多药耐药铜绿假单胞菌MexAB-OprM主动外排系统的耐药作用

目的探讨MexAB-OprM主动外排系统(外排泵)在多药耐药铜绿假单胞菌耐药机制中的作用。方法挑选临床分离的铜绿假单胞菌多药耐药菌株26株、敏感菌株15株及标准质控菌株(ATCC27853),用RT-PCR扩增其内膜转运蛋白mexB的结构基因mexB和内参照基因16S rRNA片段,根据mexB与16S rRNA扩增产物的电泳扫描比值,分析mexB mRNA的表达水平,判断MexAB-OprM的表达情况。结果 26株多药耐药菌株对14种常用抗菌药物全部耐药,耐药率为100%,15株敏感菌株对14种常用抗菌药物全部敏感;标准质控菌株、所有的敏感菌株和多药耐药菌株均检测出mexB mRNA基因;耐药菌株的mexB mRNA水平(2.41±1.10)显著高于敏感菌株(1.47±0.83)(P0.01)。结论 MexAB-OprM主动外排系统表达水平的增高与铜绿假单胞菌多药耐药的形成密切相关。     

多药耐药铜绿假单胞菌的MexAB-OprM表达水平研究

目的探讨MexAB-OprM主动外排泵系统与铜绿假单胞菌的多药耐药关系。方法选取82株重症监护病房分离的多药耐药铜绿假单胞菌,采用实时荧光定量RT-PCR方法检测MexAB-OprM基因的表达情况。结果在选取的82株多药耐药铜绿假单胞菌中,共检出50株外排MexAB-OprM表型阳性(61.0%),以标准野生株PAEO1作为对照,其中38株MexAB-OprM系统表达差异倍数≥30倍,占76.0%,其余12株MexAB-OprM表达差异倍数<30倍,占24.0%。结论 MexAB-OprM主动外排系统表达水平异常增高可能与铜绿假单胞菌的多药耐药有关。     

主动外排泵在铜绿假单胞菌多药耐药机制中的作用实验研究

目的采用荧光定量RT-PCR的方法检测铜绿假单胞菌MexAB-Opr M、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-Opr M、MexGHI-OpmD 5种外排泵表达情况,探讨主动外排泵在多药耐药铜绿假单胞菌(MDRPA)耐药机制中的作用。方法采用分子克隆技术,构建克隆载体pMD18-T-mexB、pMD18-T-mexD、pMD18-T-mexF、pMD18-T-mexF、pMD18-T-mexY及pMD18-T-rpsL作为定量模板,建立标准曲线;采用荧光定量RT-PCR检测并分析30株MDRPA临床分离株外排基因mexB、mexD、mexF、mexH、mexY的mRNA表达。结果成功构建pMD18-T-mexB、pMD18-T-mexD、pMD18-T-mexF、pMD18-T-mexF、pMD18-T-mexY及pMD18-T-rpsL的标准曲线;在30株MDRPA中,16株高表达MexAB-Opr M(53.33%),7株高表达MexCD-OprJ(23.33%),8株高表达MexEF-OprN(26.67%),2株高表达MexGHI-OpmD(6.67%),3株高表达MexXY-Opr M(10.00%)。结论主动外排泵在多药耐药铜绿假单胞菌耐药机制中起着重要作用。     

生物膜铜绿假单胞菌多药外排泵的表达研究

目的研究铜绿假单胞菌在浮游态、生物膜态及经亚胺培南、环丙沙星诱导后,多药外排泵MexAB-OprM及其阻遏蛋白MexR基因表达情况。方法用铜绿假单胞菌PAO1在eppendorf管内建立生物膜;用1/2 MIC亚胺培南、环丙沙星对浮游菌诱导4 h;4 MIC亚胺培南2、MIC环丙沙星对生物膜菌诱导12 h,分别于生物膜形成的第35、天,用实时荧光定量PCR的方法,测定铜绿假单胞菌外排泵MexAB-OprM及MexR的基因表达。结果铜绿假单胞菌由浮游菌变为生物膜菌后,其外排泵MexAB-OprM的表达水平明显降低,其相对表达量最高相差近10倍,其差异有统计学意义(P0.05);铜绿假单胞菌由浮游菌变为生物膜菌后,阻遏蛋白MexR表达差异无统计学意义;在亚胺培南及环丙沙星诱导后,浮游菌和生物膜菌其基因MexAB-OprM、MexR表达差异均无统计学意义。结论铜绿假单胞菌由浮游菌转变为生物膜菌后,外排泵MexAB-OprM表达明显减少,MexR基因表达无影响;亚胺培南、环丙沙星对浮游菌及生物膜菌的MexAB-OprM、MexR均无诱导作用。     

铜绿假单胞菌主动外排系统MexAB-OprM与耐药的关系研究

目的研究铜绿假单胞菌对碳青酶烯类抗生素的耐药机制. 方法以亚胺培南为代表,应用逆转录(RT)-PCR方法并设置内参照,分别研究临床分离的铜绿假单胞菌亚胺培南耐药株和亚胺培南敏感株的主动外排系统MexAB-OprM中OprM的结构基因OprM的mRNA表达水平. 结果耐药组OprM的mRNA表达水平明显高于敏感组. 结论主动外排系统MexAB-OprM的表达水平增高或异常增多与铜绿假单胞菌对以亚胺培南为代表的碳青酶烯类抗生素耐药密切相关.     

铜绿假单胞菌lasI/lasR群体感应系统与生物膜形成相关基因表达调控的研究

目的 了解铜绿假单胞菌(PAE)生物膜形成过程中多糖合成相关基因,lasI/lasR群体感应系统及鼠李糖脂转移酶合成相关基因rhlA在生物膜形成过程中的表达,探讨其在PAE生物膜形成中的关系及调控作用.方法 分别收集非黏液型铜绿假单胞菌PAO1的浮游菌及生物被膜菌,用实时荧光定量RT-PCR的方法,对基因的表达进行相对定量分析.结果 pslAld的浮游菌表达量略高于6d生物膜菌外,algD、pelA、LasI、LasR、RhlA生物被膜菌的mRNA相对表达量均高于浮游菌,并且pslA、pelA、RhlA的mRNA相对表达量趋势一致,均是培养1d生物膜菌表达最高.结论 algD、pslA、pelA、LasI,LasR、RhlA的表达与铜绿假单胞菌生物膜形成密切相关,在生物膜形成中具有重要作用,同时群体感应系统很可能参与pslA、pelA、RhlA的正向转录调节.     

铜绿假单胞菌主动外排系统MexAB-OprM与碳青霉烯类药物耐药的关系研究

目的:探讨临床分离的铜绿假单胞菌的主动外排系统MexAB-OprM与其对碳青霉烯类药物耐药之间的关系,研究其耐药分子机理。方法:测定临床分离的铜绿假单胞菌对亚胺培南和美罗培南的体外抗菌活性,根据耐药情况,分为碳青霉烯类药物敏感组和碳青霉烯类药物耐药组;应用RT-PCR方法,研究两组菌株的主动外排系统MexAB-OprM中结构基因oprM的mRNA表达水平;用PCR法扩增两组菌株的泵调节基因mexR,对扩增产物进行DNA双向测序。结果:耐药组oprM的mRNA表达水平明显高于敏感组(P0.05);一株菌发现MexR第126位氨基酸突变(缬氨酸→谷氨酸),两株菌发现MexR第70位氨基酸突变(精氨酸→谷氨酰胺)。结论:山西医科大学第一医院临床分离铜绿假单胞菌的主动外排系统MexAB-OprM参与碳青霉烯类药物的耐药;MexAB-OprM高表达的分子机理可能与泵调节基因mexR的突变以及其他突变型有关。     

医院获得性肺炎患者分离耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌OprD的表达

目的 研究耐碳青霉烯类抗菌药物铜绿假单胞菌(PAE) OprD的表达水平,探讨济南地区PAE耐碳青霉烯类抗菌药物的机制.方法 收集从医院获得性肺炎患者痰液中分离的PAE,提取13株耐碳青霉烯类抗菌药物菌株的RNA,应用荧光实时定量PCR分析PAE外膜蛋白oprD的基因表达水平;采用超声破碎法制备外膜蛋白,超速离心收集外膜蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离外膜蛋白,观察OprD的表达.结果 荧光实时定量RT-PCR检测PAEoprD基因表达的结果表明,实验室标准株Ct值oprD/rpsL为1.42;13株碳青霉烯类耐药株Ct值oprD/rpsL平均值为1.17,与实验室标准株相比,差异有统计学意义(t=3.0716,P＜0.01),2株碳青霉烯类敏感株Ct值的oprD/rpsL平均值为1.58,与实验室标准株相比,差异无统计学意义;外膜蛋白电泳图谱表明,碳青霉烯类耐药株在45 kDa处表达明显下降,此处外膜蛋白为OprD.结论 济南地区PAE耐碳青霉烯类抗菌药物与OprD表达水平下降有关.     

医院耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药机制研究

目的研究医院铜绿假单胞菌(PAE)耐药情况及对亚胺培南的耐药机制分布。方法对医院临床分离的150株非重复铜绿假单胞菌对亚胺培南(IMP)等14种常用抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)进行检测;进一步对耐亚胺培南铜绿假单胞菌(IRPA)64株作为受试株,进行耐药机制表型初筛试验及基因检测。结果 IRPA共64株,占42.6%,其中9株为产金属β-内酰胺酶(MBL)阳性,占试验菌株的14.06%,4株携带VIM基因和3株携带IMP基因,其他为阴性结果;17株主动外排表型筛选阳性,5株同时检测出oprM、mexB基因、有9株仅扩增出oprM基因而没有mexB基因、有3株未扩增出外排基因;oprD2基因缺失共11株,占17.19%。结论调查结果显示,铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药机制主要有金属酶的产生;主动外排的过度表达;孔道蛋白OprD2的缺失。     

耐碳青酶烯类药物铜绿假单胞菌的耐药机制研究

目的研究药物外排泵系统及膜孔蛋白及产金属β-内酰胺酶在耐碳青酶烯类铜绿假单胞菌中的表达水平或携带状况,为临床了解其耐药机制提供实验室依据。方法用SYBRGreenⅠ实时定量RT-PCR法检测多药耐药与全敏感铜绿假单胞菌中多药外排泵MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM及膜孔蛋白OprD的mRNA表达水平。结果在40株耐碳青酶烯类铜绿假单胞菌中,mexAB表达水平均无升高,mexCD、mexEF和mexXY升高的也分别仅有3、8、6株,其中还有3株同时有两种泵表达升高,即只有14株菌存在多药外排泵表达升高的现象(35.0%),40株菌中有10株菌oprD低表达,另外2株oprD表达缺失,与多药外排泵表达升高综合考虑,共有21株菌存在泵和孔蛋白表达异常(52.5%)。结论一株细菌中可同时存在多种耐药机制,这些机制间又并非简单的复合相加作用,探索耐药机制对新药研制及控制医院内感染的播散具有重要意义。     

荧光实时定量PCR检测铜绿假单胞菌外膜蛋白oprI基因的标准品的构建

目的构建荧光实时定量PCR(FQ-PCR)标准品测定铜绿假单胞菌oprI基因,以此测定铜绿假单胞菌菌量。方法以铜绿假单胞菌的oprI基因为目的基因设计探针引物,提取细菌基因组DNA,与pMD 18-T Vector连接并转化到大肠杆菌中。用氨卞青霉素筛选出白色菌落,提取含目的基因质粒,并用HindⅢ限制酶进行线性化处理,通过直接PCR、OD值测定及DNA片段测序鉴定其特异性。根据OD值确定浓度,制备FQ-PCR梯度浓度参考标准品,做出标准曲线,检测各样品菌菌量。结果铜绿假单胞菌oprI基因的目的片段成功制备,获得稳定的重组质粒,保持了目的片段的特异性和序列完整性,并获得很好的标准曲线(相关系数0.994),成功检测了铜绿假单胞菌标准菌株、培养株的菌量,而大肠杆菌及阴性对照无扩增。结论成功构建FQ-PCR检测铜绿假单胞菌oprI基因的定量参考标准,荧光实时定量法可以快速检测铜绿假单胞菌。     

荧光实时定量PCR检测铜绿假单胞菌方法建立及价值

目的建立荧光实时定量PCR（FQ-PCR）定量测定铜绿假单胞菌的方法，检测该方法的灵敏度并与传统细菌培养比较其特异性吻合率。方法选择铜绿假单胞菌的oprI基因为目的基因设计探针引物，建立Taqman探针FQ-PCR体系定量检测5种标准菌株、3种病毒株、白色念珠菌、肺炎支原体、人基因组DNA及临床培养96株菌株。结果31株铜绿假单胞菌、铜绿假单胞菌与其它菌种或人全血的混合液均产生特异扩增信号，标准曲线的相关系数为0．997；其他菌种（76株）无扩增；乙肝病毒、巨细胞病毒及肺炎支原体及健康人全血均无扩增，与传统培养相比特异性吻合率达100％，铜绿假单胞菌标准株按等级浓度稀释后其拷贝数也呈等级梯度递减，实际可检测到的最小菌落数为100个／ml，全程检测〈4h。结论荧光实时定量法检测oprI基因可以运用于铜绿假单胞菌的快速检测。     

逆转录荧光PCR鉴定活性铜绿假单胞菌方法的建立

目的:建立快速检测和甄别铜绿假单胞菌死活状态的定量方法。方法:根据铜绿假单胞菌gyrB基因序列设计引物和探针;提取铜绿假单胞菌菌体总RNA,采用一步法逆转录实时荧光定量PCR反应液对其进行检测。评价逆转录实时荧光定量PCR方法的特异性和敏感性,对收集的临床病人样本和模拟样本进行检测。结果:本试验建立的逆转录实时荧光定量PCR方法能特异、准确、快速的鉴定铜绿假单胞菌菌体死活状态,敏感度达102cfu/m l。临床标本检测结果与细菌培养结果具有较高一致性。10份模拟样本鉴定结果也完全一致。结论:一步法逆转录实时荧光PCR方法能够有效快速检测铜绿假单胞菌,并能甄别死活状态。     

荧光实时定量PCR检测铜绿假单胞菌外膜蛋白oprⅠ基因的标准品的构建

目的构建荧光实时定量PCR(FQ-PCR)标准品测定铜绿假单胞菌oprⅠ基因,以此测定铜绿假单胞菌菌量.方法以铜绿假单胞菌的oprⅠ基因为目的基因设计探针引物,提取细菌基因组DNA,与pMD 18-T Vector连接并转化到大肠杆菌中.用氨卞青霉素筛选出白色菌落,提取含目的基因质粒,并用HindⅢ限制酶进行线性化处理,通过直接PCR、OD值测定及DNA片段测序鉴定其特异性.根据OD值确定浓度,制备FQ-PCR梯度浓度参考标准品,做出标准曲线,检测各样品菌菌量.结果铜绿假单胞菌oprⅠ基因的目的片段成功制备,获得稳定的重组质粒,保持了目的片段的特异性和序列完整性,并获得很好的标准曲线(相关系数0.994),成功检测了铜绿假单胞菌标准菌株、培养株的菌量,而大肠杆菌及阴性对照无扩增.结论成功构建FQ-PCR检测铜绿假单胞菌oprⅠ基因的定量参考标准,荧光实时定量法可以快速检测铜绿假单胞菌.     

铜绿假单胞菌群体感应QS系统对Ⅰ类整合子intI1基因调控作用的初步研究

目的研究铜绿假单胞菌Ⅰ类整合子阳性株群体感应系统基因lasR与Ⅰ类整合子整合酶基因intI1表达水平的相关性,初步探讨群体感应系统对Ⅰ类整合子的调控机制。方法通过荧光定量RT-PCR方法检测铜绿假单胞菌群体QS信号分子受体基因lasR和Ⅰ类整合子整合酶基因intI1在生物被膜中与阿奇霉素菌液中mRNA的表达水平,分析两基因表达的相关性。结果铜绿假单胞菌群体感应系统lasR基因及Ⅰ类整合子intI1基因表达水平在生物被膜中均较在阿奇霉素菌液中升高(P0.05),且两者表达水平呈正相关性(r=0.565,P0.05)。结论铜绿假单胞菌群lasR和intI1基因表达呈正相关,且阿奇霉素对Ⅰ类整合子intI1基因表达抑制作用明显,提示intI1基因表达可能与群体感应系统的调控作用有关。     

生物膜铜绿假单胞菌群体感应系统调控ampC基因表达的研究

目的研究生物膜铜绿假单胞菌(PAE)在抗菌药物诱导状态下,群体感应(QS)系统对产酶基因ampC表达的影响。方法改良的平板法建立PAE生物膜模型,抗菌药物诱导ampC基因表达,实时荧光定量PCR测定PAO1、PAO1加用QS抑制剂(呋喃酮C-30)及QS系统突变菌株的ampC基因表达水平。结果PAO1加用呋喃酮C-30后,浮游菌和生物膜菌的ampC基因表达水平均下调,生物膜菌下调的程度大于浮游菌,两者差异有统计学意义(P0.05);QS系统突变菌株PAO-MW1、PAO-JP1的ampC基因表达水平均较PAO1低,生物膜状态PAO-MW1与PAO1的ampC基因表达差异较浮游状态更大。结论生物膜PAE的QS系统直接或间接调控ampC基因的诱导表达,QS系统发挥调控作用的水平不同可能是生物膜菌较浮游菌易诱导产酶原因之一。     

254株铜绿假单胞菌的耐药性分析

铜绿假单胞菌(PAE)是医院感染重要的病原菌之一,其耐药性日益增强.本研究分析了我院2010年PAE对抗菌药物的耐药情况.现报道如下. 1 材料与方法 1.1 菌株来源 2010年共分离出铜绿假单胞菌254株,剔除同一患者相同部位的重复菌株. 1.2方法 细菌培养纯化后,用黑马DL-96全自动细菌测定系统进行生化鉴定及定量药敏试验.判定标准参照NCCLS文件,质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC 27853.     

骨形成蛋白-7在大鼠慢性肺部感染致气道重构中的作用

目的探讨骨形成蛋白-7(BMP-7)在铜绿假单胞菌(PAE)诱发大鼠慢性肺部感染而致气道重构中的作用。方法随机分为生理盐水对照组(NS组)和铜绿假单胞菌感染组(PAE组)各60只,通过多次经气管穿刺注入一定剂量PAE菌液,建立大鼠慢性肺部感染模型;观察气管及肺组织的病理改变,测定气管壁和血管壁厚度,并采用实时定量RT-PCR方法检测肺组织中BMP-7 mRNA的表达,分析BMP-7表达与病理改变的相关性。结果大鼠感染PAE第4周开始,气管壁厚度和血管壁厚度均较NS组显著增加,差异有统计学意义(P<0.05),至第16周时,支气管管壁厚度与血管壁厚度达最大值,分别为(524.5±18.6)(、163.3±12.5)μm,管腔明显狭窄,有气道重构和肺气肿形成;而BMP-7表达随着时间的延长逐渐减弱,和对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01);BMP-7表达与气管壁厚度和血管壁厚度呈显著负相关,相关系数分别为-0.884,-0.775,差异有统计学意义(P<0.01)。结论反复气道感染铜绿假单胞菌可致大鼠出现气道重构,而BMP-7可能参与了气道重构的发生和发展过程。     

多药耐药铜绿假单胞菌外排机制的研究与同源性分析

目的研究多药耐药铜绿假单胞菌的外排泵及其暴发流行情况,为临床应用抗菌药物治疗和控制医院感染暴发提供参考依据。方法收集宁夏医科大学总医院2011年9月-2013年9月住院患者的各种临床标本中分离的785株铜绿假单胞菌,采用K-B法测定铜绿假单胞菌对抗菌药物的耐药性,用聚合酶链反应(PCR)检测其外排泵基因并用琼脂糖凝胶电泳对多药耐药菌株进行同源性分析,数据采用WHONET 5.6软件进行统计分析。结果铜绿假单胞菌对多数抗菌药物耐药,且耐药率呈逐年上升趋势;在124株多药耐药铜绿假单胞菌中74株MexAB-OprM外排泵表型阳性;脉冲场凝胶电泳分为75个基因型,同一型的几乎来自同一科室,主要分布在ICU和呼吸科。结论医院分离的多药耐药铜绿假单胞菌外排泵以MexAB-OprM最多,其广泛存在是铜绿假单胞菌产生多药耐药的主要机制之一;分型主要有5个基因型,其他均为散发菌株,并无暴发流行趋势。     

铜绿假单胞菌群体感应系统中1asR／rh1R基因缺陷对生物膜形成的影响

目的研究lasR／rh1R基因缺陷对铜绿假单胞菌（PAE）体外生物膜形成的影响。方法采用生理盐水一吸痰管系统进行铜绿假单胞菌体外生物膜的培养，于3d后用扫描电子显微镜观察PAE01野生型、PAE01 lasR、PAE01rh1R、PAE01 lasRrh1R基因缺陷型菌株形成生物膜的情况。结果3d后PAE01野生型可形成较厚、有孔状通道的成熟生物膜结构，PAE01 lasR、PAE01rh1R、PAE01 lasR rh1R基因缺陷型黏附、聚集形成明显稀薄的早期生物膜结构。结论lasR rh1R基因缺陷可影响铜绿假单胞菌体外形成生物膜的能力。