Magainin-Aurein杂合肽基因的合成与克隆

目的:构建抗菌肽Magainin-Aurein杂合肽基因,并将M-A杂合肽基因克隆到载体pUC18上.方法:根据已报道的抗菌肽Magainin-2和Aurein1.2基因的氨基酸序列,推导出其cDNA序列,采用基因片段合成结合PCR扩增的策略,分别获得大量完整的Magainin-2和Aurein1.2基因片段.将两者连接为杂合基因并克隆到载体pUC18上.结果:构建了M-A杂合肽基因重组质粒,经PCR扩增、酶切和DNA测序分析表明,杂合肽基因的DNA序列及阅读框完全正确.结论:pUC18-M-A重组质粒构建成功,为进一步亚克隆到表达载体并进行高效表达打下基础,并为其他抗菌肽杂合肽的制备提供了参考.     

人癌胚抗原基因的克隆及基因疫苗的构建

目的:克隆人癌胚抗原(CEA)基因cDNA,构建CEA基因疫苗.方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从人结肠癌细胞组织克隆出细胞中CEA基因片段,通过基因重组技术将该基因片段重组于pcDNA3.1真核表达载体上,构建成pcDNA3.1/CEA疫苗,分别用PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对pcDNA3.1/CEA疫苗进行鉴定.结果:经PCR扩增发现2.1 kb的目的基因条带、酶切电泳分析可见2.1 kb的目的基因条带和5.4 kb的载体条带、DNA测序证实载体中的目的基因序列与CEA的cDNA序列完全相同.结论:本实验成功地克隆了CEA 基因并构建了其基因疫苗,为进一步研究CEA基因疫苗抗肿瘤的实验打下基础.     

两种分泌型人谷氨酸脱羧酶65片段DNA疫苗的构建与鉴定

目的:构建和鉴定分泌型人谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)65片段DNA疫苗.方法:从人GAD65质粒中扩增出GAD190-315和GAD490-570两个片段的cDNA,分别与hIL-2信号肽cDNA基因拼接,将拼接后的片段克隆入pBudCE4.1真核表达载体,测序鉴定,并用Western印迹检测融合基因的表达.结果:核酸序列测定表明克隆的融合基因序列与报告序列一致,开放阅读框正确,Western印迹检测显示这两种人GAD65片段分泌表达.结论:两种分泌型人GAD65片段DNA疫苗均成功构建,为1型糖尿病的预防提供了实验基础.     

含anti-erbB2的重组表达载体的构建及其在T细胞株中的表达

目的：构建含融合基因anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3（ζ）的T细胞株,为erbB2过度表达肿瘤的靶向基因治疗奠定实验基础。方法：利用SWISS MODEL和PHYRE预测该融合蛋白的三级结构。利用PCR分别从重组质粒pPIC9k、pBullet和pLNCX上扩增出3段基因片段,即片段anti-erbB2 scFv、片段Fc-CD28-CD3（ζ）和信号肽序列signal。利用SOE-PCR将3段序列连接形成融合基因片段signal-anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3（ζ）。经TA克隆扩增及鉴定后,将融合基因片段与逆转录病毒表达载体pLNCX相连构建重组真核表达载体,脂质体方法转染人T淋巴细胞株Jurkat,G418筛选后用流式细胞术检测融合蛋白稳定表达情况。结果：经预测该融合蛋白在三级结构上可形成功能构象。经PCR、酶切及测序鉴定均证实成功构建重组真核表达载体pLNCX/signal-anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3（ζ）。经流式细胞术检测,在Jurkat细胞中表达量达23.68%。结论：应用分子克隆的方法成功地构建了重组真核表达载体pLNCX/anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3（ζ）,融合基因能够在T淋巴细胞株中表达,为制备含该融合基因的原代T淋巴细胞,进行erbB2过度表达肿瘤的靶向基因治疗研究奠定了基础。     

信号肽重组HBD2在人肺癌细胞中表达的初步研究

目的构建高表达人源化β-防御素2(HBD2)表达体系.方法构建人pLNCX2-CEA信号肽-HBD2(成熟肽)逆转录表达载体,DOTAP转染逆转录包装细胞,获得含融合基因的侵袭性逆转录病毒,再转染人肺癌A549细胞,用免疫印迹法鉴定转化细胞中HBD2蛋白的表达.结果成功构建了表达HBD2成熟肽的重组信号肽HBD2的人肺癌表达体系,经Western Blot检测,证实有目的基因表达.结论构建的人肺癌表达体系具有高表达HBD2的功能.     

大鼠MeCP2基因HSV-1型反义表达载体的构建与鉴定

目的以真核表达载体单纯疱疹病毒Ⅰ型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)质粒型载体(pHSV)作为表达载体,构建大鼠MeCP2基因反义表达载体.方法用PCR方法扩增出大鼠MeCP2 cDNA部分片段,将其反向插入表达载体pHSV,并以PCR、酶切电泳以及DNA测序等方法对重组质粒进行鉴定.结果经过PCR、酶切电泳以及DNA测序,鉴定出连接方向和插入序列正确的反义表达载体.结论成功构建了大鼠MeCP2基因HSV-1型反义表达载体,为进一步研究该基因的功能打下了基础.     

大鼠寡霉素敏感相关蛋白的克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)的基因并构建pEGFP-N1真核表达载体。方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从大鼠脑组织中扩增出OSCP基因,将其插入到pTA2克隆载体中,测序鉴定后亚克隆至pEGFP-N1真核表达载体并进行酶切、测序鉴定。结果:PCR扩增出约为700 bp的基因片段;重组克隆载体pTA2-OSCP经测序鉴定证明pTA2载体中插入了目的基因片段;重组表达载体pEGFP-N1-OSCP经酶切、测序鉴定证明其构建成功。结论:OSCP基因克隆和真核表达载体构建成功,这为下一步开展该基因的重组蛋白表达及功能研究奠定了基础。     

BALB/c小鼠H-2Kd胞外段基因 cDNA的克隆及序列测定

目的 克隆小鼠H-2K^d胞外段基因,构建相关表达载体。方法 通过逆转录-聚合酶链反应（RTP-PCR）技术从BALB／c品系小鼠（H-2K^d）脾细胞中扩增出目的基因,构建载体后进行PCR、酶切鉴定及序列测定。结果 克隆基因产物鉴定结果与理论预期值一致,DNA测序完全吻合。结论 该实验克隆H-2K^d基因胞外段成功。     

人骨髓间质干细胞ING4基因的克隆及其慢病毒表达载体构建

目的:克隆人骨髓间质干细胞ING4(inhibitor of growth famility,member4)基因,构建其慢病毒表达载体PNL-ING4.方法:提取人骨髓间质干细胞(hMSCs)总RNA,经RT-PCR扩增出ING4cDNA,克隆至PMD19-T载体,选择阳性克隆进行酶切鉴定和测序,构建慢病毒表达载体PNL-ING4,用双酶切、基因测序进行鉴定.结果:RT-PCR产物为750 bp的条带,双酶切和基因测序正确.结论:成功从hMSCs克隆了ING4基因并成功构建其慢病毒表达载体PNL-ING4,为进一步研究ING4基因的作用与抗肿瘤机制奠定了基础.     

人血小板衍生生长因子B链基因酵母表达载体的构建

目的 构建带信号肽和不带信号肽的人血小板衍生生长因子B(PDGF-B)链基因酵母表达载体，探讨该基因在酵母中的表达效率和活性。方法 利用逆转录．聚合酶链反应(RT-PCR)从人血管内皮细胞总RNA中扩增出PDGF-B的cDNA，克隆入pGEM-T载体，进行序列测定。进而克隆至酵母表达质粒pMETB和pMETαA并进行重组子双酶切鉴定。结果 扩增获得了含信号肽(578bp)和不含信号肽(340bp)的编码PDGF-B链基因；构建了PDGF-B的酵母表达载体pMETB-PDGFB1，pMETαA-PDGFB2。测序结果显示，重组载体中目的基因序列与GENE BANK公布的序列一致。结论 人血小板衍生生长因子B链基因酵母表达载体构建成功，为进一步在酵母中的高效表达奠定基础。     

人重组血清白蛋白基因T载体和pET28a表达载体的构建及鉴定

目的构建重组人血清白蛋白(rHSA)表达基因的克隆载体及表达载体,为下一步的蛋白表达和构建rHSA融合基因打下基础。方法从人胎盘中提取总RNA,利用RT-PCR方法构建cDNA-mRNA杂交链,然后用人血清白蛋白表达基因的特异引物进行PCR,PCR产物回收后与T载体连接,经过转化、质粒酶切、测序等一系列手段对插入情况和序列是否正确进行鉴定。用另一组带有酶切位点的引物和pfu酶进行PCR,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切PCR回收片段及pET28a表达载体,二者经过连接、转化、质粒酶切、测序等手段重新鉴定序列是否正确。结果插入到T载体和pET28a载体中的序列为1 830 bp的带有24个氨基酸信号肽的基因片段,此序列和GenBank中公布的rHSA序列相一致,并显示在485、750、1 685等位点可能有等位基因多态性。结论从胎盘中提取mRNA后,利用RT-PCR构建的人血清白蛋白基因序列完全正确,为下一步的工作提供了基础。