PCR—SBT法HLA基因分型模棱两可结果的判读及解决对策

目的研究PCR—SBT法HLA基因分型结果判读中出现的模棱两可问题并提出解决策略。方法对306名随机抽取的组织配型患者的DNA采用PCR-序列特异性引物（Sequence Specific Primer,SSP）低分辨方法检测,同时采用PCR—SBT法进行HLA—A,B,DRB1高分辨基因分型。PCR—SBT法模棱两可结果用PCR—SSP高分辨方法复核确认。结果所有306例检测标本的高低分辨血清学抗原一致,经PCR—SBT基因测序方法检测有111份模棱两可结果,占36．3％（111／306）。其中HLA—A座位有30对等位基因存在模棱两可结果,占所有检测标本等位基因总数的3．3％;HLA—B座位有66对,占7．2％;HLA—DRB1座位有36对,占3．9％。所有模棱两可标本经PCR—SSP HLA基因高分辨分型试剂PCR—SSP等方法复核确认。结论针对PCR—SBT法进行HLA—A,B,DRB1高分辨基因分型模棱两可结果所建立的解决策略,对于提高HLA数据分型的速度和分型准确性有重要意义。     

应用PCR-SSP和SSOP对HLA-I类进行基因分型

目的 :探讨序列特异性引物 -聚合酶链反应 (polymerasechainreaction sequence specificprimer ,PCR SSP)方法和多聚酶链反应序列特异性寡聚核苷酸探针 (PCR sequence specificoligonucleotideprobes ,PCR SSOP)技术在HLA I类基因分型的应用价值。方法 :研究样本 3 0份 ,为等待肾移植供、受者外周血。采用PCR SSOP反向杂交技术对HLA I进行基因分型 ,并将两种方法分型结果进行比较研究。结果 :所有样本进行HLA I分型均获得成功 ,分型结果PCR SSOP与PCR SSP相符率为 93 3 % ,SSOP分辨率较SSP高。结论 :PCR SSP方法快捷简便 ,适用于少量标本。PCR SSOP分型方法准确率与SSP接近 ,分辨率高 ,虽检测单份标本耗时较长 ,却可同时检测大批量的样本 ,适应临床器官移植组织配型短时高效的需要     

脐血HLA-Ⅰ类抗原血清学分型与基因分型的比较研究

目的　探讨血清学分型方法在脐血HLA分型中的应用价值。方法　对 180 0份脐血的HLA AB分型结果进行分析 ,并与其中随机抽取的 36份标本的聚合酶链反应 序列特异性引物 (PCR SSP)分型结果进行比较分析。血清学分型分别以T免疫磁珠和淋巴细胞分层液分离细胞。结果　T免疫磁珠分离的T淋巴细胞比淋巴细胞分层液分离的单个核细胞活性更好 ;体外搁置时间较长 (2 4～48h)的脐血须用T免疫磁珠分离细胞 ;与外周血单个核细胞相比 ,脐血细胞的血清学反应强度偏低。除 2 8份因细胞分离后量少或活性低外 ,1772份脐血标本的HLA AB血清学分型中 17.5 % (310份 )有不能确定的抗原 ,其主要原因依次为交叉反应及部分分型试剂特异性不高、部分抗原反应弱、细胞活性低所致的高本底及非特异反应。 36份标本PCR SSP分型均获成功 ,与之对照 ,血清学分型有 16 .8%的错误率 ,13.9%分辨率低于PCR SSP分型。结论　血清学分型方法虽快速简便 ,但有一定的误差 ,用基因分型作为补充是必要的。     

中华骨髓库HLA分型质控工作中分型结果错误原因的分析及探讨

目的对中国造血干细胞捐献者资料库（简称中华骨髓库）中人类白细胞抗原（HIA）分型数据质控抽枪中发现的错误分型情况进行归纳总结，探讨其产生的原因及解决策略，以提高造血干细胞捐献者HLA分型的准确性。方法采用聚合酶链反应（PCR）-序列特异件引物（sequence specific primers, SSP） 、PCR-序列特异性寡核苷酸探针（sequence specific oligonucleotide probes, SSOP）及基因测序（ sequence based typing,SBT）分型方法，对中华骨髓库按比例随机抽取的7313份已完成HLA-A、B、DRB1基因分型的标本进行复检，使用与所抽检标本原始分型试剂小同的试剂盲检，对结果不符者，采用第3种试剂及其原始分型试剂复检；对于难以确定的结果，采用SBT方法确认。采用直接计数法进行HLA差错统计。结果质控抽检6期共7313份标本，发现HLA分型结果错误标本数183份，平均错误率为2．50％。HLA基因分型错误率逐年降低，6期错误率分别为8．18％、3．84％、2．85％、1．70％、1．10％、0．84％。HLA-A位点错误率为0．49％，其中漏检现象占A位点错误的61．11％；HLA-B位点错误率为0．85％，其中以同一宽特异性组之间的业型判断错误者居多，占B位点错误的41．94％；HLA-DRB1位点错误率为0．66％；另外，可能由于标本搞错导致的HLA-A、B、DRB1 3个位点分型全错有41例，错误率为0．56％。结论错误产生的原因有实验人员的技术操作水平及工作责任心上的原因，也有分型方法及试剂本身的原因。采用DNA分型技术，使用特异性、重复性好的合格试剂及加强质控监督，有助于提高HLA分型的准确性，并将有助于提高骨髓库造血干细胞捐献者HLA分型的质量。     

新生儿脐血AB0血型鉴定结果质量控制方法探讨

本研究探讨一种新生儿脐带血ABO血型鉴定的质量控制方法。采用血型血清学试验对脐血标本作ABO血型鉴定,对不能定出结果的疑难血型采用聚合酶链反应-序列特异性引物（Sequence Specific Primer PCR,PCR—SSP）作进一步确认。结果表明：在76120例脐血AB0血型正定型鉴定中,检出78例ABO血型弱抗原反应和难以判定血型结果的疑难标本（1％。）,经复查排除了弱凝集反应30例。检测260例脐血ABO血型反定型,相符血型148例（56．92％）,不相符血型112例（43．08％）。PCR—SSP基因分型检测58例中45例血清学表型结果与基因分型结果一致,3例表型结果与基因定型结果不相符,10例正反定型不相符标本,基因分型结果与正定型完全一致。结论：采用红细胞抗原（正定型）方法结合DNA基因分型技术检测新生儿脐带血抗原反应弱、抗体效价低的ABO血型质控效果好,是一种高效、灵敏的质量控制方法,适用于新生儿脐血AB0疑难血型的鉴定。     

HLA-DRB1高分辨测序分型与48例非亲缘性脐血移植者GVHD相关性分析

1998年6月至2003年7月，广州脐血库向国内21家移植中心提供非亲缘异基因脐血移植54例。本研究采用PCR产物直接测序法对HLA—DRB1进行高分辨分型（PCR—sequencing based typingPCR—SBT），并结合HLA—SSP低分辨分型结果，探讨非亲缘性脐血移植供／受者HLA—DRB1等位基因及其亚型与脐血移植GVHD发生率的关系。利用盐析或柱提法提取48例非亲缘性脐血及移植患者全血DNA，采用HLA—SBT方法分别对HLA—DRB1等位基因进行高分辨分型，并与HLA—SSP（HLA—sequencing specific primers）低分辨结果进行比较分析。结果表明：采用双盲法对48例非亲缘性脐血移植供／受者样本HLA—DRB1进行高分辨分型，结果HLA—DRB1等位基因亚型匹配全相合病例的GVHD发生率（25％）显著低于不完全相合病例的GVHD发生率（65．6％）（P=0．008）。结论：对HLA—DRB1采用高分辨分型方法在非亲缘性脐血移植HLA分型方面具有重要的临床应用价值。     

HLA-B血清学纯合型标本的PCR-SSP基因分型

目的 探讨血清学和PCR—SSP 2种方法在HLA-B位点分型的应用价值。方法 对血清学分型HLA—B位点纯合型标本,用PCR—SSP方法进行基因分型。结果 血清学分型为纯合型的75例标本中,PCR—SSP方法基因分型有12例为杂合型。结论 HLA—B的PCR—SSP基因分型结果准确、可靠,而血清学分型方法成本低,快速简便。     

羊水细胞ABO血型序列特异性引物-PCR法基因定型研究

目的探讨羊水细胞采用序列特异性引物-聚合酶链反应（PCR—sequence specific primers,PCR—SSP）法进行胎儿ABO血型基因定型检测的可靠性。方法28例孕妇羊水细胞采用PCR—SSP法进行胎儿ABO血型基因定型检测,对应胎儿出生后进行ABO血型血清学定型。结果28份羊水细胞中27份ABO基因定型结果与胎儿出生后血清学定型结果相符。结论PCR—SSP方法检测羊水细胞AB0基因型能较准确判定胎儿AB0血型,可用于产前胎儿ABO血型检测。     

应用反向斑点杂交技术进行脐血HLA-DRB基因分型方法的建立

HLA分子的多态性对于移植有十分重要的意义。常用的HLA基因分型方法中SSOP基因分型方法有较高分辨率，但操作过程复杂，仅适于大样本的HLA分型。PCR－SSP基因分型方法分辨率较低，但操作过程简单，适于临床要求。有必要建立一种简便、快速、价廉、高分辨率的基因分型方法。本研究取63份已知HLA－DRB型的脐血标本，经盐酸胍方法提取DNA用于反向斑点杂交（RDB）基因分型，同时采用SSOP和PCR－SSP方法进行比较。结果表明，所有样本用RDB方法基因分型均获得成功，可准确地分辨60个HLA－DRB等位基因，且结果与用SSOP和PCR－SSP方法的结果完全一致。结论提示，RDB方法可准确地分辨HLA－DRB等位基因，分辨率高，操作简单，适用于各种情况的HLA分型。     

人类白细胞抗原(HLA)基因分型在造血干细胞移植中的应用

目的提高造血干细胞移植供、受者HLA配型的精确度，有效防止移植物抗宿主病Graft—vs host disease（GVHD）的发生。方法采用准确、简便的DNA提取方法和PCR—SSP基因分型方法。建立HLA—A，B，DR基因分型方法。结果对167例临床标本进行基因水平的研究发现。DNA提取方法可以满足此项研究对样本的要求。HLAPCR—SSP基因分型方法具有良好的稳定性、可靠性和特异性。结论HLA基因分型方法准确、特异、重复性好．可作为临床造血干细胞移植配型和正常人群无关供者筛选的常规方法。对（GVHD）的发生必将起到重要的预防作用。     

河南省骨髓库汉族捐献者HLA-A、B、DR高分辨基因多态性调查分析

背景:2009年开始,中华骨髓库加大HLA高分检测的力度,可缩短配型检索周期,提高配型成功率.目的:统计分析河南省骨髓捐献者HLA-A、B、DRB1高分辨基因多态性.方法:河南省汉族造血干细胞志愿捐献者血样3 874人份,志愿捐献静脉血,EDTA抗凝.采用SSO HD 荧光微珠流式高分辨HLA-A、B、DRB1基因分型检测方法,对3 874份骨髓捐献志愿者血样进行高分辨分型检测,用PCR-SSP高分辨检测、SBT检测解决存在的模棱两可问题.等位基因计数法计算等位基因的基因频率.结果与结论:共检出A 34个,B 84个,DRB1 50个,A位点基因频率处于前5位的有A*0201(0.160 9)、A*1101(0.162 7)、A*2402(0.160 2)、A*3001(0.080 8)、A*3303(0.078 9);B位点处于前5位的是B*1302(0.077 7)、B*4001(0.072 2)、B*5101(0.062 8)、B*4601(0.061 2)和B*0702(0.050 7);DRB1位点处于前5位的是DRB1*1501(0.146 9)、DRB1*0901(0.131 8)、DRB1*0701(0.121 1)、DRB1*1202(0.061 2)、DRB1*0405(0.058 2).     

HLA新等位基因HLA-B~＊5145的确认

背景：作者在用美国onelamba试剂公司生产的HLA低分辨试剂进行分型实验时,将反应结果导入HLA数据分析软件,发现HLA-B位点反应格局异常,且阴性磁珠和阳性磁珠反应情况良好,但是分析软件并未给出相应结果,怀疑有新基因的可能。目的：发现和认定1个HLA新等位基因。方法：采集中华骨髓库造血干细胞捐献者血样,应用PCR-SSO基因分型技术筛选可能的新等位基因,PCR产物测序和DNA基因克隆测序,分析基因序列。结果与结论：PCR-SSO基因分型显示,供者HLA-A位点基因型为A＊02XX,A＊33XX;HLA-DRB1位点基因型为DRB1＊1202,DRB1＊1302,HLA-B位点反应格局异常,不能指定任何HLA-B位点的等位基因,提示B＊44XX,B＊53XX;90FN,91FP,调整不合理,故进一步用其他试剂（Dynal,PCR-SSO）分型方法进行分析,也显示无法判定的结果。等位基因HLA-B＊5145是HLA-B＊5106的变异体,该基因和B＊5106的差异在第3外显子的339位碱基A→G,引起相应编码氨基酸113位上的N（天冬酰胺,Asn）→D（天冬氨酸,Asp）,346位碱基A→C,引起相应编码氨基酸115位上的Y（酪氨酸,Tyr）→S（丝氨酸,Ser）,362位碱基A→G,则不引起相应编码氨基酸120位上的K（赖氨酸,Lys）的变化。该基因为新等位基因,2006-10被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名HLA-B＊5145。     

成人移植双份脐血植入状态的定量监测

背景:脐血因所含的有核细胞数量有限,主要应用于儿童患者,近年来,人们尝试将两份脐血混合输入,用于成人血液系统疾病的治疗。目的:定量监测双份异基因脐血用于成人白血病患者移植后两份脐血的植入状态、嵌合体类型、相对数量的动态变化及演变规律。设计:以脐血干细胞移植的供受者为观察对象,供受者移植前及受者移植后不同时间段的系列血样提取DNA作为检测标本,短串联重复序列遗传位点为观察指标。单位:深圳市血液中心输血医学研究所免疫遗传重点实验室。对象:纳入2005-06在北京大学深圳医院住院治疗的急性髓细胞白血病患者,男性,43岁,体质量75kg。首次化疗完全缓解后6个月移植两份人类白细胞抗原(HLA)各一个位点不合的非血缘脐血,脐血1有核细胞数为2.5×107kg-1;脐血2有核细胞数为1.53×107kg-1。脐血来源于广州脐血库。患者对治疗方案知情同意。方法:采用荧光标记复合扩增短串联重复位点嵌合体定量检测技术,对急性髓细胞白血病成人患者移植两份(脐血1有核细胞数为2.5×107kg-1,脐血2有核细胞数为1.53×107kg-1)HLA各一个位点不相合的异基因脐血前后的序列血样进行了9个短串联重复序列位点的检测,利用供、受者之间的差异位点定性判断脐血是否植入以及嵌合体类型;而后根据377XLDNA测序仪上荧光扫描后两供者差异基因检出峰的峰面积计算脐血植入后患者体内两份脐血的相对数量,定量分析供体细胞植入程度及演变规律。并与采用HLA差异基因对植入状态的分析结果进行对比。主要观察指标:在成人移植双份脐血后,观察患者及两供者9个位点的短串联重复序列基因在患者体内的转变过程,对植入状态进行定量及定性的描述。结果:移植后15d两份脐血植入状态为完全双份供者嵌合体,患者体内脐血1的相对细胞数量占51.3%,脐血2占48.7%;30d时脐血1上升为70.0%,脐血2下降为30.0%。52d时只检测到脐血1的基因,植入状态转为完全单份供者嵌合体,有核细胞数少的一份脐血被排斥,有核细胞数多的一份长期植入。结论:荧光标记复合扩增短串联重复序列嵌合体定量检测可精确地描述两份脐血的植入程度及变化过程,为临床脐血的应用及供者的选择提供了一个准确、可靠的实验依据,证明双份HLA各一个位点不合的脐血同时用于成人的移植是可行的。     

HLA 高分辨分型在非亲缘双份脐血移植中的应用价值简

本研究探讨人类白细胞抗原（HLA）高分辨在脐血移植中的应用价值及对移植预后的影响.对34名患有恶性血液病患者行非亲缘双份脐血移植,采用DNA序列测序方法（SBT）、序列特异性寡核苷酸探针（SSOP）和高分辨序列特异性引物（SSP）分型方法,对供、患者双方行低分辨HLA-A,B,DRB1及高分辨HLA-A,B,Cw,DRB1,DQB1配型,对比分析其在优势脐血植入、造血重建时间、急性移植物抗宿主病（aGVHD）及移植后感染之间的差异.结果表明,总有核细胞（TNC）中位数为6.0×10 7/Kg,当TNC≥5×107/kg时,可缩短中性粒细胞植入时间（P＜0.05）,HLA高分辨（6-10）/10组在脐血优势植入、血小板植入时间、aGVHD发生方面优于（4-5）/10组（P＜0.05）.高分辨HLA-Ⅰ＋Ⅱ类位点错配、HLA-DRB1、DQB1位点不合,能延长血小扳植入时间（P＜0.05）.低分辨HLA （5-6）/6组与4/6组相比,在优势脐血植入无显著性差异（P＞0.05）,但在血小板植入时间及aGVHD的发生方面HLA-5/6优于4/6组（P＜0.05）.供受体性别、血型等对造血重建、优势脐血重建、GVHD的发生均未见统计学差异及与血小板及中性粒细胞植入时间均无相关性.结论：对非亲缘脐血移植受体和移植物进行HLA高分辨配型有利于遴选最佳脐血,在促进造血重建及降低移植后并发症方面具有重要的临床应用价值.     

影响肾移植组织配型标本采集的相关因素分析

目的 探讨器官移植组织配型血液标本的质量影响因素。方法 对１ ３５６人次肾移植组织配型标本采集情况进行回顾性分析。结果 共采集１ ３５６人份血液标本进行ＨＬＡ分型和群体反应性抗体（ＰＲＡ）检测。合格标本１ ０２６份，不合格标本３３０人份，合格率３３０人份，合格率７５．６６％。结论 标本血量、采集时间、抗凝方法、储存方法是器官移植组织配型血液标本质量的主要影响因素。     

河南省骨髓库汉族捐献者HLA-A、B、DR高分辨基因多态性调查分析

背景：2009年开始,中华骨髓库加大HLA高分检测的力度,可缩短配型检索周期,提高配型成功率。目的：统计分析河南省骨髓捐献者HLA-A、B、DRB1高分辨基因多态性。方法：河南省汉族造血干细胞志愿捐献者血样3874人份,志愿捐献静脉血,EDTA抗凝。采用SSOHD荧光微珠流式高分辨HLA-A、B、DRB1基因分型检测方法,对3874份骨髓捐献志愿者血样进行高分辨分型检测,用PCR-SSP高分辨检测、SBT检测解决存在的模棱两可问题。等位基因计数法计算等位基因的基因频率。结果与结论：共检出A34个,B84个,DRB150个,A位点基因频率处于前5位的有A＊0201（0.1609）、A＊1101（0.1627）、A＊2402（0.1602）、A＊3001（0.0808）、A＊3303（0.0789）;B位点处于前5位的是B＊1302（0.0777）、B＊4001（0.0722）、B＊5101（0.0628）、B＊4601（0.0612）和B＊0702（0.0507）;DRB1位点处于前5位的是DRB1＊1501（0.1469）、DRB1＊0901（0.1318）、DRB1＊0701（0.1211）、DRB1＊1202（0.0612）、DRB1＊0405（0.0582）。     

PCR-SSO流式荧光微珠法HLA-A~＊02高分辨分型检测模棱两可结果的统计分析

背景：由于HLA的复杂多态性,实际分型过程中难免会出现一些结果判读模棱两可现象。目的：统计分析基于PCR-SSO流式荧光微珠HLA-A＊02高分辨分型方法的模棱两可组合结果种类、比例,探讨解决模棱两可解决方法,提高高分辨分型比例。方法：对河南骨髓库捐献者1100人份HLA分型结果进行统计分析,计数法进行分类统计分析软件给出的包含HLA-A＊02：01／02：09模棱两可组合代码,计算百分比;与确认为A＊02：09的基因多态性分布进行比对,找出与A＊02：09关联性较强的等位基因,用补充实验进行复核、确认,建立A＊02：01／02：09模棱两可组合的判读方法。结果与结论：1039例有效数据中包含A＊02：01／02：09模棱两可组合279例（279/1039,26.853%）,代码种类19种,检出比例较高的有DMDC,DYVK,GMDD,GMDE;34例确认为A＊0209的基因多态性统计显示A＊0209的出现与A＊11：01（0.1471）B＊07：02（0.2647）、DRB1＊01：01（0.2647）、DRB1＊03：01（0.1176）有较强关联,选出高风险标本38例,经检测外显子1～7,并用SBT复核确认有1例结果为A＊02：09（代码组合为GMDC）,其余241例未检出A＊02：09。提示A＊02：09的出现与B＊07：02、DRB1＊01：01、DRB1＊03：01有较强关联,重点对这些关联标本进行外显子1～7检测,可有效地检出A＊02：09。通过统计分析制定合理的判定规则和必要的复核实验可有效地简化操作程序,节省时间,降低费用,提高高分辨比例。     

流式细胞仪检测HLA-B_(27)抗原初探

目的　建立一种快速、准确的HLA B2 7检测技术。方法　利用流式细胞仪 (FCM)检测HLA B2 7抗原 ,并将结果与基因定型法比较 ,74例临床样本分别用FCM法、PCR ASP基因定型法检测HLA B2 7抗原和基因。结果　FCM法有 2 2例HLA B2 7阳性 ,5 2例阴性 ,与PCR ASP法结果比较 ,阳性符合率 88% ,阴性符合率 10 0 % ,总观察一致率 95 .9% ,二种检测方法无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论　可以认为 ,FCM法检测HLA B2 7具有快速灵敏、多参数检测等优点 ,针对不同的样本来源和临床要求 ,与PCR ASP法配合使用 ,能在临床强直性脊椎炎等疾病诊断中发挥重要作用