CFP21-ELISPOT方法的建立及其在结核分枝杆菌感染诊断中的应用

目的用酶联免疫斑点试验(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)评价检测CFP21蛋白在结核分枝杆菌感染中的诊断效果,同时,比较CFP21、CFP10和ESAT6的应用价值。方法取28例临床确诊结核患者和26例健康志愿者外周血,分离单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),用CFP21、CFP10和ESAT6蛋白刺激,定量检测PBMC分泌的特异性γ干扰素(IFN-γ)水平,判断结核分枝杆菌感染情况。用ELISA检测血清抗结核抗体。结果 ELISA检测结核病患者血清结核抗体阳性率为57.1%;以CFP21、CFP10和ESAT6为抗原,用ELISPOT方法检测结核病患者IFN-γ阳性率分别为25.0%、39.3%和32.1%。结论应用CFP21蛋白作为抗原建立的ELISPOT方法有潜在的临床应用价值,但CFP21作为抗原用于结核分枝杆菌感染诊断的敏感性低于CFP10和ESAT6。     

HIV合并结核潜伏感染患者CD_4~+细胞免疫功能影响的研究

目的观察HIV合并结核潜伏感染患者CD+4细胞免疫功能影响。方法选取136例HIV感染者,分别进行PPD和ELISPOT检测确定HIV合并结核潜伏感染者,随后通过流式细胞术检测治疗前后患者CD+4细胞的变化。结果 PPD试验对结核菌抗原阳性反应为3.4%;ELISPOT检测阳性率为20.6%,高于PPD皮试阳性率。流式结果显示HIV感染患者CD+4细胞数小于50/μl共有25例,51-200/μl有64例,大于200/μl有47例,各组ELISPOT检测阳性率分别为4%,28.1%和14.9%。9例HIV合并结核潜伏感染患者治疗9个月后,ELISPOT检测斑点中位数减少61.6%。结论 HIV合并结核潜伏感染者CD+4细胞明显降低,且普遍低于200/μl。     

结核分枝杆菌CFP32蛋白的原核表达及其细胞免疫学检测价值评价

目的 克隆、表达与纯化结核分枝杆菌CFP32蛋白,并对其进行细胞免疫学特性评价。方法 PCR扩增cfp32基因片段,与pET-30a(+)构建重组表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达,对融合蛋白进行纯化,ELISPOT试验测定其细胞免疫应答,通过牛结核外周血IFN-γ释放试验,评价其作为刺激原的能力。结果 构建了正确基因序列的重组质粒,并在BL21(DE3)中高效可溶性表达,融合蛋白大小为32 ku,纯度达91.8%。ELISPOT显示CFP32蛋白刺激机体分泌IFN-γ和IL-4的细胞数相当,呈现Th1/Th2的平衡。在牛结核外周血IFN-γ释放试验中,其阳性符合率和阴性符合率分别为40%和73.3%,与牛型PPD刺激结果的相关系数为0.684。结论 成功构建CFP32蛋白重组表达菌,该蛋白引起的免疫应答趋向于Th1/Th2的平衡,并且有作为刺激原用于牛结核病检测的潜力。     

CFP10-ESAT6融合蛋白用于结核分枝杆菌感染诊断ELISA方法的初步研究

目的 制备结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白,探讨CFP10-ESAT6融合蛋白在结核分枝杆菌免疫诊断中的应用价值。方法 PCR扩增得到CFP-10、ESAT6基因片断,将其先后克隆入pET-28a表达载体。优化表达条件、用镍亲和层析的方法纯化带His标签的重组CFP10-ESAT6融合蛋白(rCFP10-ESAT6)。制备兔多克隆抗体,建立rCFP10-ESAT6为抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,以健康者血清为对照,检测170例结核患者血清的抗体。结果 重组质粒 pET28a-CFP10-ESAT6靶基因测序结果与预计设计完全一致。融合蛋白在E.coli BL21(DE3)工程菌中均为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的40%。利用金属螯合亲和层析直接纯化重组蛋白,纯度达到95%以上。Western blot分析表明,重组蛋白能与结核患者血清发生特异性免疫结合反应,与健康者血清不发生反应。CFP10-ESAT6的兔多克隆抗体的效价为1∶8 000,CFP10-ESAT6作为包被抗原的检测结核病人血清中特异性抗体的间接ELISA最佳包被浓度为0.002 μg/mL,患者血清的最佳稀释度为1∶500。检测结果与临床诊断的符合率,ELISPOT>ELISA(rCFP10-ESAT6)>ELISA(kit)。结论 CFP10-ESAT6融合蛋白具有较高的抗原特异性和免疫反应性,有可能成为结核病免疫学诊断的特异抗原,对结核的诊断具有重要参考价值。     

重组分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32的表达及其抗原性

目的 重组表达结核分枝杆菌CFP10和ESAT 6的融合蛋白及卡介苗（BCG）CFP32,分析其抗原性。 方法 用重组PCR从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA中扩增获得融合基因cfp10-esat6;从BCG基因组DNA中扩增cfp32基因。经克隆和测序分析后,分别亚克隆至表达载体pQE-30和pET-23a(+),在大肠埃希菌BL21中表达重组蛋白,予以纯化、 鉴定,Western blot和间接ELISA分析重组蛋白的抗原性。 结果构建了重组表达质粒pQE30-cfp10-esat6和 pET-cfp32,表达了CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32。CFP10-ESAT6蛋白表达量约占菌体总蛋白的15.2%,纯化后蛋白纯度约为92%,浓度为0.456-g/L;CFP32蛋白表达量约占菌体总蛋白的10.6%,纯化后蛋白纯度约为90%,浓度为0.310-g/L。纯化CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32检测结核病的敏感性分别为85.7%和71.4%,特异性均为100%。 结论 重组表达获得具有良好抗原性的重组融合蛋白CFP10-ESAT6和重组蛋白CFP32。     

三种结核分枝杆菌分泌蛋白的抗体制备及其在抗原检测中的应用

目的制备结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6、MPT64和MPT63-MPT70重组蛋白抗体，探讨其在检测结核抗原中的应用价值。方法应用重组蛋白CFP10-ESAT-6、MPT64和MPT63-MPT70免疫血清，制备包被抗体和标记抗体，建立检测3种蛋白的双抗体夹心法，并将其用于17种分枝杆菌培养上清液和341份临床血清标本的检测。结果CFP10-ESAT-6的最低检出浓度为25ng／mL，MPT64和MPT63-MPT70均为50ng／mL。CFP10-ESAT-6检测17种分枝杆菌培养上清液，只有结核分枝杆菌为阳性；而MPT64和MPT63-MPT70检测除结核分枝杆菌阳性外，还各有5种非结核分枝杆菌培养上清液为阳性结果。CFP10-ESAT6、MPT64和MPT63-MPT70检测165例临床诊断的肺结核患者血清标本阳性率分别为33．9％、41．2％和47．9％；检测112例非结核患者血清标本的假阳性率分别为1．8％、7．1％和10．7％；检测64例健康对照的假阳性率分别为0、3．1％和7．8％。结论CFP10-ESAT-6、MPT64和MPT63-MPT70重组蛋白制备的抗体检测血清标本结核抗原的阳性率均不高，但特异性较好。     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-CFP21融合蛋白克隆表达及全血IFN-γ的检测

目的构建结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6-CFP21(CE21)融合蛋白的重组质粒,通过IFN-γ的检测探讨CE21在结核病检测中的价值。方法通过聚合酶链式反应(PCR)扩增获得CFP21和CFP10-ESAT-6(CE)基因片段,分别连接到pMD18-T,并将两片段2次连接到表达载体pET21a(+)中,获得pET21a-CFP10-ESAT-6-CFP21重组质粒;经表达纯化和复性后,去除内毒素,利用酶联免疫吸附试验检测48例结核病患者、30例非结核肺部疾病患者及32例健康对照者全血中IFN-γ的释放量。结果CE21经SDS-PAGE分析后相对分子质量为45,与预期大小一致。CE21融合蛋白全血标本IFN-γ的检测,结核组阳性率为72.9%,非结核疾病对照组和健康对照组阳性率分别为3.3%和3.1%。结论成功获得CE21融合蛋白,IFN-γ的检测证明该融合抗原具有良好的结核病检测价值。     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达

目的　在大肠杆菌中高效融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT 6和CFP 10 ,获得纯化的重组ESAT6 CFP10 (rCFP10 ESAT6 )融合蛋白抗原。方法 通过聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)扩增CFP10 ESAT6融合基因 ;以质粒pET 2 8a为表达载体 ,构建重组质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ;以异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达目的蛋白 ,通过SDS PAGE电泳和蛋白免疫印迹法 (Westernblotting)鉴定rCFP10 ESAT6在大肠杆菌中的表达 ,确定rCFP10 ESAT6蛋白抗原在大肠杆菌中的表达形式 ;采用ChelatingSepharoseFastFlow蛋白纯化试剂纯化重组蛋白。West ernblotting及酶联免疫吸附试验 (ELISA)分析重组蛋白的免疫原性。结果 重组质粒pET2 8a CFP10 ESAT6中目的基因测序结果与报道序列相同 ;在大肠杆菌中以可溶性形式表达 ;分子量约2 8kDa ,表达量约占菌体总蛋白的 4 6 % ,纯化后的rCFP10 ESAT6样品经SDS PAGE和激光密度扫描分析表明其纯度为 90 %左右 ,每 10 0ml培养菌可获得 16mg左右的重组蛋白 ;Western印迹结果证实重组蛋白与His·tag单克隆抗体及确诊的肺结核病患者血清发生特异免疫反应。ELISA结果分析表明 ,该重组抗原能区分肺结核患者血清及正常人血清。结论 成功地表达和纯化了结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白。该重组蛋白具有特异的免疫原性。     

结核分枝杆菌RD1区编码蛋白ELISPOT辅助诊断活动性结核病的应用价值

目的 比较E/C联合Rv3879c蛋白作为抗原的ELISPOT和T-SPOT.TB试剂盒,探讨其在活动性结核病诊断中的应用价值.方法 选取初治结核病患者106例作为结核组,43例肺部其它疾病患者做为疾病对照组和48例健康者做为健康对照组,应用T-SPOT.TB和ELISPOT检测受试者外周血单个核细胞的斑点形成细胞数量,同时对受试者行T研.结果 T-SPOT.TB和ELISPOT在结核病组中的敏感度分别为92.5％和93.4％,TST阴性对照组中的特异度均为91.5％,在健康者中的阳性率分别为18.8％和16.7％,且两种方法差异无统计学意义(均P＞0.05).结论 E/C联合Rv3879c蛋白作为抗原的ELISPOT能够诊断活动性结核病,并为结核感染诊断提供一定的依据.     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-Rv3425基因片段融合蛋白的表达与纯化

目的克隆表达结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-Rv3425基因片段融合蛋白并纯化,测抗原的免疫原性,为结核病的临床诊断提供有效的候选抗原。方法利用生物信息学分析免疫优势位点,设计不同引物,采用聚合酶链反应（PolymeraseChain Reaction,PCR）扩增出相应基因片段,插入pET30a表达载体,转入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达目的蛋白,亲和纯化后用H37Rv免疫的兔血清进行间接酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定其免疫原性。结果 PCR扩增的CFP10、ESAT6和Rv33425基因片段与基因文库（Genbank）报道的完全一致。三者在大肠杆菌BL21（DE3）中融合表达的产物约为22kDa,与预计大小相吻合。Ni-NTA亲和纯化出目的蛋白。ELISA显示该蛋白具有较强的免疫原性。结论结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-Rv3425融合基因片段的融合表达纯化后,可作为结核病免疫诊断的一个候选抗原。     

ELISPOT辅助临床结核病诊断价值分析

目的探讨ELISPOT在结核病诊断中的应用价值。方法分离TB患者54例和非TB患者52例的外周血单个核淋巴细胞,并采用以结核分枝杆菌特异性蛋白ESAT-6和CFP-10为抗原的ELISPOT试验技术进行结核分枝杆菌（Mtb）特异性T淋巴细胞免疫反应的检测,同时做痰涂片、痰培养、PPD试验和胶体金法检测。以临床明确诊断为标准,比较分析评价不同检测方法的敏感度和特异度。结果 TB-ELISPOT的敏感度（Se）90.7%、特异度（Sp）96.15%、阳性预测值（PPV）0.96、阴性预测值（NPV）0.91、阳性似然比（＋LR）23.55和阴性似然比（-LR）0.1;胶体金法的Se 59.26%、Sp 88.46%、PPV0.84、NPV 0.68、＋LR 5.14和-LR 0.46;PPD试验的Se 64.81%、Sp 82.69%、PPV 0.80、NPV 3.74、＋LR 0.69和-LR 0.43;痰涂片的Se 40.74%、Sp 100.00%、PPV 1.0、NPV 0.62、＋LR〉10和-LR0.52;痰培养的Se 25.93%、Sp 100.00%、PPV 1.0、NPV 0.57、＋LR〉10和-LR0.77。统计结果显示ELISPOT检测的敏感度明显高于其它常用结核病诊断方法。ELISPOT在痰涂片和痰培养阴性的TB患者中的阳性检出率分别为84.38%和87.5%。结论 ELISPOT是一种敏感度和特异度均较高的结核病免疫学辅助诊断方法,有助于提高诊断结核感染的阳性检出率,且耗时短,可作为临床结核病诊断尤其是菌阴结核病的重要辅助手段之一,具有较高的临床推广价值。     

结核病不同抗原酶联免疫斑点检测的影响因素分析

目的比较不同MTB抗原的酶联免疫斑点检测技术(ELISPOT)与各种影响因素的关系。方法对象对结核组132例和对照组44例观察对象应用PPD、克隆表达的早期分泌抗原靶6000(ESAT-6)和ESAT-6/培养滤液蛋白10000(CFP-10)融合蛋白(E/C)进行酶联免疫斑点检测(ELISPOT),检测外周血单个核细胞(PBMC)中经3种抗原刺激后斑点形成细胞(SFC)的数量。计量资料用中位数(四分位间距)表示,计量资料的比较采用Mann-Whitney u检验,计数资料的比较采用2χ检验。结果 E/C-ELISPOT在治疗时间15 d病例形成的SFC数量少于治疗时间≤15 d形成的SFC数量。E/C-ELISPOT形成SFC数量与其他因素包括年龄、性别、病史等因素影响。PPD-ELISPOT和ESAT-6-ELISPOT形成SFC数量不受年龄、性别、病史、抗结核治疗时间等因素影响。3种抗原ELISPOT的敏感性不受年龄、性别、病史、抗结核治疗时间等因素影响。结论 ESAT6/CFP-10融合蛋白-ELISPOT形成的斑点数受治疗时间影响,可能成为监测抗结核治疗疗效的一项指标。     

T-SPOT.TB与PPD在消化系统结核感染鉴别诊断中的价值

目的评估快速T细胞计数体外酶联免疫斑点技术(T-ELISPOT.tuberculosis,T-SPOT.TB)与PPD试验在消化系统结核感染的诊断价值。方法回顾性分析2011年6月-2013年7月于南京军区南京总医院消化内科收治的60例患者,其中14例确诊为结核感染的患者,46例为非结核感染的消化系统疾病患者,抽取患者外周血送检,T-SPOT.TB与PPD试验结果的准确性进行比较。结果 14例确诊结核感染患者,46例非结核感染的患者,T-SPOT.TB的灵敏度与PPD试验相近,差异无统计学意义(78.6%vs71.4%,P=1.000);T-SPOT.TB的特异性显著大于PPD试验(91.3%vs 69.6%,P=0.009);T-SPOT.TB阳性预测率显著大于PPD试验(73.3%vs 41.7%,P=0.001);T-SPOT.TB阴性预测率与PPD试验相近,差异无统计学意义(93.3.%vs 91.1%,P=1.000)。T-SPOT.TB与PPD试验在诊断消化系统结核感染方面有较好的吻合性(K=0.341,P=0.018)。结论 T-SPOT.TB应用于消化系统感染的诊断,尤其适合PPD阳性的疑似消化系统结核感染患者的鉴别诊断。     

不同抗原的酶联免疫斑点检测技术对结核病的辅助诊断价值比较

目的 比较不同MTB抗原的酶联免疫斑点检测技术(ELISPOT),探索其对活动性结核病的辅助诊断价值.方法 对结核组132例和对照组90例观察对象应用PPD、克隆表达的早期分泌抗原靶6000(ESAT-6)和ESAT-6/培养滤液蛋白10 000(CFP-10)融合蛋白(简称E/C)进行酶联免疫斑点检测(ELISPOT),检测外周血单个核细胞(PBMC)中经3种抗原刺激后斑点形成细胞(SFC)的数量;对照组同时进行PPD试验.计量资料用中位数(四分位间距)表示,计量资料的比较采用Mann-Whitney μ检验,计数资料的比较采用χ~2检验.结果 结核组PPD-ELISPOT、E/C-ELISPOT、ESAT-6-ELISPOT形成的SFC数分别为255(93～526)、148(40～354)和28(10～116),均明显高于对照组的10(5～41)、10(0～20)和5(0～15),差异均有统计学意义(μ值为1390.5～2510.5,均P＜0.01);E/C-ELISPOT和PPD-ELISPOT的敏感度分别为90.3%和84.8%,均明显高于ESAT-6-ELISPOT(62.1%),差异均有统计学意义(χ~2值分别为17.496和28.541,均P＜0.01);E/C-ELISPOT和ESAT-6-ELISPOT的特异度分别为84.4%和88.9%,均明显高于PPD-ELISPOT(68.9%),差异均有统计学意义(χ~2值分别为6.087和10.808,P＜0.05和P＜0.01).结论 E/C-ELISPOT有可能作为辅助诊断结核病的方法,但其特异度易受MTB潜伏感染的影响.     

Replacing the tuberculin skin test with a specific blood test

For almost 100 years has the tuberculin skin test (TST) been used for the support the diagnosis of active and latent TB infection. The TST test has, however, a number of limitations most notable low specificity in BCG vaccinated individuals due to cross-reactive components in PPD and the M. bovis BCG vaccine strain and an intensive search for new and more specific diagnostic antigens has therefore be ongoing. In this review we describe the discovery process leading to the identification of the M. tuberculosis specific antigens ESAT6 and CFP10; two low molecular weight proteins which are highly sensitive and specific for detection of a M. tuberculosis infection.     

ESAT6和CFP10融合蛋白抑制巨噬细胞自噬体形成的实验研究

目的观察ESAT6和CFP10融合蛋白对感染MTB的巨噬细胞自噬体形成的抑制作用。方法雷帕霉素诱导小鼠巨噬细胞自噬体形成后,用MTB毒株H37Rv感染巨噬细胞,再用25μg/mL的ESAT6-CFP10融合蛋白作用于巨噬细胞,电镜观察自噬体相成的变化,计数MTB的菌落数。提取巨噬细胞总RNA和蛋白,以RT-PCR和免疫印迹方法检测自噬相关基因（atg）表达水平的变化。结果 ESAT6-CFP10融合蛋白后可抑制巨噬细胞中自噬体的形成,显著提高CFU指数（P〈0.05）,并导致atg分子表达水平下降,其中atg8表达量下降最为明显（P〈0.05）。结论 ESAT6和CFP10融合蛋白可通过调控atg表达水平影响巨噬细胞自噬功能。     

Rapid detection of active and latent tuberculosis infection in HIV-positive individuals by enumeration of Mycobacterium tuberculosis-specific T cells

OBJECTIVES: An accurate test for Mycobacterium tuberculosis infection is urgently needed. The tuberculin skin test (TST) lacks sensitivity, particularly in HIV-infected individuals, and has poor specificity because of antigenic cross-reactivity with Bacillus Calmette-Guérin (BCG) vaccination. ESAT-6 and CFP-10 are antigens expressed in Mycobacterium tuberculosis, but not in Mycobacterium bovis BCG and most environmental mycobacteria. We investigated whether T cells specific for these antigens could serve as accurate markers of M. tuberculosis infection in an area of high tuberculosis and HIV prevalence. METHODS: Using the rapid ex-vivo enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for IFN-gamma, we enumerated T cells specific for ESAT-6, CFP-10 and purified protein derivative (PPD) in blood samples from 50 Zambian tuberculosis patients, 75 healthy Zambian adults, and 40 healthy UK residents. TSTs were performed in 49 healthy Zambian adults. RESULTS: All (100%; n = 11) and 90% (n = 39) of HIV-negative and HIV-positive tuberculosis patients, respectively, had detectable ESAT-6- or CFP-10-specific T cells. The ESAT-6/CFP-10-based ELISPOT assay was positive in 37 out of 54 HIV-negative healthy Zambians, suggesting a 69% prevalence of latent M. tuberculosis infection. Fewer HIV-positive Zambians possessed ESAT-6/CFP-10-specific T cells, but the impact of HIV infection was less on this assay than on the PPD-based ELISPOT or TST. CONCLUSION: The ESAT-6/CFP-10-based ELISPOT assay detects active tuberculosis in HIV-positive individuals with high sensitivity. It is more specific, and possibly more sensitive, than PPD-based methods of detecting latent M. tuberculosis infection, and may potentially improve the targeting of isoniazid preventative therapy to HIV-positive individuals with latent tuberculosis infection.