核酶对乙型肝炎病毒基因表达的抑制作用

目的 探讨核酶在细胞内抑制乙型肝炎病毒基因表达的作用。方法 计算机设计针对Ｃ基因的三个切点的核酶Ｒｚ１,Ｒｚ２,Ｒｚ３,合成核酶基因并将三个核酶基因两两组合克隆入ｐＧＥＭ７ｚｆ（一）质粒中,经体外转 录后切割靶ＲＮＡ;选择Ｒｚ２和Ｒｚ３串联的双位点核酶基因构建入逆转录病毒载体ｐＢＢＳ２１２中,重组质粒转染２．２．１５细胞,ＥＬＩＳＡ方法惭型肝炎病毒基因表达的抑制作用。结果 三种不同组合的核酶均可有     

脱氧核酶抑制乙型肝炎病毒基因表达的实验研究

目的：探讨乙型肝炎病毒(HBV)s基因和c基因特异性的脱氧核酶(DNAzyme)对HBV表面抗原(HB—sAg)和e抗原(HBeAg)表达的抑制效应。方法：设计合成针对HBVs基因ORF A^157UG、e基因ORF A^1816UG的DNAzyme DrzBS、DrzBC,在2.2．15细胞上观察其对HBVs基因、c基因的表达抑制效应。结果：DrzBS、DrzBC作用于2．2．15细胞后,可显著抑制HBVs基因、c基因的表达,有效浓度为0．1—2．5μmol／L并呈剂量依赖性,最高抑制率分别为94．2％和91．8％;有效抑制持续时间可达72h,DrzBS、DrzBC在细胞内对HbeAg、HbeAg表达的抑制效率,明显高于作为对照的反义寡核苷酸AsBS、AsBC,有效浓度较后者低至少l0倍。其对2．2．15细胞的HBVDNA复制无明显影响,亦未见明显的细胞毒性作用。结论：在2．2．15HBV细胞模型系统,DrzBS、DrzBC能高效阻断HBVs基因、e基因的表达,是一种特异性的、高效的抗HBV基因治疗剂。     

乙型肝炎病毒蛋白对核酶剪切作用的影响

惭型肝炎病毒蛋白对核酶剪切作用的影响。方法 利用计算机辅助设计针对乙型肝炎病毒Ｃ基因的三个单一核酶构建Ｒｚ１核酶自剪切转录载体（ｐＧＥＭＲｚ１）,观察单一核酶（Ｒｚ１）对靶ＲＮＡ的切割作用及乙型肝炎病毒观察单一核酶（Ｒｚ１）对靶ＲＮＡ的切割作用及乙型肝炎病毒蛋白对核酶剪切作用的影响。结果 核酶自剪切转录载体体２上转录后,在顺式核酶发生自剪切后可将目的核酶正确地释放出来,计算机设计的单一核酶体外可剪     

乙型肝炎病毒特异性核酶与丁型肝炎病毒重组体的构建

目的将重组丁型肝炎病毒基因组作为乙型肝炎病毒特异性核酶的载体,探讨解决核酶在实际应用中的保护性运载、靶向性和特异性问题。方法设计了乙型肝炎病毒特异性锤头型核酶结构,采用重组引物,结合“不对称ＰＣＲ”和“ＭｅｇａＰｒｉｍｅｒＰＣＲ”方法将所设计的锤头型核酶基因替代插入到了型肝炎病毒基因组５'端高变区,重组体经ＰＣＲ初步鉴定后,克隆到Ｔ载体（ｐＴＡｄｖ）Ｔ７启动子下游,经限制性内切酶酶切、序列测定分析。结果与结论证实该重组作为预期的乙型肝炎病毒特异性核酶－丁型肝炎病毒基因组重组体,为进一步的体外切割和细胞内与乙型肝炎病毒相互作用的研究提供了基础。     

抗乙型肝炎病毒特异联合型核酶的体外切割作用

目的：探讨单一及多位点核酶对乙型肝炎病毒靶ＲＮＡ的切割作用。方法：利用计算机辅助设计针对乙型肝炎病毒Ｃ基因的三个单一核酶及特异联合型核酶,构建三个核酶各自及三个核酶串联的自剪切转录载体（ｐＧＥＭＲｚ１２３）观察单一及串联核酶（Ｒｚ１２３）对靶ＲＮＡ的切割作用。结果：构建的串联核酶自剪切转录载体体外转录后,在顺式核酶发生自剪切后可将目的核酶正确地释放出来,计算机设计的单一核酶体外可剪切靶ＲＮＡ,串联     

核酶对2.2.15细胞中HBeAg表达抑制作用的初步观察

目的：观察针对Ｈ了Ｃ区双位点核酶对２．２．１５细胞中ＨＢｅＡｇ表达的抑制作用。方法：利用亚克隆技术,从质粒ｐＧＥＭ－Ｒｚ１２３切下ＥｃｏＲ１－ＢａｍＨ１片段克隆于真核表达质料ｐＢＢＳ２１２中,将该质料转染２．２．１５细胞,用ＥＬＩＳＡ及免疫组化方法观察该核酶对ＨＢｅＡｇ合成的抑制作用。结果：细胞表达出针对ＨＢＶ Ｃ区核酶,该核酶对ＨＢｅＡｇ的抑制制达４８．６％。结论：该双位点核酶可能通过针对ＨＢＶ     

抗丙型肝炎病毒核酶的细胞内免疫及其意义

目的 探讨抗丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核酶（Ｒｚ）预先转染的细胞内免疫效应。方法 人前构建的ＨＣＶ２锤头结构Ｒｚ（Ｒｚ２１３），通过脂质体介导的基因转染方法，转染人肝癌细胞（ＨＨＣＣ），经Ｇ４１８筛选转染Ｒｚ２１３的生，应用１ｕｃ报告基因的表达活性，观察该细胞克隆对靶基因（ｐＣＭＶＮＣＲ１ｕｃ）转染的抑制作用。结果 Ｇ４１８筛选能使ｚ２３１在转染细胞内有效表达Ｒｚ ＲＮＡ，转染Ｒｚ的多克隆细胞能有效地     

锤头结构核酶在人肝癌细胞内对丙型肝炎病毒基因表达的抑制作用

锤头结构核酶（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄｒｉｂｏｚｙｍｅ，ＨｈＲｚ）分子较小、结构简单、易于设计合成，已广泛用于抗病毒和抗肿瘤的研究。丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）非编码区（５′ＮＣＲ）和核心（Ｃ）区高度保守，具有重要的生物学功能，是基因治疗选择的理想靶序列。５′ＮＣＲ有核糖体结合位点，以非帽依赖方式合成病毒蛋白，对病毒的复制、病毒蛋白的翻译和启动起重要的调节作用。我们以Ａｌｔ等［１］构建的ｐＣＭＶＮＣＲｌｕｃ载体为靶基因，应用计算机选择设计理想的锤头结构Ｒｚ，并通过脂质体介导的基因共转染方法，研究抗ＨＣＶ５…     

乙型肝炎病毒基因分型研究进展

近年来,随着分子生物学技术的迅猛发展和对乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）的深入研究发现,HBV基因型与乙型肝炎的临床表现、治疗、预后都有密切关系。本文着重对HBV基因型的发现和流行病学分布,HBV基因型的分型方法,HBV基因型与血清亚型的关系,HBV基因型的临床意义等相关研究作一综述。     

抗HBV C区G11饱和突变的发夹状核酶的体外制备

研究针对HBV C区的G11位饱和突变的发夹状核酶的体外制备，通过计算机设计针对HBV C区的发夹状核酶，合成G11位饱和突变的发夹状核酶基因片段，并把其克隆入自剪切核酶载体p1.5的3‘-cis-Rz或5‘-cis-Rz之间。^32P标记4种发夹状核酶的体外转录物，变性聚丙烯酰胺纯化回收获得4种核酶。利用该载体外制备大量目的发夹状核酶是完全可行的。     

Anti-viral Activity of Hairpin Ribozyme Directed against HBV Core Region In Vitro

Hepatitis B is a major worldwide health prob-lem.Hepatitis B virus is a small hepatotropic DNAvirus,causing acute and chronic B- type hepatitis inman.Chronic infection is associated with a high riskof liver cirrhosis and primary liver carcinoma.Cur-rently available therapies are of limited efficacy.Ri-bozyme is a kind of catalytic RNA that can catalyzethe cleavage of sequence- specific RNA[1] .By properchemical or molecular manipulation,ribozyme can beengineered either to bind specifical…     

自体特异性免疫效应淋巴细胞抑制转HBV基因小鼠HBV复制的研究

目的:探讨经乙肝病毒（HBV）转基因小鼠树突状细胞（DCs）体外诱导的特异性免疫效应细胞（IECs）对自体HBV复制的影响。方法:从转HBV基因小鼠体内提取DCs,体外诱导为成熟DCs,与淋巴细胞共培养,诱导为特异性IECs,将其经阴茎背静脉注入小鼠体内。实验分为2组:生理盐水（NS）组、IEC组,观察6个时间点:0 h、2、4、6、8周和12周;通过生化检测肝功能,PCR检测血清中HBV DNA水平、ELISA检测细胞因子、免疫组化检测肝组织内的HBsAg 和HBcAg,评估IECs对小鼠体内HBV复制的影响。结果:IEC组小鼠于6、8周和12周时,肝功能明显改善,HBV DNA水平明显降低,HBsAg和HBcAg明显减少,且均优于NS组（P﹤0.05）。结论:特异性IECs可修复转HBV基因小鼠肝脏功能、抑制HBV复制,相关的细胞因子参与其作用。     

双靶区反义RNA抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的 研究双靶区反义RNA重组载体质粒的转染、表达及抗乙型肝炎病毒的作用。方法 构建表达乙型肝炎病毒X、P双靶区正、反义RNA的重组载体质粒与脂质体混合,经尾静脉注入小鼠体内,用荧光聚合酶链反应定量法检测血清乙型肝炎病毒DNA含量,用Nested—PCR法检测血清乙型肝炎病毒DNA转阴率。结果 与给药前相比,小鼠血清乙型肝炎病毒DNA的复制,在逆转录病毒载体-asX组和逆转录病毒载体-asP组分别于第2、第8周达到抑制高峰,抑制率均为58％;在逆转录病毒载体-asXP组于第1、第8周出现两次抑制高峰,抑制率分别为66％、77%;其余组未出现明显变化。给药后8周,小鼠血清乙型肝炎病毒DNA,在逆转录病毒载体-asX组、逆转录病毒载体-asP和逆转录病毒载体-asXP分别有2只、1只,1只转阴,转阴率分别为25.0％、12．5％、16．7％。结论 乙型肝炎病毒X、P双靶区反义RNA对乙型肝炎病毒转基因鼠乙型肝炎病毒DNA的抑制作用优于单靶区反义RNA,但其对血清乙型肝炎病毒DNA的转阴率与单靶区反义RNA无显著性差异。     

RNAi靶向抑制HBV复制和HBeAg表达

目的观察靶向HBVC基因区的RNA干扰对HBV复制的抑制作用。方法选择HBV基因组C区的Nt2021-2049作为靶序列,合成相应的正、反义寡核苷酸,退火后形成双链,克隆入shRNA表达质粒,将得到的质粒与HBV质粒共转染HepG2细胞,观察HepG2细胞中HBV的受抑制情况。结果病毒复制及HBeAg的表达明显受到抑制。结论所选靶区通过RNA干扰可有效抑制HBV复制。     

MXA蛋白抑制HBV复制的体外研究

目的 研究MXA蛋白抑制HBV复制的活性.方法 将pcDNA3.1-MXA重组质粒和PU19-1.24 HBV重组质粒分别按1:1、2:1共转染HepG2细胞(MXA组),对照组使用空pcDNA3.1、Salon DNA和PU19-1.24 HBV重组质粒共转染,3 d后Western blot检测MXA蛋白表达,Abbott法检测细胞上清HBeAg和HBsAg分泌量,定量PCR检测上清和胞内HBV DNA水平,统计学分析结果 .pcDNA3.1-MXA与PU19-1.24HBV重组质粒共转染HepG2细胞,对照组为pcDNA3.1-MXA重组质粒、PU19空质粒和Salon DNA共转染,3 d后裂解细胞Western blot检测MXA蛋白表达.结果 Western blot显示MXA组有MXA蛋白表达;与对照组相比,pcDNA3.1-MXA和PU19-1.24 HBV重组质粒按1:1转染时,MXA组HBeAg下降27%,上清HBV DNA和细胞内HBV DNA分别下降1个log值和0.6个log值;按2:1比例转染时MXA组HBeAg较对照组下降66%,上清HBV DNA和细胞内HBV DNA水平分别下降1.9个和1.7个log值,差异均具有统计学意义(P＜0.05).Western blot检测显示MXA蛋白抑制HBV组与对照组MXA蛋白表达没有明显差别.结论 MXA蛋白在HepG2细胞具有抑制HBV复制活性,抑制活性与蛋白的表达量相关;在抑制HBV复制过程中MXA蛋白自身可能不发生降解.     

HepG2.9706细胞内HDV核酶对HCV RNA抑制活性的初步研究

目的探讨HDV核酶在细胞内抑制HCV RNA的可能性.方法将重组载体转染至转基因细胞HepG2.9706中,通过荧光定量PCR检测细胞和培养上清中的HCV RNA,初步探讨HDV核酶对HCV RNA的抑制活性.结果①RzCl,RzC2,RzC3 3组HDV核酶定向插入到真核表达载体.②在转基因细胞HepG2.9706中,pCl-RzCl、pC1-RzC2、pCl-RzC3对HCV-5′NCR-C RNA抑制活性分别为69.2%,38.7%、4.2%.结论①成功构建了3个HDV核酶重组表达载体.②pC1-RzC1、RC1-RzC2在转基因细胞HepG2.9706具有抑制HCV-5′NCR-C RNA的活性.     

慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA与HBeAg、HBeAb含量的关系

目的 :检测乙型肝炎 (乙肝 )患者血清HBVDNA与HBeAg、HBeAb含量的变化 ,以探讨两者的相关性。方法 :对 2 0 7例乙肝患者采用微粒子免疫荧光法 (MEIA)检测血清HBV标志物 (HBV M ) ,定量PCR法检测血清HBVDNA。结果 :HBeAg阳性组的HBVDNA为 10 6 .53± 1 .0 7copies·ml- 1 ;e系统双阳组的e抗原均为低水平 ,HBVDNA含量为 10 4 .89± 1 .0 3copies·ml- 1 ,与前组比较有显著性差异 ;82例HBeAg阴性患者有 5 3 .7%HBVDNA为阳性 ,与前两组比较均有显著性差异。结论 :HBeAg含量与HBVDNA含量成正比 ;e系统双阳组e抗原与HBVDNA含量均明显降低 ,提示抗原抗体正处于转换期 ;有部分HBeAg阴性患者的HBVDNA呈低水平复制 ,具有一定传染性 ;少数HBeAg阴性和e系统双阳者HBVDNA呈高水平提示可能与病毒变异有关