高致病性禽流感H5N1病毒研究进展

1997年8月发现首例人禽流感病例以来,不断有人禽流感病例发生,截至2007年3月1日,WHO报道的经实验室确证的H5N1禽流感感染者共277例,死亡167例,死亡率超过50％。目前WHO对禽流感的预警是3级,即是一种新的流感亚型,已经在人类中引起严重疾病,但还没有在人类中持续传播流行。本文就目前H5N1禽流感病毒来源,跨越物种传播的机制,致病力决定因素及人间传播能力等几个关键的基础问题研究进展进行综述。     

人感染高致病性禽流感病毒H5N1核酸检测方法的建立及应用

目的 建立人感染高致病性禽流感病毒H5N1的核酸检测方法,用于人感染高致病性禽流感病毒疑似病例临床标本的检测.方法 针对甲型流感病毒保守基因M设计RT-PCR和real-time PCR引物检测是否为甲型流感病毒,同时针对H5N1禽流感病毒设计针对H5和N1基因的特异性RT-PCR和real-time PCR引物作亚型检测,建立禽流感H5N1病毒RT-PCR和real-time PCR检测方法.结果 本研究建立的RT-PCR和real-time PCR方法可以特异性地检测H5N1病毒,并且与人流感病毒H1、H3没有交叉反应.RT-PCR检测方法灵敏度可到1TCID50,real-time PCR灵敏度可达0.01TCID50.利用上述方法检测人感染高致病性禽流感病毒H5N1疑似病例临床标本,从42例不明原因肺炎病例中检测出阳性标本13例.结论 本研究建立的RT-PCR和real-time PCR方法可以用于人感染高致病性禽流感病毒H5N1临床标本的实验室检测.     

中国大陆首例人感染高致病性禽流感病毒(H5N1)病例的实验室诊断

目的 对2005年10月湖南省湘潭市湘潭县发生的一名不明原因肺炎病例进行实验室检测,以确定导致该病例的主要病因.方法 采集病例呼吸道标本以及血清标本,对呼吸道标本利用分子鉴别诊断技术以及RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测病毒核酸;通过血凝抑制试验以及微量中和试验检测血清中的特异性抗体.结果 该病例所有的呼吸道标本H5N1病毒特异性核酸及病毒分离均为阴性.红细胞凝集抑制及微量中和实验显示,恢复期血清较急性期血清H5N1特异性抗体阳转并且有4倍以上增高.结论 通过实验室检测结果分析,该病例为中国大陆第一例人感染高致病性禽流感病毒（H5N1）实验室确诊病例.     

高致病性人禽流感H5N1疫苗滴鼻免疫应答效果的初步研究

目的 通过高致病性人禽流感H5N1全病毒-MF59佐剂疫苗滴鼻免疫Balb/c小鼠,评价该疫苗所诱导的系统免疫与黏膜免疫应答效果.方法 以不同剂量抗原按比例与MF59佐剂配伍制成粘膜疫苗,滴鼻免疫Balb/c小鼠,二免2周采血检测血清IgG、IgM效价及血清中HAI(HA inhibitor)的中和抗体效价,同时收集鼻、肺灌洗液,检测其lgG和slgA抗体效价.结果 H5NI+MF59组血清抗体效价较H5NI组有显著升高(P＜0.01);在各剂量组中,随着剂量的增加抗体效价呈上升趋势.12μg腭后抗体效价呈下降趋势,以HSNI+MF59(12μg)组效价最高;肺鼻灌洗液中,均可检测到特异性分泌型IrA、IsG,其中特异性分泌型IgA效价略高于IgG;抗体亚型的分布以IgG1、IgG2b为主.结论 灭活高致病性禽流感全病毒H5N1在佐剂MF59作用下可诱导机体产生体液免疫应答,同时还可以在黏膜局部产生特异性分泌型IgA、IsG,为高致病人禽流感病毒I-15N1黏膜疫苗的研制奠定了基础.     

我国分离人H5N1禽流感病毒血凝素基因特性的研究

目的 分析我国分离的人高致病性禽流感H5N1病毒的抗原性以及基因特性.方法 对所分离的H5N1病毒的血凝素基因和神经氨酸酶基因进行序列测定.结果 对血凝素基因的序列测定结果表明从我国分离的H5N1病毒具有较高的同源性,但是与越南、泰国等国家分离的H5N1病毒明显不同.序列测定的结果同时表明无论是受体特异性还是连接肽都是禽源的.结论 目前我国分离的H5N1病毒属于同一个组,与泰国、越南分离毒株不同,并且发现病毒的特性仍然是禽源的,没有发现从禽到人的重组或者重配。     

广东地区人禽流感H5N1毒株的核蛋白基因变异和进化

目的通过对人禽流感H5N1毒株核蛋白（NP）基因序列的变异分析，揭示毒株NP基因变异与进化。方法检测广东地区人禽流感H5N1毒株NP基因核苷酸序列，同时检索全球人禽流感H5N1毒株NP基因序列，采用DNAStar5．0软件对检索的人禽流感H5N1毒株NP基因核苷酸序列进行比对和分析；并结合流行病学资料对变异毒株进行进化速度分析。结果1997--2006年45株毒株胛基因核苷酸序列同源性分成3类，1997--1998年毒株为第1类，2004--2005年毒株为第2类，2003年毒株和2006年毒株为第3类；NP基因35个氨基酸位点全部置换，占7．03％（35／498）；2003—2006年H5N1毒株通过氨基酸第430位（1〈430T）位点的置换，增加一个糖基化位点（NGT430-432；GD—01—06毒株第370位发生N3加S变异；增加一个糖基化位点（NES368.370）。同义变异中，NP基因Ks（同义变异速度）值为2．03×10^-5～2．55×10^-5核苷酸／d，Ka（错义变异速度）值为1．58×10^-6～3．10×10^-6核苷酸／d，检验发现进化无明显选择性压力存在。结论1997--1998年毒株、2004--2005年毒株、2003年毒株和2006年毒株NP基因核苷酸有差异；2003--2006年人禽流感H5N1毒株NP基因增加一个糖蛋白位点、GD-01—06毒株再增加一个糖蛋白位点可能改变毒株抗原性。人禽流感H5N1毒株在自然界变异频繁，随着其自然进化，H5N1毒株具有人．人传播能力的概率较大。     

1株对小鼠呈高致病性H5N1亚型禽流感病毒的遴选

目的观察从死禽体内分离的禽流感H5N1病毒株对小鼠的致病情况,筛选一株可用于小鼠攻毒实验的H5N1毒株。方法将17株禽源H5N1病毒分别滴鼻感染6～8周龄Balb/c小鼠,观察其对小鼠的致病和致死情况。通过测定其中毒力较强一株的EID_(50)、TCID_(50)、小鼠LD_(50)及濒死小鼠不同组织中病毒载量,判定其致病力;采用遗传进化分析绘制HA基因进化树,了解其进化特征。结果动物实验表明,17株高致病性禽源H5N1毒株中,仅有一株对小鼠为高致病性。该毒株TCID_(50)/100μl=7.2,EID_(50)/100μl=8.325,小鼠1 LD_(50)/100μl=6.318≈10~2EID_(50)。鼻粘膜感染4～6 d小鼠发病,表现为精神萎靡、食欲减退、竖毛、弓背等临床症状,体重明显减轻。小鼠死亡集中在发病后的2～5 d,耐过死亡者12 d完全恢复正常。从濒死感染小鼠脾、肺、鼻及脑组织中皆可检出流感病毒NS片段,病毒数载量以脑组织中最多,达3.56×10~(10)拷贝/5μl。结论筛选到一株对小鼠呈强致病性H5N1亚型禽流感毒株,可以用于禽流感疫苗交叉保护效果评价的小鼠攻击实验,也可以作为感染模...     

禽流感H5N1型病毒对NIH小鼠的致病敏感性研究

目的观察禽流感H5N1型病毒对NIH小鼠的致病性。方法将NIH小鼠随机分为接毒组（20只）和对照组（10只）,在负压感染实验室,接毒组于乙醚麻醉后给予AIVH5N1型病毒滴鼻,对照组予正常阴性尿囊液滴鼻,观察14d,记录小鼠的体温、体重、临床症状、死亡情况、病理变化、肺指数及抗体变化。结果NIH小鼠感染禽流感H5N1型病毒后第1天就出现精神不振,病程主要集中在第3—7天,临床症状主要表现为弓背、蜷缩、竖毛、颤抖、反应迟钝、活动减少、爱扎堆,体重（下降）出现减轻,体温降低,死亡率为40％;接毒组死亡小鼠肺指数为（2．21±0．40）,较对照组的（0．44±0．23）明显增高,差异有统计学意义（P〈0．01）;肺组织病理严重改变,第8天才能检出抗体（OD值等于0．231）。结论禽流感H5N1型病毒对NIH小鼠有一定的致病性。     

特异结合人禽流感病毒H5N1的scFv分子性能鉴定

目的 从人源化噬菌体抗体库(human single fold scFv libraries I+J)中筛选到能高亲和性、特异结合人禽流感病毒H5N1的单链抗体,为建立H5N1快速筛查试剂和人源化治疗单抗奠定基础.方法 以H5N1病毒的血凝素(hemagglutitin,HA)蛋白和核蛋白(nucleoprotein,NP)为目的 蛋白,对上述单抗噬菌体文库以亲和性为原理进行筛选,经过3轮筛选富集后,随机挑选了96个噬菌体克隆扩增培养,ELISA法挑选能特异性、高亲和性结合目的 蛋白的噬菌体克隆,并换用HB2151宿主菌对阳性单链抗体克隆进行可溶性表达,ELISA法鉴定可溶性单链抗体的结合活性,PCR扩增阳性克隆的轻、重链基因片段,并对阳性单链抗体分子测序和序列分析.结果 经过3轮筛选,分别从96个噬菌体克隆中挑选到了两株能特异结合NP蛋白、3株能特异结合HA蛋白的单链抗体,PCR扩增都得到了长为300、302和935 bp的轻链、重链和轻链-连接片段-重链的基因片段,测序结果分析发现上述5条单链抗体片段在轻链的47、49、50、51、53、54、56、96、97、98和99位的氨基酸组成不同,而特异结合NP蛋白的单链在重链区域氨基酸组成完全相同,而特异结合HA蛋白的单链在重链的44、47、85、86、87、88和89位氨基酸组成不同.结论 从噬菌体抗体库中筛选到的特异结合HA和NP蛋白的单链抗体片段,可为进一步研发H5N1快速筛选试剂和人源性治疗抗体奠定基础,也可为鉴定HA和NP蛋白中的抗原决定簇提供结构信息.     

抗H5N1禽流感病毒VHH抗体库的构建

目的:构建抗H5N1禽流感病毒的小羊驼免疫噬菌体重链可变区抗体库(VHH型抗体库),为抗H5N1的VHH抗体筛选奠定基础。方法:利用H5N1灭活疫苗免疫小羊驼,一定免疫时间后测定小羊驼外周血清中抗体中和活性,分离其外周淋巴细胞,利用RT-PCR方法得到VHH抗体片段。通过优化连接和电转化方法,将足量VHH片段与pCANTAB5E连接后电转入大肠杆菌TG1,获得VHH抗体基因库;检测基因库库容以及多样性,并采用血凝抑制试验对噬菌体抗体库进行初步功能性鉴定。结果:利用H5N1灭活疫苗免疫小羊驼四次后,其外周血清中抗体血清抑制效价可达1∶2 560,构建的VHH抗体基因库库容可达3×108,随机挑选14个抗体基因克隆进行测序鉴定,结果显示均为独立克隆,表明所建抗体库多样性好。上述基因库经辅助噬菌体拯救后,得到抗H5N1的噬菌体VHH型抗体初级库,对初级库进行血凝抑制试验,结果呈阳性,表明初级库中存在具有潜在中和活性的抗H5N1抗体。结论:结果表明,已成功构建抗H5N1禽流感病毒的小羊驼免疫噬菌体重链抗体库,为进一步筛选抗H5N1禽流感的重链抗体打下良好基础,并为H5N1的早期临床诊断和治疗提供新的手段。     

流感及H5N1亚型禽流感病毒液相检测芯片的制备

目的 建立利用液相芯片技术检测甲、乙型流感和H5N1亚型高致病性禽流感病毒的方法,并对该方法进行评价。方法 对GenBank中甲型流感病毒的NP、乙型流感病毒的HA以及高致病性禽流感病毒（H5N1）的H5、N1基因片段序列进行同源性比对,根据保守序列,设计针对各基因的简并引物和寡核苷酸探针,制备探针偶联微球,将样本核酸多重PCR扩增产物与微球进行杂交,以Bio-Plex液相芯片检测系统进行芯片检测。结果 该方法可以对甲型流感病毒的NP基因、乙型流感病毒的HA基因以及高致病性禽流感病毒（H5N1）的H5、N1基因同时进行检测,病毒核酸的最低检出量为1pg,检测特异性高。结论 成功构建了甲、乙型流感病毒和H5N1亚型高致病性禽流感病毒液相芯片检测系统,为流感、禽流感的快速检测、诊断奠定了基础。     

广东省2例城市型人感染高致病性禽流感（H5N1）病例的流行病学调查

目的通过对2例城市人禽流感病例的流行病学调查、分析，探讨无直接病死禽暴露情况下的可能感染来源，为进一步防控禽流感提供科学依据。方法采用现场流行病学、血清学调查的方法；荧光定量PCR、ELISA、RT—PCR和应急监测等方法进行调查、诊断。结果2例感染高致病性禽流感病毒（H5NI）确诊病例未发现有明确病死禽接触史，但发病前到过甚至多次到过农贸市场；密切接触者中没有发生不明原因肺炎病例，未发现人一人传播证据。结论2例人感染高致病性禽流感病例均属城市型感染个案，非人传人病例，感染来源可能与农贸市场环境有关。     

感染H5N1病毒恒河猴大脑的病理学观察

目的H5N1禽流感病毒与1918年大流感病毒基因序列的高度相似表明该病毒对人类构成巨大威胁,本文主要观察H5N1禽流感病毒对恒河猴大脑影响。方法恒河猴5只,年龄2～3岁,经环甲膜穿刺接毒105TCID50/ml7ml,取大脑行苏木精-伊红(HE)染色和免疫组化观察。结果和对照组11号猴比较,实验组猴出现神经元萎缩,噬神经元现象,局部坏死和血管套现象。结论H5N1禽流感病毒导致恒河猴大脑损害,出现非化脓性脑炎,进一步证实了H5N1禽流感病毒对哺乳类日渐适应并且表现出越来越强的神经毒性。在今后的临床治疗中要重视H5N1病毒引起脑炎的预防和治疗。     

整合深圳人源H5N1禽流感病毒株血凝素蛋白的假型逆转录病毒的构建

目的 构建整合深圳人源H5N1禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)株血凝素(HA)的假型逆转录病毒.方法 利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增深圳人源H5N1禽流感病毒株HA基因,将扩增产物与pGEM-T载体连接,在经过酶切及测序鉴定后,通过Sal Ⅰ与BamHⅠ酶切位点将HA基因克隆至真核表达载体CMV/R,然后协同转移载体pHR-Luc、包装载体pCMV&8.2通过磷酸钙共沉淀法转染人胚肾细胞(293T),72 h后收集假病毒上清,超速离心后通过Western blot鉴定假病毒颗粒HA、P24蛋白的表达,同时测定HIV-HA假病毒对犬肾传代细胞(MDCK)、宫颈癌上皮细胞(HeLa)、中国仓鼠卵母细胞(CHO)和293T等4种不同细胞株的感染活性.结果 深圳人源HSN1禽流感病毒株A/Shenzhen/406H/06属于subelade2.3,其HA基因开放读码框编码567个氨基酸,在GenBank登录号为EF137706.经Sal Ⅰ与BamH Ⅰ双酶切鉴定HA基因成功克隆至真核表达载体CMV/R.将pHR-Luc、pCMV&8.2、CMV-HA共转染293T细胞后,所收集的假病毒经Western blot证实假病毒颗粒不仅含有HIV基质蛋白P24,还可以整合AIV HA蛋白,并且能够由前体蛋白HA0裂解为具有生物活性的HA1和HA2蛋白.HIV-HA假病毒可以感染MDCK、HeLa、CHO、293T等4种靶细胞,表明所构建的假病毒具有感染活力,且具有广泛的宿主范围.结论 本研究成功构建整合A/Shenzhert/406H/06 HA蛋白的假型逆转录病毒,并且HIV-HA假病毒具有良好的感染活性,从而为下一步筛选中和抗体及抗原表位分析奠定基础.     

抗人禽流感病毒H5N1人源化单链抗体噬菌体文库的构建和筛选

目的 利用抗人禽流感病毒H5N1 IgG抗体阳性的人禽流感康复患者外周血淋巴细胞,构建人源化Fv段单链抗体(seFv)噬菌体文库,并筛选与禽流感病毒相关蛋白有结合活性的scFv抗体文库.方法 提取人外周血淋巴细胞总RNA,逆转录成cDNA,以其为模板,利用家族特异性IgG基因的引物,扩增重链和轻链的可变区基因,并用合成的连接子将轻链和重链基因连接成单链抗体片段后,重组到噬菌粒载体pCANTAB5E中.将重组噬菌粒载体电转化大肠杆菌TG1,酶切和PCR鉴定抗体库的重组率,通过测定噬菌体抗体库的滴度计算抗体库的库容,用特异性禽流感病毒相关蛋白筛选表达的单链抗体.结果 构建了源于人禽流感康复患者血清的scFv抗体文库,库容为3.75×104;筛选出与禽流感病毒相关蛋白有结合活性的scFv抗体文库.结论 成功构建了抗人禽流感病毒H5N1的人源scFv噬菌体抗体库,并筛选出特异性结合人禽流感病毒相关蛋白的单链抗体,为进一步制备快速检测试剂和治疗研究提供了基础数据.     

禽流感病毒(H5N1)血凝素蛋白真核表达载体的构建与表达

目的:构建禽流感病毒(H5N1)血凝素蛋白HA真核表达载体并表达其编码蛋白(转染293T细胞)。方法:从江苏H5N1流感病毒毒株(A/Jiangsu/07-4(H5N1))提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增HA全长基因,将其克隆至pMD18-T Vector中构建pMD18-T-HA质粒,双酶切pMD18-T-HA与PXJ40-MYC后,构建真核表达载体PXJ40-MYC-HA,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过West-ern blot鉴定HA蛋白的表达。结果:经双酶切、测序鉴定证实HA基因的真核表达载体构建成功。Western blot法可见HA基因编码蛋白的成功表达。结论:成功构建了H5N1血凝素真核表达载体,该表达载体的构建为后期建立稳定表达HA蛋白的细胞模型和HA蛋白功能研究奠定了基础。     

人感染高致病性禽流感病毒H5N1的病理学观察

目的 观察人感染高致病性禽流感病毒H5N1后各主要脏器的病理改变.方法 按传染病尸体解剖要求对2例死亡病例系统解剖,并获得心、肝、脾、肺和肾等主要脏器,对1例重症患者行肺大泡切除术,组织常规HE和免疫组织化学染色,光学显微镜下观察.结果 2例肺组织主要呈弥漫性肺泡损伤改变.早期呈渗出性改变,肺泡上皮坏死脱落,肺泡腔内见大量均匀粉染渗出液伴广泛透明膜形成.中晚期主要呈增生性和纤维化性改变,肺泡上皮和支气管上皮增生,肺泡腔内渗出物和肺间质纤维化.1例在慢性支气管扩张症基础上伴弥漫性肺泡损伤和肺间质纤维化.免疫器官改变:全身淋巴组织萎缩伴活跃的噬血现象.其他脏器病变:1例心脏有间质性心肌炎;1例肾脏有急性肾小管坏死;1例有脑水肿伴脑实质内神经细胞嗜酸性变,轴突肿胀,粗细不均.脑室旁见灶状坏死.1例孕妇胎盘内多灶状滋养叶细胞坏死伴营养不良性钙化,有急性坏死性蜕膜炎.胚胎肺脏有肺水肿和肺炎改变.结论 人感染高致病性禽流感病毒H5N1后首先出现呼吸系统症状,广泛弥漫性肺泡损伤致低氧血症是病理学基础,患者最终因多器官功能衰竭致呼吸、循环衰竭死亡.