大鼠肝星状细胞的分离培养鉴定

目的改良分离培养大鼠肝星状细胞的简便方法。方法经过门静脉插管、推注肝素稀释液、肝脏灌流、胶原酶离体循环消化、过滤、离心分离等步骤,分离肝星状细胞,省去了链霉蛋白酶E消化过程,采用台盼蓝染色排斥法鉴定细胞活率,desmin免疫细胞化学染色法鉴定HSCs纯度。结果每只鼠肝HSCs的得率为0.5~1.0×107,纯度为(92.2±2.0)%,活率为(97.8±0.3)%,数量及活率均符合实验要求。结论该方法简便、廉价、实用,值得进一步探索。     

改良的大鼠睾丸支持细胞分离培养方法

目的 简化睾丸支持细胞的分离方法，提高细胞产量。方法 采用0.25%膜酶、0.05%胶原酶序贯两步消化法消化，细胞悬液在37℃、5%CO2培养箱内孵育培养48h，观察产量和细胞功能。结果 改良的分离方法所获得的睾丸支持细胞占细胞总数的90%以上，大大提高了支持细胞的获取量，细胞Fas配体（Fas-L)表达功能正常。结论 改良的分离培养方法简化了传统的分离培养方法，同时提高了细胞产量。     

成年大鼠心肌细胞的分离和培养技术

目的建立稳定的成年大鼠心肌细胞分离和培养方法,以便进行成年大鼠心肌细胞收缩功能的研究。方法将成年大鼠心脏挂于Langendorff装置上灌流,胶原酶消化分离成年大鼠心肌,无血清悬浮培养心肌细胞。光镜观察,结合形态学和收缩功能评价心肌细胞。结果新分离的心肌细胞的收获量为(4~6)×106个,杆状和圆形,其中长杆状细胞大于75%,横纹清晰,收缩幅度(12.00±2.68)%。无血清培养24 h后,细胞保持完整的形态结构,长杆状心肌细胞占总数的70%以上,收缩幅度(11.78±1.59)%,与刚培养时的细胞相比,无显著差别(P>0.05)。结论通过本方法可以对成年大鼠心肌细胞进行良好的分离培养。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

利用无血清培养和细胞克隆技术从孕鼠(14d)胚胎中分离出神经干细胞，并进行传代培养，采用免疫细胞化学技术检测神经巢蛋白和成熟脑细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达，同时采用H-E染色法鉴定神经细胞类型。证实从大鼠胚胎大脑皮质分离出的细胞具有连续的克隆能力，并表达神经巢蛋白，分化的细胞表达神经元和神经胶质细胞的特异性抗原，为中枢神经系统的干细胞。     

大鼠血管平滑肌细胞分离培养的探讨

目的：培养大鼠血管平滑肌细胞。方法：手术显微镜下分离主动脉和肺动脉，再用翻转干涸法进行操作。结果：显微镜下分离组织，岢基本除净动脉纤维脂肪层和外膜，再用刀片轻刮内膜，可保证所贴组织块为地动脉中膜。传至第三代时，用台盼蓝检查细胞传代成活率９５％，光镜、电镜和免疫组化鉴定培养细胞，培养细胞纯度９６％。结论：贴块片简便易行、经济、又可以防止膜损伤，可为血管病理变化研究提供适宜的细胞。     

大鼠肝星状细胞的原代分离、培养与鉴定

目的：介绍一种合理、实用、便捷的HSCs原代培养方法。方法：SD大鼠进行肝脏原住灌注、酶消化并进行间质细胞密度梯度离心。使用20％、35％和50％三层Percoll密度梯度分离纯化HSCs，分析其纯度、活力以及根据原代和传代HSCs的特征进行鉴定。结果：每只鼠肝HSCs原代和传代HSCs都表达Desmin，只有传代7天的HSCs表达α—SMA。结论：本方法更简单、实用、方便，各项评价指标不低于或优于其他方法。适用于实验研究中快速制备原代HSCs。     

改良的大鼠肝星状细胞分离方法

目的：探讨一种简便、高产的大鼠肝星状细胞（HSC）分离方法,为研究肝细胞相关实验提供细胞原材料。方法：应用悬浮缓冲液校正Nycodenz密度梯度分离液,使其浓度为11．3％（w／v）,采用单层一步梯度离心法分离HSC。采用台盼蓝染色排斥法鉴定细胞活率,desmin免疫细胞化学染色法鉴定HSCs纯度。结果：肝星状细胞得率每只大鼠约（4．0±0．5）×10^7个,细胞活力达到90％,细胞纯度达到95％。结论：本法简便、高产,是一种理想的分离肝星状细胞的方法,值得推广。     

大鼠骨髓来源树突状细胞的分离与免疫学特征

目的：探讨大鼠骨髓来源树突状细胞（DC）的体外分离培养方法，为DC的免疫学研究及临床应用提供技术参考。方法：取大鼠四肢骨髓细胞悬液，经密度梯度离心得到大鼠骨髓单个核细胞（BMMNC）；应用 大鼠重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rrGM-CSF)、大鼠重组白细胞介素-4（rrIL-4）及大鼠重组肿瘤坏死因子-α(rrTNF-α)进行体外培养；肿瘤抗原（TAA）/DC组于诱导分化的第3天加入大鼠卵巢癌细胞株NuTu-19的冻融抗原，获得负载TAA的成熟DC；DC组为对照组，未加入NuTu-19。对两组进行形态学观察、流式细胞学表型鉴定及体外淋巴细胞增殖反应测定。结果：大鼠骨髓来源的BMMNC在相关细胞因子的作用下可以培养出成熟的DC，ＴＡＡ／ＤＣ组高表达表面抗原，其OX62、CD86和MHC-Ⅱ表达高于对照组（P<0.01）；在效靶比（SC∶RC）为1∶3、1∶10、1∶30和1∶100时,淋巴细胞刺激指数(SI)ＴＡＡ／ＤＣ组均高于对照组（P<0.01）。结论：成功地建立了大鼠骨髓DC的培养方法，大鼠骨髓来源的BMMNC可以培养出成熟的DC。     

大鼠睾丸支持细胞的分离及培养方法

目的 简化大鼠睾丸支持细胞的分离培养方法,提高支持细胞的获取量。方法 取鼠龄16－22天的Wistar大鼠,去除睾丸被膜,剪碎后用0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶次第消化。然后将其制成细胞悬液并分装入25cm^2的培养瓶中,旋转在39℃5％CO2的培养箱孵育48h,以利于去除精原细胞,取出后冲洗两次,换液并移入37℃5％CO2培养箱进行培养,在此期间每天用置显微镜进行观察,并于培养第6天做光镜和电镜观察。结果 在大鼠睾丸支持细胞的分离培养中,支持细胞占培养细胞总数的90％以上,大大提高了支持细胞的获取量。结论 应用本实验方法获取大鼠睾丸扶持细胞获得成功并简化了国内现行的方法,提高了支持细胞的获取量。     

大鼠心肌干细胞体外分离培养的方法研究

目的 对比不同温度下采用纤维黏连蛋白(FN)包被分离培养大鼠心肌干细胞(CSC)的效果,以筛选体外大鼠心肌干细胞的最佳分离培养方法.方法 选取健康新生Wistar大鼠,在无菌条件下取出心脏,分别经胰酶和Ⅱ型胶原酶反复消化后于FN包被的培养瓶中培养,将第3代CSC进行免疫组化细胞表面抗原鉴定.将在37℃及室温(22℃～25C)下用FN包被培养的原代细胞分别设为A组及B组,在37℃及室温(22℃～ 25℃)下用FN包被培养的CSC分别设为C组及D组,比较A组与B组、C组与D组的细胞贴壁时间、首次传代时间及细胞倍增水平.结果 从新生大鼠心肌组织内成功分离培养出CSC,细胞表面抗原c-kit阳性率为83％.A组及C组的贴壁时间、首次传代时间分别均短于B组、D组(P＜0.05).细胞倍增水平呈C组＞A组＞D组＞B组.结论 应用37℃FN包被培养瓶的方法分离培养原代大鼠心肌干细胞效果更优.     

改良的大鼠胃黏膜壁细胞分离方法

目的 改良大鼠胃黏膜壁细胞分离方法。方法 采用链霉蛋白酶消化、间断密度梯度离心纯化大鼠胃黏膜壁细胞。结果 台盼蓝染色，细胞存活率大于95％；壁细胞纯度为80％～85％。结论 这种分离方法简便易行，值得推广。     

大鼠应激性胃粘膜损伤与壁细胞泌酸的关系

目的：探讨应激状态下大鼠胃粘膜损伤与壁细胞泌酸状态的关系。方法：将48只SD大鼠随机分成对照组、水浸束缚应激1、2、4h组、奥美拉唑组及生理盐水组。检测胃液pH值、胃粘膜损伤指数（UI）,光镜观察胃粘膜组织学改变,电镜观察壁细胞超微结构变化。结果：随应激时间延长UI明显增加,而胃液pH值明显降低（P＜0．01）,二者之间呈明显负相关（γ＝－0．9987,P＜0．01）;奥美拉唑组与应激4h组和生理盐水组比,UI明显降低（P＜0．01）。电镜示壁细胞在对照组呈静息状态,而应激1h,2h,4h组呈不同激活状态,以4h最明显,呈泌酸活跃状态。奥美拉唑组壁细胞见分泌小管扩张,有绒毛稀少或密集分布的不同表现。结论：应激状态下大鼠胃粘膜损伤程度与壁细胞泌酸状态密切相关。     

大鼠海马神经干细胞的分离培养与免疫荧光鉴定

目的分离培养新生SD大鼠神经干细胞,并对其生物学特性进行鉴定。方法采用无血清培养联合应用碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子对大鼠海马神经干细胞分离培养,采用免疫荧光的方法检测神经干细胞的nestin抗原。结果从新生大鼠海马齿状回分离的细胞群可不断增殖形成细胞克隆球,并且呈nestin阳性表达,具有多向分化能力。结论分离培养的细胞是中枢神经系统的干细胞。     

噪声应激大鼠胃壁细胞形态和泌酸功能的变化

目的:建立白噪声致大鼠应激性溃疡模型(noise stress, NS),并研究噪声应激大鼠胃壁细胞形态和泌酸功能的变化.方法:采用白噪声应激建立NS大鼠模型.大鼠随机分为对照组、NS 4 h组及NS 8 h组,测定胃液pH值、胃黏膜溃疡指数(ulcer index ,UI) ,用免疫荧光技术标记H ,K -ATP酶,在激光共聚焦扫描显微镜下观察壁细胞形态并在荧光显微镜下分类、计数.结果:(1)NS 4 h组胃液pH值为2.22±0.05,显著低于对照组的2.59±0.21 (P＜0.05),NS 8 h组胃液pH值为1.31±0.06,与对照组和NS 4 h组相比均有显著差异(P＜0. 01).(2)NS 4 h组UI为10.5±1.29,显著高于对照组(P＜0. 01),NS 8 h组UI达34.36±2.22,显著高于对照组(P＜0. 01)及NS 4 h组(P＜0.05).(3)NS 4 h组分泌相壁细胞数(55.5±3.42)/100,NS 8 h组为(62.0±3.46)/100 ,均显著高于对照组的(42.5±3.70)/100(P＜0. 01),其中NS 8 h组也显著高于NS 4 h组(P＜0.05).(4)胃液pH值与胃UI呈负相关(r=-0.85,P＜0.05),与分泌相壁细胞数呈负相关(r=-0.89,P＜0.05).结论:白噪声应激可以成功的建立大鼠应激性溃疡模型;噪声应激大鼠胃酸分泌增加,胃酸在溃疡形成过程中起不可忽视的作用.     

鼠肺细胞的分离纯化及原代培养

目的:建立一套可靠的鼠肺细胞分离、纯化和培养技术,用于体外研究间质性肺病的发病机制及治疗方法.方法:采用胰酶消化出生后2 d SD大鼠肺组织块及SD大鼠肺泡灌洗液, 经差时贴壁法, 分离、纯化红皮鼠肺成纤维细胞(lung fibroblast, LF)和SD大鼠肺泡巨噬细胞(pulmonary alveolar macrophage,AM), 并进行原代培养.用波形蛋白(Vimentin)、 CD14细胞免疫荧光染色、蛋白质印迹和电镜对所分离的细胞进行鉴定.结果:所得细胞产量大、纯度高.细胞免疫荧光染色LF细胞波形蛋白染色阳性而CD14染色阴性;AM细胞则相反.扫描电镜观察可见肺成纤维细胞有微绒毛,细胞间连接成网状,蛋白质印迹结果显示波形蛋白表达.结论:该方法是一种可靠的红皮鼠肺成纤维细胞及大鼠肺巨噬细胞的分离纯化培养技术, 可用于间质性肺病(interstitial lung disease, ILD)的发病机制及治疗方法的体外研究.     

颅脑损伤大鼠胃壁细胞形态和泌酸功能的变化

目的:研究颅脑损伤(brain injury, BI)大鼠胃壁细胞形态和泌酸功能的变化.方法:采用液压打击法建立BI大鼠模型.大鼠随机分为对照组、BI 4 h及8 h组,测定胃液pH值、胃溃疡指数(ulcer index,UI),用免疫荧光技术标记H /K -ATP酶后在激光共聚焦扫描显微镜下观察壁细胞形态并分类、计数,比较胃液pH与UI及分泌期壁细胞数的关系. 结果: BI 4 h组胃液pH值为1.71±0.18,显著低于对照组的2.60±0.31,BI 8 h组胃液pH值为2.16±0.17,与对照组差异显著,和BI 4 h组相比无显著差异; BI 4 h组UI 为15.80±3.27,显著高于对照组,BI 8 h组UI达29.80±2.17,高于BI 4 h组;BI 4 h组分泌期壁细胞数(115.6±5.98)/200,BI 8 h组为(133±8.12)/200,均显著高于对照组的(86.2±7.23)/200,胃液pH值与胃UI及分泌期壁细胞数均无明显相关.结论:BI后胃酸分泌增加,胃液pH值不能完全反映壁细胞泌酸功能.     

人表皮干细胞的快速分离培养及鉴定

目的探讨人表皮干细胞的体外快速分离和培养方法。方法运用DispaseⅡ酶和胰蛋白酶两步法从手术切除的人包皮组织中分离获得表皮干细胞。分离的表皮片经表皮干细胞培养基(ESCM)悬浮,接种于IV型胶原包被的培养板中,37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱内静置培养10min,留用贴壁细胞;Ⅳ型胶原黏附、分离并富集后继续培养。倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况;检测细胞克隆形成率及克隆维持时间;免疫组化染色观察表皮干细胞标志物β1整合素和角蛋白19(K19)的表达。以角质形成细胞作为对照。结果组织学观察显示,培养24h后细胞呈克隆状生长;所分离、培养细胞的克隆形成率高于对照角质形成细胞,且克隆维持时间较长;免疫组化染色显示,培养细胞β1整合素及Kl9均呈阳性表达。结论运用Ⅳ型胶原黏附结合ESCM培养可以实现人成体表皮干细胞的快速分离和培养。     

腹部外伤大鼠在海水浸泡下急性胃黏膜病变和壁细胞超微结构改变

目的:探讨海水浸泡开放性腹部创伤大鼠胃壁细胞泌酸动态变化及其与急性胃黏膜病变的关系.方法:将104只SD大鼠随机分为正常对照组、单纯腹腔开放组、单纯海水浸泡组(不开腹)、腹腔生理盐水浸泡伤组、腹腔海水浸泡伤组,后4组又分为浸泡1 h、2 h、3 h组,每组各8只.观测各组胃黏膜溃疡指数(UI)、胃液pH及壁细胞超微结构的动态变化.结果:随着海水浸泡时间的延长,大鼠胃液pH值明显降低而UI明显增加,二者之间呈明显负相关(r=-0.700 35,P＜0.01);电镜示胃壁细胞在正常对照组呈静息状态,而各种应激1、2、3 h后均有不同程度的泌酸活跃,以海水浸泡者更重,并在3 h时达高峰.结论:海水是一重要的致伤因素,可通过促进胃壁细胞泌酸作用而加重急性胃黏膜病变.     

牛主动脉内皮细胞的分离、培养及特征

目的:建立牛主动脉内皮细胞(BAEC)的体外研究模型,为体外研究内皮细胞的病理和生理过程提供重要手段.方法:用酶消化法分离BAEC,在pH为7.2的DMEM培养基中培养,鉴定内皮细胞中特异表达的第Ⅷ因子;以计数法测细胞的增殖能力,同时测定细胞的迁移.结果:细胞呈三角形,单层生长,第Ⅷ因子表达阳性,增殖呈指数生长,迁移正常.结论:提示牛主动脉内皮细胞的体外模型建立成功.     

大鼠肝星状细胞的分离、培养与鉴定

目的:改进大鼠肝星状细胞的分离、培养方法,提高其分离质量。方法:取成年雄性Wistar大鼠,用链蛋白酶、胶原酶体内门静脉灌注消化大鼠肝脏细胞,经Nycodenz密度梯度离心分离肝星状细胞。台盼蓝拒染实验鉴定细胞活力,Desmin免疫细胞化学染色鉴定细胞纯度。结果:肝星状细胞得率为2.8×107/肝。肝星状细胞存活率在90%以上。Desmin阳性细胞原代培养达90%以上,传代培养达95%以上。结论:改良大鼠肝星状细胞的分离、培养方法,有利于原代大鼠肝星状细胞的生物学研究。