减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)宿主-载体平衡致死系统的构建及其生物学特性研究

目的:开发应用于猪的稳定携带异源基因的口服活疫苗载体。方法:本研究在减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcya C78-1的基础上,运用自杀性质粒pREasd介导的细菌同源重组技术,构建缺失株ΔcrpΔcyaΔasd C78-1,再将携带asd基因的互补质粒p YA3493电转至上述菌株,构建ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493)宿主-载体平衡致死系统,并进一步研究其生物学特性。结果:PCR及测序结果共同表明ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493)构建成功。生物学特性检测结果表明ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493)的血清型与亲本株ΔcrpΔcya C78-1和疫苗株C500相同,并能够稳定遗传缺失型asd基因片段;其生长速度略慢于ΔcrpΔcya C78-1,且二者均明显慢于疫苗株C500;其生化特性结果也与ΔcrpΔcya C78-1基本相同。小鼠口服攻毒试验表明ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493)的毒力与ΔcrpΔcya C78-1基本相当,但其半数致死量约为疫苗株C500的412倍。结论:上述结果表明,减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493)有潜力作为高效表达外源基因的口服活疫苗载体。     

临床分离产气克雷伯菌整合子和质粒介导的喹诺酮耐药基因分布特征分析

目的确定临床分离菌株产气克雷伯菌整合子、质粒介导的喹诺酮耐药(PMQR)基因的分布, 并分析整合子与临床常用抗菌药物耐药性的关系。方法收集2015年11月至2021年3月上海市奉贤区中心医院分离自临床样本中的产气克雷伯菌91株, PCR筛查第1、2类整合酶基因(intI1、intI2), 分析启动子类型和可变区基因盒组成结构。同时对分离株PMQR基因进行检测, 并分析整合子与临床常用抗感染治疗药物间的关系。结果 91株产气克雷伯菌对氨曲南耐药率>40.00%, 对其余常用抗菌药物耐药率均<35.00%。91株产气克雷伯菌中30株检出intI1, 未检出intI2。第1类整合子检出7种可变区基因盒组合, 在产气克雷伯菌中检出基因盒组合aac(6′)-11C-ΔereA2-IS1247-aac3-arr-ΔereA2。第1类整合子可变区启动子以活性较弱的PcH1启动子为主。intI1阳性菌株与intI1阴性菌株在ICU、神经外科和临床其他科室的检出率差异有统计学意义(P<0.05)。intI1阳性菌株对部分临床常用抗菌药物耐药率明显高于intI1阴性菌株(P<0.0...     

头孢他啶/阿维巴坦对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的体外抗菌活性研究

目的 研究头孢他啶/阿维巴坦(CZA)对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)的体外抗菌活性并检测其相关耐药基因,为临床治疗CRKP提供参考依据.方法 选取2017年1月至2019年12月北京中医药大学东方医院临床分离的257株CRKP菌株,应用VITEK MS微生物质谱仪和VITEK-2 Compact微生物药敏分析仪进行菌种鉴定和药敏分析,用K-B法检测CZA的药物敏感性.采用碳青霉烯酶抑制剂增强试验对CRKP菌株进行产酶表型检测.通过NG-Test CARBA 5对耐CZA的CRKP菌株进行相关耐药基因检测.结果 257株CRKP菌株对CZA的耐药率为7.8％,对哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉维酸、头孢哌酮/舒巴坦、头孢呋辛、头孢他啶、头孢曲松、头孢西丁的耐药率均为100％,头孢吡肟97.2％、左氧氟沙星97.1％、阿米卡星48.5％、庆大霉素76.4％、复方新诺明46.5％、替加环素35.5％.碳青霉烯酶抑制剂增强试验结果显示,CRKP菌株耐药主要以产丝氨酸酶为主.20株耐CZA的CRKP菌株中,产KPC 11株,产OXA-481株,产IMP 1株,产NDM 4株,既产KPC又产NDM 2株,不产碳青霉烯酶1株.结论 CZA对CRKP菌株有较强的抗菌效果,抗菌活性明显优于临床常用抗菌药物.CZA体外药敏试验可在临床常规开展,为临床治疗CRKP提供更多的参考.     

耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌脂多糖修饰相关的多黏菌素耐药机制研究

目的探讨耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)脂多糖修饰相关的多黏菌素耐药机制。方法通过接合转移和mcr基因的检测探究是否存在质粒介导的耐药基因;利用实时荧光定量PCR检测多黏菌素耐药相关基因的相对表达量, 并进行全基因组测序分析;采用SDS-PAGE银染试验和MALDI-TOF-MS质谱分析检测脂多糖的改变。结果未扩增出mcr-1～8基因且接合转移试验结果为阴性, 未检测到与耐药性相关的可移动元件。7株多黏菌素耐药CRKP中pmrA、pmrB、pmrC基因的相对表达量均增高, 其中6株phoP/phoQ基因的相对表达量增高;3株crrA/crrB基因的相对表达量降低;4株mgrB基因的相对表达量降低。耐药株发生的错义突变位点主要位于KPHS₀9430、KPHS₃5900、KPHS₃9520、KPHS₅2420等基因上, 在CRKP-6菌株中检测到ISKpn14插入序列。MALDI-TOF-MS观察到耐药菌株脂多糖中天然脂质A有L-Ara4N修饰。结论染色体介导的双组分调节系统突变引起脂多糖修饰是本研...     

HIV-1 Tat调控MCAK基因启动子活性及作用位点的鉴定

目的研究HIV-1 Tat对MCAK启动子活性及基因表达的抑制作用,并鉴定Tat与MCAK启动子的作用位点。方法利用原核表达的Tat蛋白处理A549细胞,通过Western印迹技术验证HIV-1Tat对MCAK基因表达的抑制作用;构建MCAK启动子-荧光素酶载体,转染A549细胞,通过荧光素酶活性分析Tat对启动子活性的调控作用;运用染色质免疫沉淀法(CHIP)分析Tat与MCAK启动区的相互作用,并进一步通过凝胶阻滞实验(EMSA)确定Tat与MCAK启动区的结合位点。结果 Western印迹实验证实Tat对MCAK表达具有强烈的抑制作用;荧光报告质粒检测系统分析表明在Tat存在的情况下,MCAK的核心启动子活性受到明显的抑制,其效应具有明显的剂量依赖性;CHIP和EMSA实验确定Tat蛋白与MCAK基因启动子区的直接相互作用,MCAK基因-337～-232区域存在Tat蛋白的结合位点。结论 HIV-1 Tat对MCAK基因表达具有强烈的抑制作用,并与Tat蛋白结合于MCAK启动区-337～-232区域,从而导致MCAK启动子活性降低有关。     

减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔsseK1Δasd宿主-载体平衡致死系统的构建及其生物学特性研究

目的:为构建减毒鼠伤寒沙门菌分泌性蛋白K1缺失株平衡致死系统,并将其开发为能够稳定携带外源基因的活疫苗载体。方法:利用重组自杀性质粒(pREΔasd)介导的等位基因交换技术,以减毒鼠伤寒沙门菌株SL1344Δsse K1为亲本株,运用二步法筛选asd基因缺失株SL1344Δsse K1Δasd。将携带有asd基因的无抗性p YA3493质粒电转至上述缺失菌株SL1344Δsse K1Δasd,构建SL1344Δsse K1Δasd(p YA3493)重组菌株。结果:PCR及测序结果表明SL1344Δsse K1Δasd(p YA3493)构建成功。进一步研究表明重组菌株SL1344Δsse K1Δasd(p YA3493)血清型和强毒株SL1344及亲本株SL1344Δsse K1相同,且能稳定遗传缺失后的asd基因;其生化特性和生长速度与强毒株SL1344及亲本株SL1344Δsse K1相比均无明显差异。小鼠毒力试验表明,SL1344Δsse K1Δasd(p YA3493)口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD50为5.24×108CFU,毒力较强毒株SL1344约下降至0.048%;免疫保护效力试验显示,运用鼠伤寒沙门菌野生毒株对免疫后第17天的小鼠攻毒有62.5%的保护率,与亲本株SL1344Δsse K1基本一致。结论:以上结果表明,鼠伤寒沙门菌分泌性蛋白K1缺失株宿主-载体平衡致死系统构建成功,且遗传稳定,毒力明显降低,具有较好的免疫原性,为深入研究以鼠伤寒沙门菌为载体的口服多价疫苗奠定基础。     

血流感染碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的耐药特征及机制研究

目的 探讨无菌血标本分离碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)的耐药机制及分子分型.方法 测定32株CRKP最低抑菌浓度(MIC),mCIM和eCIM法检测碳青霉烯酶;PCR法检测耐药基因;多位点序列分型(MLST)进行分子分型;RT-PCR检测膜孔蛋白OMPK35/36基因相对表达情况.结果 药敏试验显示32株CRKP...     

猪链球菌2型98HAH33基因0267的功能研究

目的对猪链球菌2型菌株98HAH33基因0267进行功能研究。方法比较猪链球菌2型野生株98HAH33、突变株Δ0267及回复株CΔ0267在不同生长时期的生长速率,细菌黏附、全血杀伤及巨噬细胞吞噬试验比较对宿主的黏附和抗吞噬能力,仔猪试验比较在毒力方面的差异。结果野生株、突变株及回复株生长速率一致;野生株对宿主细胞A549、Hep2、HBMEC的黏附率分别是突变株的2.59、4.87和3.08倍,回复株对宿主细胞A549、Hep2、HBMEC的黏附率分别是突变株的2.65、4.65和2.86倍;野生株、突变株和回复株1~3 h在全血中的存活率分别是36.91%、28.12%和41.61%,58.44%、44.06%和58.26%,93.02%、70.08%和95.85%;小鼠巨噬细胞RAW264.7吞噬试验结果显示RAW264.7吞噬野生株、突变株及回复株的菌量分别为2767、5322、2567;仔猪竞争感染试验证明基因0267与猪链球菌2型98HAH33的毒力相关。结论猪链球菌2型98HAH33基因0267与细菌黏附和抗吞噬相关,是一个新毒力因子。     

郑州地区70株红霉素耐药B群链球菌分子特征及耐药基因研究

目的研究郑州地区妊娠晚期妇女携带红霉素(ERY)耐药B群链球菌(group BStreptococcus, GBS)的耐药表型、分子分型及耐药基因, 为GBS感染的预防、控制和治疗提供基础数据。方法回顾性收集了河南省妇幼保健院2021—2022年妊娠晚期妇女生殖道分泌物分离获得的86株GBS菌株, 使用纸片扩散法筛选出ERY耐药的GBS菌株, 对其进行10种抗菌药物敏感性试验;全基因组测序确定其分子分型、克隆群分型、耐药基因等分子特征;比较不同克隆群携带耐药基因情况。结果筛选出70株ERY耐药的GBS, 7.14%(5/70)的菌株对大环内酯-林可酰胺-链阳菌素B (macrolide-lincosamide-streptogramin B, MLSB)具有诱导型耐药(inducible MLSB, iMLSB)表型, 84.29%(59/70)的菌株具有结构型耐药(constitutive MLSB, cMLSB)表型, 8.57%(6/70)菌株具有对大环内酯类耐药林可酰胺类敏感(macrolides resistance and lincosamide susceptibilit...     

杭州地区临床和食品来源德尔卑沙门菌耐药特征与基因组分析

目的了解杭州地区临床和食品来源德尔卑沙门菌的耐药特征, 并进行溯源分析。方法对2015—2020年杭州地区分离的60株德尔卑沙门菌进行药敏分析、脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型和全基因组测序, 并下载公共数据库基因组进行比较;利用测序数据对菌株进行多位点序列分型(MLST)、核心基因组多位点序列分型(cgMLST)和耐药基因扫描, 并构建基于单核苷酸多态性(SNP)位点的系统发育树。结果杭州地区德尔卑沙门菌临床株和食品株对28种药物的耐药率差异均无统计学意义, 多重耐药率为76.7%(46/60);所有菌株均检出氨基糖苷乙酰转移酶基因aac(6′)-Iaa和磷霉素耐药基因fosA7;60株德尔卑沙门菌共分为46种PFGE带型、53种cgMLST(HC2)型别, 除1株为ST3220型外, 其余均为ST40型;基于439株德尔卑沙门菌(包括60株杭州菌株和379株公共数据库菌株)SNP位点构建的系统发育树显示:部分杭州菌株与东南亚菌株进化距离较近, 提示可能存在跨境传播, 食品株主要来自猪肉和水产类;其他杭州菌株与北京、广州、湖北、重庆等省市的菌株距离较近, 提示可能存在跨省传播, 食品株...     

大肠杆菌O157∶H7呼吸系统调控蛋白FNR对三型分泌系统调控的研究

目的 了解大肠杆菌O157∶H7 FNR(fumarate nitrate reduction,富马酸硝酸盐还原)对三型分泌系统(type Ⅲ secretion system,T3SS)表达的影响.方法 本研究采用λRed重组技术,利用PCR产物,通过Bet(a ssDNA annealing protein,ssDNA退火蛋白)和Exo(a5'→3'dsDNA exonuclease,5 '→3' dsDNA外切酶)蛋白促进同位交换的方法,成功构建了fnr突变株.结果 虽然细胞黏附结果显示,与野生株相比,缺失株的黏附力并没有明显下降.但是T3SS的蛋白图谱显示fnr突变株中蛋白分泌量有明显下降.结论 推测可能是fnr基因敲除后导致高浓度的ClpXP(caseinolytic protease X&P,酪蛋白水解酶X&P)引起GrlA(global regulator of LEE activator)蛋白的降解,从而导致LEE(locus of enterocyte effacement)表达的下降,造成T3SS蛋白分泌量的下降.     

ATF6调控生殖相关基因HSPA1L表达的分子机制

目的 探究内质网应激活化转录因子6(ATF6)对生殖相关基因热休克蛋白A1样蛋白(HSPA1L)表达的影响并初步阐明其调控分子机制。方法 在人胚肾细胞系HEK-293T中转染ATF6过表达质粒,RT-qPCR和Western blot验证过表达效率;利用雄性ATF6敲除小鼠睾丸组织转录物组测序信息,筛选ATF6下游5个生殖相关基因;双荧光素酶报告基因实验选择启动子活性较高的下游基因并检测过表达ATF6对其启动子活性的影响;通过gene-regulation预测ATF6和下游基因启动子可能的结合位点;RT-qPCR和Western blot检测在HEK-293T细胞中过表达ATF6对于下游基因表达的影响;利用凝胶迁移实验(EMSA)确定ATF6与下游基因启动子是否结合。结果 转染后HEK-293T细胞中ATF6的mRNA(P<0.001)和蛋白(P<0.05)表达水平明显升高。转录物组测序及双荧光素酶报告基因实验筛选出ATF6下游的生殖相关基因HSPA1L。ATF6能够促进HSPA1L的截短启动子活性(P<0.001)。过表达ATF6后,HSPA1L的表达量明显升高(P...     

基因组发掘策略指导铁载体类化合物的发现

目的利用基因组发掘策略指导铁载体类化合物的发现。方法首先,在获得灰产色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)CPCC 200274全基因组序列的基础上,利用antiSMASH对其编码的潜在次级代谢产物生物合成基因簇进行生物信息学分析,通过Blastp比对,判断该菌株中是否存在铁阻遏蛋白(Dmd R1)同源基因,并借助于MEME、FIMO等软件寻找包含Dmd R1蛋白结合位点(iron box)的基因簇,则该基因簇可能为铁载体类化合物的生物合成基因簇;其次,摸索合适的发酵条件,利用实时定量RT-PCR(q RT-PCR)技术检测相关生物合成基因的表达水平;最后分离纯化目标铁载体类化合物,验证此基因组发掘策略的可行性。结果利用antiSMASH从灰产色链霉菌CPCC 200274基因组中发现了5个含有iucA_C基因、标注为铁载体的生物合成基因簇。Blastp比对提示该菌株基因组中存在Dmd R1的同源蛋白SGC5642,可能参与铁载体类化合物生物合成的调控。结合MEME、FIMO软件分析结果,5个含iucA_C的基因簇中只有cluster 29含有iron box序列,推测cluster 29可能编码铁载体类化合物。根据以上信息,利用q RT-PCR方法确定了该基因簇表达的发酵条件,分离纯化获得了3个铁载体类化合物,经结构鉴定分别为去铁敏B,去铁敏E和N1-羟基-N1-琥珀酰基尸胺。结论以基因组发掘策略为指导,从微生物基因组中发现铁载体类化合物生物合成基因簇和铁阻遏蛋白结合位点,并通过qRT-PCR方法在转录水平确定目标基因簇的方法,成功获得3个铁载体类化合物。该策略为解决目前antiSMASH对于铁载体类化合物生物合成基因簇预测的局限性和该类化合物基因簇的快速定位、新生物合成元件的发掘提供了新思路,为新结构铁载体类化合物的寻找及合成生物学改造奠定了基础。     

三种检测常见碳青霉烯酶型方法的评估研究

目的评估mCIM联合eCIM试验、Carba-5和Carba-R三种方法检测碳青霉烯类耐药细菌(carbapenem-resistant organisms, CRO)中常见碳青霉烯酶型的性能。方法随机挑选2019年1月至2020年12月浙江大学医学院附属邵逸夫医院临床分离的122株非重复CRO菌株, 应用生物梅里埃MALDI-TOF MS全自动快速质谱仪对菌株进行菌种鉴定, 分别采用改良碳青霉烯类抗生素灭活试验(mCIM联合eCIM试验)、Carba-5检测条和Carba-R试剂盒对所有菌株进行碳青霉烯酶型检测;以PCR法检测结果为金标准, 评价上述3种检测方法的性能。结果 122株CRO菌株属于12个不同菌种, PCR法碳青霉烯酶型检测结果:共112株检测结果阳性, KPC-2型阳性70株, 占57%(70/122), 其中肺炎克雷伯菌46株, 铜绿假单胞菌12株, 其他菌株12株;OXA-232型阳性19株占15%(19/122), 均为肺炎克雷伯菌;NDM型阳性20株占16%(20/122), 其中NDM-1型阳性7株和NDM-5型阳性13株, 以大肠埃希菌为主(12/20);...     

精氨酸调节蛋白 ArgR 调控铜绿假单胞菌Ⅵ型分泌系统表达

目的 研究精氨酸调节蛋白 ArgR 对铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa, PA) 中Ⅵ型分泌系 统 (type Ⅵ secretion system, T6SS) 相关基因表达的调节作用。 方法 构建带有 SUMO 标签的 ArgR 蛋白表 达载体, 利用大肠埃希菌 DH5α 异源表达铜绿假单胞菌 ArgR 蛋白。 采用凝胶电泳迁移 ( electrophoretic mobility shift assay, EMSA) 实验探究 ArgR 与 T6SS 相关基因 hsiA2 启动子的相互作用; 构建带有 Flag 标签 的 Hcp2-Flag 表达载体, 利用蛋白质免疫印迹实验和 qRT-PCR 技术检测 argR 基因对 T6SS 结构基因 hcp2 的 调控。 结果 通过酶切去标签, 得到可溶性的 ArgR 蛋白; EMSA 结果显示 ArgR 和 hsiA2 启动子有结合。 Western 印迹和 qRT-PCR 实验结果表明在 argR 缺失的突变体中 hcp2 的表达量明显升高, 回补 argR 后, hcp2 的表达量可以补回至野生型的水平。 结论 研究表明 ArgR 能结合 hsiA2 启动子并负调控 T6SS 相关基因的 表达。     

产KPC酶肺炎克雷伯菌对多黏菌素异质性耐药及治疗策略的研究

目的:通过对产KPC酶肺炎克雷伯菌(CRKP)进行多黏菌素耐药性研究,探讨多黏菌素的合理使用及治疗策略.方法:在本院收集分离产CRKP菌72株,通过药敏实验、改良Hodge试验、耐药基因检测和微量棋盘稀释法观察产KPC酶肺炎克雷伯菌的分布、药敏程度、阳性率、耐药性及多黏菌素B抑菌程度.结果:72株CRKP菌中来自神经内...     

肠道定植肺炎克雷伯菌临床特征和生物膜形成能力分析

目的 研究本院住院患者肺炎克雷伯菌肠道定植情况以及定植菌生物膜形成能力。方法 收集2020年1月至12月于本院住院患者的粪便标本中分离到的肺炎克雷伯菌,分析肺炎克雷伯菌的临床特点。采用VITEK-2全自动微生物分析系统检测菌株的耐药性。结晶紫染色法测定菌株的生物膜形成能力。PCR法检测生物膜相关毒力基因。结果 435例粪便标本共分离到92株肺炎克雷伯菌,定植率为21.1%。其中,碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)60株,碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌(CSKP)32株。定植菌的生物膜阳性率92.4%,CRKP生物膜形成能力要显著高于CSKP(P<0.05)。定植菌对生物膜相关毒力基因的携带率高,luxS、wzm、wbbm和wzc的检出率分别为97.8%、82.6%、65.2%和65.2%。结论 肠道定植菌以CRKP为主,耐药率高,生物膜阳性率高且生物膜形成能力高于CSKP。     

单核细胞增生李斯特菌毒力基因aroA启动子上阻碍PrfA转录调控元件的研究

目的 研究食源性致病菌单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,简称LM)毒力基因启动子的结构特点及其与转录调控因子PrfA(positive regulatory factor A)蛋白之间的关系.方法 选取plcA和aroA两个毒力基因启动子作为研究对象,plcA基因启动子(PplcA)上含有一个高度保守的PrfA蛋白结合序列TYAACAAATGTFAA(PrfA-box)和-10区(TAAGAT),其转录表达受PrfA强调控;aroA基因不受PrfA调控,所利用的启动子ParoA1为非依赖于PrfA的肩动子,但是在紧邻ParoA1的下游区域却含有一个与PplcA相似的PrfA-box(TTAAAACATGTTAA)和一个-10区(TTTAAT),该区域疑似为依赖于PrfA的启动子,被命名为ParoA2.应用PCR定点突变和SOEing PCR(重叠区扩增基因拼接法)技术互换了PplcA和ParoA2上可能影响PrfA蛋白结合以及诱发转录起始相关的碱基序列,构建了一系列PplcA-ParoA2杂合突变启动子,并插入到无启动子的lacZ报告基因上游,使lacZ基因的表达置于突变启动子下.获得的启动子融合表达质粒分别电转化入LM野生株P14、PrfA蛋白高表达突变株Pl4a和prfa基因等位缺失突变株A42中,检测相应的β-半乳糖苷酶活性以确定杂合突变启动子是否具有依赖PrfA的转录活性及其水平高低.结果 当肩动子上影响PrfA转录调控的两个核心元件PrfA-box与-10区的距离保持在最适的22或23个碱基时,交换PplcA和ParoA2上的两个相应核心元件的碱基序列并不改变启动子的转录活性.但是,当PplcA上的两个核心元件之间的碱基以及-10区下游的序列被相应ParoA2上的序列所替代后,PplcA依赖于PrfA的转录活性完全丧失,反之,ParoA2上的这两段序列如果被PplcA的序列所替换,ParoA2则表现出依赖于PrfA的转录活性.结论 ParoA2的-10区及其下游的序列可能形成发夹结构,阻碍RNA聚合酶-PrfA蛋白复合物结合到解旋的单链模板DNA上生成具有转录起始活性的开放复合物,从而抑制了ParoA2依赖于PrfA的转录活性的表达.     

结肠癌细胞HCT116中p53的R213突变对靶基因p21表达的影响

目的确定在结肠癌细胞系中,p53的213位精氨酸突变后对其下游靶基因p21表达的影响。方法在p53缺失的结肠癌细胞系HCT116~(-/-)中转染p53的R213位突变的质粒;荧光素酶双报告基因系统检测p53靶基因启动子活性;EMSA检测p53与其靶基因p21的结合能力;real-time PCR和Western blot检测p53下游靶基因p21的表达。结果 p53蛋白213位精氨酸突变为赖氨酸后,明显降低了p53靶基因的启动子活性(P0.05);与靶基因p21启动子的结合能力明显降低(P0.05);并抑制了p21基因的表达(P0.05)。而213位突变为谷氨酰胺后,迁移率比突变前明显变快。结论在人的结肠癌细胞中,p53蛋白R213位的不同突变对下游靶基因p21有不同的影响,提示存在着不同的调控机制。     

志贺菌临床分离多重耐药株mar基因突变研究

目的 研究志贺菌mar基因突变与其多重耐药的关系.方法 对54株临床分离的志贺菌进行四环素、氯霉素、氨苄西林、环丙沙星、诺氟沙星等5种药物的药敏试验和有机溶剂耐受实、验(OST),对其,mar基因的marOR区进行聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)及核酸序列分析.结果 筛选出35株多重耐药株,多重耐药率为64.8%.54株志贺菌株中有38株对有机溶剂耐受,其中有33株为多重耐药株,3株为单耐药株,仅有2株为敏感野生株.54株志贺菌临床分离株均扩增出MAR基因,未发现该基因缺失株,SSCP分析发现,35株多重耐药株中marOR基因突变率为14.29%.核酸测序分析发现志贺菌多重耐药株marO区基因1376-1379处4个碱基缺失,导致其后编码氨基酸出现移码突变,而标准株S51250和敏感野生株不存在该移码突变;marR区基因存在10处点突变,第1752碱基(G→A,Gly→Ser)和第1854碱基(T→c,Tyr→His)两处点突变导致编码氨基酸改变,但该突变也同时存在于标准株和敏感野生株中,余者均为无义突变,且有些核苷酸改变也发生于敏感野生株或同时存在于多株菌株中.结论 ,marO区基因突变可能是志贺菌多重耐药的调控机制之一.