人卵GST-ZP3融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及其免疫原性的检测

目的:在大肠杆菌中表达人卵透明带3(Human zona pellucida3,HuZP3)蛋白并对其进行纯化。方法:将HuZP3基因的核心片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,经过酶切和序列分析后,用重组质粒转化E.coli BL21,经IPTG诱导产生GST-HuZP3融合蛋白并通过Glutathione Sepharose 4B纯化。以纯化的融合蛋白免疫纯系Balb/C小鼠制备抗血清。抗血清的效价采用ELISA检测。结果:成功地构建GST-HuZP3融合蛋白表达载体,并在大肠杆菌中高效表达特异性的GST-HuZP3融合蛋白。以该融合蛋白免疫小鼠获得高效价抗GST-HuZP3抗血清,且该抗血清可识别大肠杆菌表达的重组ZP3。结论:获得高表达的GST-HuZP3融合蛋白并证实其具有良好的免疫原性,可作为抗原研制开发检测不孕妇女体内是否存在抗自身ZP3抗体的诊断试剂盒。     

重组多价人精子表位肽的原核表达及其条件优化

目的构建重组多价人精子表位肽原核表达质粒,优化其在大肠杆菌中的表达条件。方法用化学合成法合成多价人精子表位肽基因。该基因经PCR扩增,BamHI和XhoI双酶切后,克隆至GST融合表达载体PGEX-4T-1获得重组质粒。将该重组质粒转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达。利用SDS-PAGE电泳和AlphaEase凝胶电泳图像分析系统,观察在摇瓶发酵条件下改变培养基组成、诱导温度、诱导时机、诱导剂浓度和诱导时间等条件对GST-多价人精子表位肽融合蛋白表达量的影响。结果构建了重组多价人精子表位肽原核表达载体。在摇瓶实验中,优化的表达条件为:TB培养基,诱导温度37℃,在菌体对数生长的中后期进行诱导,IPTG诱导终浓度0.05 mmol/L,诱导时间5 h。优化后GST-多价人精子表位肽融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的30.2%,且主要以可溶形式表达。结论成功构建重组多价人精子表位肽原核表达质粒,重组表达载体在E.coli BL21(DE3)内主要表达可溶形式的GST-多价人精子表位肽融合蛋白,在优化条件下可获得较高的表达量。     

人卵透明带蛋白原核表达载体的构建

目的:构建人卵透明带蛋白(huZP3)基因原核表达载体。方法:利用PCR法扩增出含人卵透明带蛋白编码基因,先将其克隆到pGEM-T载体,进行序列测定和分析,然后将huZP3蛋白编码基因亚克隆至原核表达载体pGEX4T-1上,酶切鉴定。结果:获得一个核苷酸长度约为1200bp的基因,同源比较结果表明,与GenBank(NCBI:M60504)公布的ZP3基因序列有100%的同源性。酶切表明ZP3基因正确插入原核表达载体pGEX4T-1。结论:成功构建出含ZP3基因的原核表达载体。     

脆性X智力低下蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:在大肠杆菌中对脆性X智力低下蛋白(FMRP)进行重组表达,获得高产量及高纯度的可溶性重组蛋白。方法:以人脑cDNA文库为模板,PCR扩增FMR1基因后将其克隆至融合表达载体pGEX-6P-1中,重组载体转化进入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,并用IPTG进行诱导表达。应用谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B进行亲和层析纯化GST-FMRP融合蛋白,并以SDS-PAGE电泳和Westernblot对融合蛋白的表达进行检测。结果:亲和纯化后的融合蛋白经FMRP及GST单抗分别进行Westernblot鉴定为GST-FMRP融合蛋白。结论:大肠杆菌中FMRPISO10的重组表达产量高,纯化得到可溶性重组蛋白,为FMRP抗体的制备及FXS检测试剂盒的开发奠定基础。     

人源性DNA聚合酶β原核蛋白的表达、蛋白纯化及其功能初探

[目的]利用人源性DNA聚合酶β原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化DNA聚合酶β蛋白,并检测蛋白活性。[方法]将重组质粒pCR-BluntII-TOPO-DNApolβ转化入大肠杆菌E.coli中,IPTG诱导其表达并鉴定。利用金属螯合层析技术进行蛋白纯化,得到人源性DNApolβ融合蛋白,纯化的融合蛋白用EK酶酶切后,通过Ni2+柱纯化获得高纯度的人源性DNApolβ蛋白,电泳迁移率变动分析实验检测DNApolβ融合蛋白的AP修复活性。[结果]转化入大肠杆菌E.coliRosetta2的DNApolβ诱导表达最好,蛋白表达量高。金属螯合层析纯化后得到融合蛋白经EK酶切后得到高纯度的人源性DNApolβ蛋白,EMSA实验证明所纯化的DNApolβ融合蛋白不具有AP修复活性。[结论]利用原核表达载体pCR-BluntII-TOPO-DNApolβ在E.coliRosetta2中表达和纯化获得高纯度的DNApolβ融合蛋白,为下一步开展DNApolβ蛋白的生物学功能研究打下基础。     

人巨细胞病毒US31蛋白的特异性抗体的制备及鉴定

目的 制备人巨细胞病毒(HCMV) US31原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法 HCMV US31基因经原核密码子优化后进行全基因合成,克隆至p ET21a(+)原核表达载体,构建p ET21a(+)/HCMV US31重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达,Ni-NTA亲和层析法纯化US31蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA、Western blot及免疫荧光方法检测抗体效价和特异性。结果 在大肠杆菌中诱导出高表达的HCMV US31融合蛋白,经镍柱亲和纯化后获得高纯度的目的蛋白;免疫新西兰兔诱导产生特异性的Ig G抗体,效价为1∶49 600;经ELISA、Western blot以及免疫荧光均证实制备的特异性抗体可识别细胞中表达的US31蛋白。结论 成功制备了HCMV US31蛋白及特异性抗体,为进一步研究US31蛋白的生物学功能奠定了基础。     

结核分枝杆菌PZase-GST融合蛋白表达与鉴定

目的构建及鉴定含有GST标签的结核分枝杆菌pncA基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中高效表达融合蛋白。方法 PCR扩增结核杆菌pncA基因,并构建到pGEX4T-1上。重组质粒经测序鉴定后进行诱导表达。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析重组蛋白。结果与预期大小相似,PCR扩增出大约600 bp的pncA基因,并且吡嗪酰胺酶(PZase)在诱导后得以高效表达。结论构建了质粒载体pGEX4T-1-pncA,并经诱导后高效表达了PZase融合蛋白,为进一步研究吡嗪酰胺(PZA)耐药性奠定了基础。     

人畸胎瘤衍化生长因子原核表达载体的构建及表达

目的:构建人畸胎瘤衍化生长因子(teratocarcinoma-derived growth factor-1,TDGF-1)原核表达载体,进一步探讨其生物学作用及机制。方法:从人肝癌细胞系HepG2中提取总RNA,利用TDGF-1特异性引物通过RT-PCR方法扩增TDGF-1 cDNA,克隆入pHB载体中,构建重组载体pHB-TDGF-1。将重组载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,并通过SDS-PAGE及免疫印迹法对表达产物进行鉴定。结果:酶切及测序结果显示,重组质粒构建成功;SDS-PAGE及免疫印迹结果显示,所构建的重组载体可在大肠杆菌中高效表达TDGF-1。结论:该研究成功构建了人TDGF-1原核表达载体,并能够在大肠杆菌中有效表达TDGF-1,为进一步研究TDGF-1的生物学功能及其机制奠定了基础。     

新型呼肠病毒S1基因的表达鉴定

目的构建新型呼肠病毒主要抗原蛋白的编码基因S1的重组原核表达质粒,对其在原核细胞内的表达进行研究。方法将S1基因克隆入原核表达载体pProEX HTa,构建重组原核表达载体pPLS,通过IPTG诱导,利用蛋白电泳和蛋白免疫印迹等方法对其在大肠杆菌中的表达进行研究。结果酶切分析表明重组质粒构建成功。SDS-PAGE和Western-blot的检测结果一致表明,诱导后1~5 h均可检测到目的蛋白的表达,其中以5 h的蛋白表达量最大,且表达的目的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在。结论通过构建重组原核表达质粒,可使目的蛋白σ1得到诱导表达,为后续抗体制备及研究病毒-宿主相互作用提供实验基础。     

SARS冠状病毒RNA依赖的RNA聚合酶的原核和真核表达

目的:在大肠杆菌中表达和纯化重组RDRP蛋白,观察RDRP蛋白在293细胞中的表达及亚细胞定位.方法:构建原核表达质粒pGEX-4T-1-RDRP,实现插入基因的融合表达,经GST亲合层析纯化蛋白.构建真核表达载体pCMV-myc-RDRP瞬时转染293细胞,转染48 h后免疫荧光染色,共聚焦显微镜观察蛋白表达及定位以及Western Blotting检测.结果:成功构建了表达RDRP融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌内高效表达,纯化后得到分子量约为121 kDa的融合蛋白.RDRP蛋白在293细胞中高效表达,主要分布在细胞质.结论:获得了重组GST-RDRP融合蛋白,为进一步探讨RDRP的功能奠定基础,在真核细胞中过表达的RDRP蛋白主要定位在细胞质.     

家蝇幼虫抗菌肽diptericin2基因的克隆及原核表达-鉴定

目的扩增出全长diptericin2基因,并构建表达pGEX-4T-1/diptericin2重组蛋白。方法运用经典的5′末端扩增法(5′-Full RACE)法,通过双酶切、连接反应,将目的基因片段定向插入到表达载体pGEX-4T-1上,转化大肠埃希菌BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析diptericin2重组蛋白的表达情况,蛋白质印迹实验(Western-blotting)对其进行了鉴定。结果获得目的片段468bp的家蝇抗菌肽diptericin2基因(GENBANK登录号FJ795370),双酶切鉴定及DNA测序结果显示,目的基因diptericin2已成功连接到表达载体pGEX-4T-1上,SDS-PAGE结果显示表达产物相对分子质量约为27 kDa。结论扩增出了全长diptericin2基因并成功构建pGEX-4T-1/diptericin2重组蛋白原核表达系统,融合蛋白以包涵体形式在大肠埃希菌BL21中表达,为下一步研究其生物活性打下初步的基础。     

结核分枝杆菌PPE60的GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达和鉴定

目的构建结核分枝杆菌PPE60的GST融合蛋白表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板,经PCR技术扩增目的基因,将目的基因克隆到pGEX-4T-1载体中,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆。进行质粒的酶切鉴定和序列分析;对重组的大肠杆菌进行诱导表达,SDS-PAGE分析菌体蛋白,凝胶密度扫描分析目的蛋白的表达情况,Western-blot鉴定融合蛋白。结果正确构建了pGEX-PPE60融合表达载体,载体能在大肠杆菌中表达分子量约为70 kDa的重组蛋白,占菌体总蛋白的50%。该融合蛋白能与GST抗体产生阳性反应。结论成功构建了GST-PPE60融合蛋白的表达载体,并能在大肠杆菌中高效表达,为PPE60蛋白的功能研究奠定了基础。     

人细小病毒B19VP1基因片段原核表达载体的构建及其表达

目的　克隆人细小病毒B19　VP1基因片段,构建其重组克隆载体和表达载体,并诱导表达。方法　利用聚合酶链反应(PCR)和分子克隆技术,将B19病毒VP1基因片段扩增后,构建pGEM-T-easy克隆载体;经PCR筛选后,亚克隆于pGEX-4T-1表达载体中,并转化至BL21感受态菌;经诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷 (IPTG)诱导表达,并以免疫印迹法对表达蛋白进行鉴定。结果　扩增出一条约 801bp的基因片段,PCR鉴定结果的与预期结果一致。经IPTG诱导,VP1融合蛋白在大肠杆菌中得到成功表达,PAGE上出现相对分子量约为 54KD的一条新生蛋白带,经蛋白印迹验证为表达蛋白B19VP1。薄层扫描现示,表达产物占菌体总蛋白的 27. 4%。结论　获得人细小病毒B19VP1基因片段的原核表达载体及其产物,对进一步研究其纯化及B19疫苗有重要意义。     

恶性疟原虫丝氨酸重复抗原基因在大肠杆菌中的表达

采用 PCR方法特异性扩增恶性疟原虫云南株 (PFD- 3/ YN)丝氨酸重复抗原基因片段 ,经基因序列测定后克隆于 p GEX- 4T- 1融合蛋白表达载体 ,并转化大肠杆菌 TG1。SERA基因与 p GEX- 4T- 1重组后能在大肠杆菌 TG1中表达一 45 KDa的融合蛋白 ,当工程菌 OD5 90 为 0 .8～ 1.0时 ,加入终浓度 1m mol/ L IPTG进行诱导 ,表达量较高。采用 dot- EL ISA对表达产物进行鉴定。结果表明 SERA融合蛋白能被抗 SERA单克隆抗体所识别。     

结核分枝杆菌Rv2994基因原核表达及鉴定

目的构建结核分枝杆菌Rv2994基因原核表达载体并进行表达,为进一步研究奠定基础。方法PCR扩增Rv2994基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pGEX-1λT获得重组表达质粒pGEX-2994,转化大肠杆菌测序后诱导表达,纯化目的蛋白并免疫新西兰大白兔获取多价抗体。结果从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Rv2994基因,成功构建了融合表达质粒pGEX-Rv2994,转化大肠杆菌JM109后,经IPTG诱导,表达出约73kDa重组融合蛋白,用Western blotting证实其有良好的抗原性,纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价的抗体。结论成功构建了原核表达载体pGEX-2994,获得并纯化了GST-Rv2994融合蛋白,制备了高效价的多价血清,为Rv2994基因的功能研究奠定了基础。     

弓形虫微线体蛋白8胞质尾蛋白的表达及纯化

目的 制备弓形虫微线体蛋白8羧基端胞质尾(MIC8t)蛋白片段.方法 以弓形虫基因组为模板,PCR扩增MIC8t基因片段,构建MIC8t/pGEX-4T-1原核表达系统;IPTG诱导表达GST-MIC8t融合蛋白;亲和层析纯化融合蛋白.结果 构建了MIC8t原核表达系统,表达并纯化了GST-MIC8t融合蛋白.结论 在体外制备并纯化了GST-MIC8t融合蛋白,为后续研究MIC8t的功能奠定了基础.     

人KIAA0350蛋白多克隆抗体制备及其应用

目的:表达、纯化带GST标签的人KIAA0350并制备多克隆抗体。方法:构建pGEX-4T-1-KIAA0350原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导融合蛋白表达,经纯化后免疫日本大耳白兔得到多克隆抗体并用CNBr activatedSepharose TM4B进行纯化。用间接ELISA法检测抗体效价,同时用免疫组化检测细胞定位。结果:成功构建原核表达质粒,表达、纯化KIAA0350蛋白并免疫动物后得到多克隆抗体。间接ELISA法显示抗体效价达1∶4 000,应用该抗体检测肝组织中KIAA0350主要定位于细胞膜。结论:多克隆抗体的成功制备及其在肝组织中的表达定位,为进一步研究KIAA0350在糖尿病发病中的作用奠定了基础。     

Sequence analysis of functional Apisimin-2 cDNA from royal jelly of Chinese honeybee and its expression in Escherichia coli

Apisimin is one of the functional peptides from royal jelly. The aim of this study was to analyze and in vitro express a new gene encoding Acc-apisimin-2 from Chinese honeybee (Apis cerana cerana) in Escherichia coli. Ninety-six clones containing apisimin expressed sequence tag (EST) were identified from 8568 effective ESTs of the cDNA library of Chinese honeybee worker heads. The coding region of the matured peptide from one clone containing Acc-apisimin-2 gene was sub-cloned into the prokaryotic expression vector pGEX-4T-2. The recombinant vector then was transformed into E. coli BL21 (DE3) for expression. The expression product was analyzed with SDS-PAGE and Western blot. The total length of the Acc-apisimin-2 cDNA was 379 bp, containing an open-reading frame (ORF) of 237 nucleotides encoding a 78 amino acid residue precursor. The Acc-apisimin-2 gene shared 100% homologies with Am-apisimin from A. mellifera, but 93% and 91% homologies with Aciapisimin from A. cerana indica and the previously reported Acc-apisimin-1 sequence (AY278991) on a nucleotide level, respectively. The GST-Acc-apisimin-2 fusion protein expressed in the recombinant vector was about 31 kDa in size and accumulated up to about 22.1% of the total bacterial proteins. About 50% of the recombinant protein was soluble. The fusion protein purified through affinity chromatography was cross reactive with GST antibody, which confirmed the successful expression of GST-Acc-apisimin-2.