗原性,为研制H1N1亚型流感病毒的表位疫苗奠定基础.方法:依据近年流感病毒流行趋势,从GenBank下载具有代表性的H1N1亚型流感病毒HA蛋白氨基酸序列.进行生物信息学综合分析预测,获得Th和B细胞相关抗原表位,并比较其保守性和特异性.通过Balb/c小鼠H1N1亚型流感病毒阳性血清与表位肽的结合试验,初步鉴定候选表位抗原性.结果:综合多项预测及空间构像模拟结果,我们获得了三条候选Th和B细胞表位,分别为HA_(73～87)、HA_(125～139)、HA_(188～205).候选表位处于H1N1亚型流感HAI蛋白序列上相对保守的区域内,且与目前流行的H1N1亚型流感病毒HA相应区域具有较好的一致性.而不同候选表位在BMB/e小鼠H1N1亚型流感病毒阳性血清反应中显示了不同抗体结合能力,预示了其成为功能表位的可能.结论:所筛选的表位具有成为H1N1亚型流感病毒HA Th和B细胞相关抗原表位的可能.此研究为深入揭示流感病毒感染与免疫机制,H1N1亚型流感功能表位认知及表位疫苗研究奠定了基础.     

丙型肝炎病毒多表位疫苗研究的新进展

丙型肝炎病毒引起慢性肝脏疾病的主要原因之一,HCV疫苗一直是研究的热点.多表位疫苗是指通过筛选与组合优势抗原表位(包括T细胞、B细胞表位)的新型核酸疫苗,目的在于产生高效的细胞免疫和体液免疫应答进而清除病毒.其优势在于通过选择最具免疫保护潜力的表位以覆盖尽量多的病毒亚型和诱导机体全面的抗病毒免疫应答.现就近年来国内外在丙型肝炎病毒多表位疫苗的研究做一介绍.     

HIV复合多表位DNA疫苗的设计及免疫研究

目的　设计新型HIV复合多表位DNA疫苗 ,探讨其在小鼠体内的免疫应答。方法以HIV抗原表位为基础进行新型HIV多表位DNA疫苗的抗原分子设计 ,利用化学合成的方法合成全新HIV抗原基因 ,并构建核酸疫苗重组质粒 ,免疫BALB c小鼠 ,利用合成的表位肽进行抗体水平、特异性淋巴细胞增殖实验、特异性CTL检测分析及迟发性超敏反应。同时 ,还对所设计的HIV复合多表位DNA疫苗与编码HIV全结构蛋白的DNA疫苗 (pVAXI gag gp12 0 )进行特异性CTL反应的比较研究。结果　所设计的新型HIV多表位DNA疫苗可在BALB c小鼠体内诱导出针对所选表位的强表位特异性的CTL反应和抗体反应。而HIV复合多表位DNA疫苗与编码HIV全结构蛋白的DNA疫苗相比可诱导产生更强、更广泛的表位特异性的CTL应答。结论　所设计的HIV复合多表位DNA疫苗对BALB c小鼠具有良好的体液和细胞免疫原性     

A型H3579亚型流感多表位核酸疫苗小鼠实验免疫研究

目的为了应对流感流行多亚型并存的局面,进行了多表位核酸疫苗设计,并观察其免疫小鼠的细胞和体液免疫应答反应。方法设计并合成了含有H3、H9的HA和H5N1NA中和表位,M、NP基因保守序列CTL表位的多表位基因盒(Epi)。采用pVAX载体对H5HA、H7HA及Epi进行融合表达。经肌肉注射免疫6～8周龄雌性Balb/c小鼠,ELISA法检测小鼠血清中的针对H3579亚型流感抗体。三免后2周,分离脾淋巴细胞,进行T淋巴细胞转化试验和T淋巴细胞亚类数量检测。结果免疫小鼠获得了针对H3579亚型流感的体液和细胞免疫反应。结论完整HA抗原结合多表位的DNA疫苗模式的成功,预示了该DNA疫苗可能可以有效应对当前多种亚型流感并存的局面,并为其他种类流感疫苗的研究奠定了基础。     

H3、H5、H7、H9亚型流感病毒通用多表位核酸疫苗构建及表达研究

目的构建表达A型流感病毒多种表位的核酸疫苗，并研究其在幼仓鼠肾细胞（BHK细胞）内表达产物的生物学活性。方法筛选流感病毒主要抗原（HA、NA、NP、M）表位基因，以生物信息学软件优化其排列结构，合成流感通用的复合多表位基因（Epi），以H5、H7亚型流感病毒HA融合表达基因为骨架，将多表位基因Epi插入构建H7HA-Epi-H5HA阅读盒，定向克隆至pVAX1，构建抗A型流感H3579亚型的pVAX1-H7HA-Epi-H5HA。最后将该重组质粒转染BHK细胞，提取细胞总RNA，以RT-PCR方法检测目的基因；以间接免疫荧光试验（IFA）初步测其表达产物抗原性。结果RT-PCR检测到目的基因；IFA检测到特异性荧光存在。结论本试验所构建的重组质粒pVAX1-H7HA-EpiH5HA，在真核细胞内均获了有效地转录和表达；而且其表达产物均能与相应的抗体特异性结合，证明了其具有一定的生物学活性和抗原性，有望成为抗多种A型流感病毒的通用核酸疫苗。     

H3、H5、H7、H9亚型流感病毒通用多表位重组鸡痘病毒构建

目的 构建表达H3、H5、H7、H9亚型流感病毒通用多表位重组鸡痘病毒活载体疫苗候选株.方法 筛选流感病毒主要抗原(HA NA NP M)优势抗原表位基因,以生物信息学软件优化其排列结构合成流感多表位基因(Epi),以H5、H7 HA融合表达基因为骨架,将多表位基因插入构建H7HA-Epi-H5HA阅读盒,定向克隆至鸡痘病毒表达载体pUTA-2复合启动子(ATI-P7.5×20)下游,构建重组鸡痘病毒中间转移载体pUTA-2-H7HA-Epi-H5HA.应用脂质体介导的转染法,将该重组鸡痘病毒中间转移载体与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经BrdU进行3次加压筛选挑斑纯化后传代,并对重组以鸡痘病毒进行PCR和IFA检测和Western blot分析.结果 成功构建了重组鸡痘病毒中间转移载体pUTA-2-H7HA-Epi-H5HA,PCR、IFA和Western blot检测阳性.结论 筛选出稳定共表达H5H7HA基因和通用多表位基因的重组鸡痘病毒vUTA2-H7HA-Epi-H5HA株,该重组鸡痘病毒的构建为跨种通用型流感病毒活载体疫苗的研究奠定了物质基础.     

H1亚型流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备及部分特性鉴定

目的:制备针对H1亚型流感病毒HA蛋白的单克隆抗体(mAb),并分析其反应特性。方法:分别以2009年甲型H1N1、季节性A1流感病毒裂解疫苗为免疫原,常规法免疫、融合、克隆化,获得各抗原特异性mAb。应用ELISA、HI试验和Western blot等技术研究mAb的反应性和特异性。结果:获得稳定分泌抗H1亚型流感病毒HA蛋白的杂交瘤细胞97株。其中株特异性mAb39株,29株具有HI活性;亚型特异性mAb7株,5株具有HI活性;2009年流行株与季节性A1、A3流行株共同抗原的mAb16株,9株具有HI活性;针对流感病毒共同抗原mAb35株,22株具有HI活性。结论:两种疫苗均具有较好的免疫原性和免疫保护活性,这些mAb的获得为流感病毒株特异、亚型特异性诊断试剂盒及流感病毒通用诊断试剂盒的制备提供了实验资料,为进一步研究H1N1流感病毒HA的抗原表位奠定了基础。     

甲型流感病毒H3N2抗原进化研究进展

流感病毒是引起人类呼吸道感染的常见病原体。在4种季节性流感毒株中, 甲型流感病毒H3N2感染已成为季节性流感疾病和死亡的主要原因, 严重影响公共卫生和社会经济。自1968年首次出现并造成大流行后, H3N2一直在人群中反复流行, 不断通过抗原漂移来逃避宿主免疫系统的攻击, 从而导致低疫苗效力。本文从甲型流感病毒H3N2的抗原进化、抗原进化对疫苗株选择的影响及一些预测流感病毒进化的模型等方面进行分析和综述, 为流感病毒抗原进化分析和未来疫苗研发等工作提供参考。     

流感病毒RNA聚合酶蛋白PB1在小鼠中可诱导亚型间交叉免疫保护

目的探索流感病毒RNA聚合酶PB2和PB1亚基作为实验性流感疫苗候选抗原的可能性.方法以复制型质粒（pSCA）为载体分别构建表达甲1型和甲3型流感PB2和PB1的复制型DNA疫苗,免疫小鼠后分别用甲1型流感病毒（A/PR/8/34）进行鼻腔攻击,观察针对不同亚型流感病毒的复制型DNA疫苗的免疫保护效果.结果本实验所构建的复制型DNA疫苗在真核细胞中均可表达外源基因;本实验采用的复制型质粒载体（pSCA）与传统质粒载体（pcDNA3）在诱导小鼠产生抗体方面无差异,并且都诱导了偏向TH1类的免疫反应;表达甲1型和甲3型流感PB1基因的复制型DNA疫苗均可保护小鼠抵御甲1型流感病毒（A/PR/8/34）的攻击.结论表达甲型流感病毒PB1的复制型DNA疫苗能保护小鼠抵御同型和异型流感病毒的攻击,本实验为流感疫苗研究提供新的候选抗原.     

乙型肝炎病毒多表位抗原基因的设计、合成及表达

目的　设计合成乙型肝炎病毒多表位抗原基因并在大肠杆菌中表达 ,以期获得兼具预防和治疗作用的新型乙肝疫苗。方法　设计并合成一条乙型肝炎病毒 (HBV)多表位抗原基因 (P T) ,该基因包括HBV前S2区的核苷酸序列 ,和分别来自乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原、乙型肝炎DNA聚合酶的其它 4个连续的HLA限制性抗原表位的核苷酸序列。基因合成后克隆入载体质粒pWR4 5 0 1,转化大肠杆菌BL2 1,IPTG诱导P T基因与载体质粒的 β 半乳糖酐酶基因融合表达。结果　成功合成并拼接出乙型肝炎多表位抗原基因P T ,阳性重组子PWR HBV P T构建成功 ,并在大肠杆菌中融合表达出相对分子质量 (Mr)约 75× 10 3的碱性蛋白质。结论　初步设计成功HBV多表位抗原基因 ,在大肠杆菌中可表达出具有良好抗原性的重组融合蛋白 ,可能是较理想的HBV预防、治疗性疫苗候选物。     

甲型流感病毒核蛋白和基质蛋白2胞外域融合mRNA疫苗在小鼠体内的免疫应答研究

目的:基于脂质多聚复合物(lipopolyplex, LPP)递送平台和保守抗原开发的新型流感病毒mRNA疫苗在小鼠体内的免疫原性评价。方法:将4个拷贝的甲型流感病毒基质蛋白2胞外域(extracellular domain of matrix 2 protein,M2e)与核蛋白(nucleoprotein,NP)编...     

诱导杀伤性T细胞反应的恶性疟疫苗研究进展

杀伤性Ｔ细胞（ＣＴＬ）是恶生疟红前期免疫反应的关键环节。本文主要就利用ＭＨＣ分子结合肽基序确定ＣＴＬ表位进行综述，并围绕如何克服ＣＴＬ的ＭＨＣ限制性，对多抗原成分疫苗的设计、多表位疫苗的设计和ＭＨＣⅠ类分子结合亚型和共用肽段等的研究进行了探讨。     

诱导杀伤性T细胞反应的恶性疟疫苗研究进展

杀伤性Ｔ细胞（ＣＴＬ）是恶性疟红前期免疫反应的关键环节。本文主要就利用ＭＨＣ分子结合肽基序确定ＣＴＬ表位进行综述，并围绕如何克服ＣＴＬ的ＭＨＣ限制性，对多抗原成分疫苗的设计、多表位疫苗的设计和ＭＨＣⅠ类分子结合亚型和共用肽段等方面的研究进行了探讨。     

多CTL表位DNA疫苗诱导特异性CTL应答的研究

目的:构建多CTL表位DNA疫苗诱导特异性CTL应答。方法:将编码两个HCVCTL表位(H-2d)的基因序列插入真核表达载体pcDNA3.1中,构建多CTL表位DNA疫苗。用其免疫BALB/c小鼠后,以经不同CTL抗原肽冲击的P815细胞(H-2d)作为靶细胞,进行CTL杀伤试验。结果:多CTL表位DNA疫苗可诱导机体产生针对其编码的两种HCVCTL表位的特异性CTL免疫应答,且总的特异性CTL杀伤效应增强。结论:通过天然侧翼氨基酸相连的多个CTL表位为编码序列构建的多CTL表位DNA疫苗,不但能诱导机体产生针对各个CTL表位的特异性CTL应答,而且各特异性CTL应答的联合作用可显著增强总的CTL杀伤效应。     

四价流感病毒亚单位疫苗配伍RFH01佐剂在小鼠体内的免疫原性研究

目的评价四价流感病毒亚单位疫苗配伍RFH01佐剂在小鼠模型中的免疫原性。方法按照《中国药典》2020年版(三部)的方法对4种单价流感病毒亚单位疫苗原液进行鉴别试验。在研究配伍RFH01佐剂的四价流感病毒亚单位疫苗小鼠模型中, 采用随机分组法将460只雌性6～8周龄BALB/c小鼠分为实验组、疫苗对照组、阴性对照组和空白组, 共46组, 每组10只。在研究四价流感病毒亚单位疫苗在老年和青年小鼠模型中, 采用随机分组将80只雌性10月龄和80只雌性10周龄BALB/c小鼠同时分为单价流感病毒疫苗、四价流感病毒亚单位疫苗、四价流感病毒亚单位疫苗+RFH01佐剂组、鸡胚四价流感病毒裂解疫苗对照组和PBS组, 共16组, 每组10只。均采用肌内注射免疫, 初次免疫21 d后, 采血分离血清, 并用相同程序和剂量进行加强免疫, 第42天采血分离血清。血凝抑制试验检测小鼠血清抗体水平。结果两次免疫后, 所有配伍RFH01的疫苗组阳转率均达到100%, 且血清抗体效价几何平均滴度(geometric mean titer, GMT)显著高于不含佐剂的疫苗组。配伍RFH01佐剂的单价流感病毒疫苗和四价流...     

以CTL表位为基础的高效疫苗的分子设计及其效应机制

随着抗原表位及基因免疫的研究进展，以各种病原体的特异性抗原表位为基础所开展的基因疫苗研究取得了长足的进步。本文综述了以CTL表位为基础，通过辅以协同刺激分子基因、细胞因子基因作为基因佐剂或给目的抗原设计一“向导序列”或“得力助手”等方法所进行的高效疫苗的分子设计。     

H1N1流感病毒血凝素B细胞抗原表位的鉴定

目的利用计算机模拟和ELISA阻断实验研究流感病毒血凝素(HA)B细胞抗原表位,建立病原微生物表位检测新方法。方法以2009年H1N1流感病毒裂解疫苗作为免疫原,采用常规杂交瘤融合、筛选技术制备单克隆抗体(mAb),应用ELISA、血凝抑制试验(HI)及Western blot法鉴定获得mAb的特性。以获得的mAb为工具,联合应用ELISA阻断实验和计算机模拟方法预测H1N1流感病毒的B细胞抗原表位。结果获得4株抗H1N1流感病毒HA抗原的mAb,通过ELISA阻断实验将HA的B细胞抗原表位分为两类,通过计算机模拟预测发现4株抗体能与HA上的两类表位相结合。结论计算机模拟和ELISA阻断实验的结果一致,建立了用于预测其他病原微生物表位的新方法。     

国产流行性感冒病毒疫苗免疫原性研究的meta分析

目的 评价国产流行性感冒(简称流感)病毒疫苗的免疫原性.方法 通过文献检索搜集2012年9月前发表的有关国产与进口流感病毒疫苗免疫原性比较研究的文献,利用Stata10.0软件进行meta分析.结果 共有20篇符合标准的文献纳入本研究.结果显示:国产流感病毒疫苗B型抗体阳转率显著高于进口流感病毒疫苗(P=0.036,RR=1.036,95％ CI:1.002～1.070),未发现国产流感病毒疫苗3个亚型的保护率及H1N1和H3N2抗体阳转率与进口流感病毒疫苗存在显著差异(P＞0.05).进一步的亚组分析发现:国产流感全病毒灭活疫苗B型抗体阳转率(P=0.024,RR=1.040,95％CI:1.005～ 1.077)及保护率(P=0.031,RR =1.059,95％CI:1.005～1.116)、H3N2抗体(P=0.019,RR=1.053,95％ CI:1.009 ～1.098)保护率均显著高于进口流感病毒疫苗.结论 国产流感病毒疫苗具有较好的免疫原性.     

1992-2012年中国H3N2亚型流感病毒选择压力分析

目的 分析1992-2012年中国H3N2亚型流感病毒所受选择压力,并探讨选择压力与各个抗原类毒株流行情况的关系.方法 对1992-2012年中国的H3N2亚型流感病毒(n=1206)进行抗原类流行和整体选择压力分析,同时对这21年来所有毒株的HA1进行位点正选择压力分析.结果 表明所有H3N2亚型流感病毒在这21年间共有4个位点受到正选择作用,整体选择压力的变化随着不同抗原类毒株的交替而变化,21年间共发现3个选择压力谷底年,与新抗原类的出现相关.结论 整体选择压力从谷底年上升时,新的抗原类出现并在人群中流行,此时是更换疫苗株的最佳时机.     

2018-2019年辽宁省甲型流感病毒流行株HA基因进化与疫苗株匹配度分析

目的分析辽宁省2018-2019年甲型流感毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因,计算并评估流行株与疫苗株的匹配度。方法选取2018-2019年49株甲型流感毒株进行测序,对HA基因进行进化分析;研究抗原表位、糖基化位点及受体结合位点变异情况;采用Pepitope模型对流行株与疫苗匹配度进行分析。结果2018-2019年流感流行季为11月份至次年3月份,主要流行型别为新甲型H1N1亚型。经进化分析,新甲型H1N1流行株属于6B.1分支,与当年疫苗株属于同一分支;季节性H3N2毒株分布在3C.2a分支上,与2018-2019年疫苗株处于同一分支,但2019-2020年疫苗株位于3C.3a分支。部分毒株在抗原表位及受体结合位点上发生了突变。若干毒株与疫苗株相比,糖基化位点发生了增加或缺失,并未出现新的糖基化位点。使用Pepitope模型对疫苗效力从分子水平进行评估,本年度新甲型H1N1流感疫苗效力及2019-2020年疫苗株预测效力均能达到较为理想的效果。但是季节性H3N2疫苗株与本年度流行株匹配度低,计算出的疫苗效力半数以上为负值。2019-2020年H3N2亚型疫苗株效力有待进一步观察。结论2018-2019年辽宁省甲型H1N1流行株发生了一定程度的变异,H3N2亚型流行株与2018-2019年疫苗株匹配度低。应密切关注流行株的基因变异情况并及时更新疫苗株。