点突变对ColE2质粒复制起始部位生物活性的影响

为了研究ＣｏｌＥ２质粒复制起始部位中的一些位点和其生物活性的关系，用人工合成寡核苷酸定点引入点突变的方法，对ＣｏｌＥ２质粒复制起始部位的１个位点引入３种点突变，并测定了突变的ＣｏｌＥ２质粒复制起始部位的Ｒｅｐ蛋白结合和复制活性。结果表明，该位点的突变导致ＣｏｌＥ２质粒复制起始部位的生物活性明显下降。说明该位点对ＣｏｌＥ２质粒复制起始部位和Ｒｅｐ蛋白的结合及复制起始都起一定作用。     

点突变对ColE2质粒复制起始部位生物活性的影响

为了研究ＣｏｌＥ２质粒复制起始部位中的一些位点和其生物活性的关系，用人工合成寡核苷酸定点引入点突变的方法，对ＣｏｌＥ２质粒复制起始部位的１个位点引入３种突变，并测定了突变的ＣｌｏＥ２质粒重制起始部位的ＲｅＰ蛋白结合和复制活性。     

克隆乙型肝炎病毒DNA在肝与肾细胞中复制与表达的研究

对比研究在外细胞培养系统中乙型肝炎病毒在肝,紧名的复制与表达。方法髟克隆ＨＢＶＤＮＡ分别转染ＨｅｐＧ２与２９３细胞系;ｐ１７７ｔｎ与ｐ３．８Ⅱ还转染了原代人胚肾细胞。培养后收集转染细胞培养上清液,用ＥＬＩＳＡ法检测ＨＢｓＡｇ与ＨＢｅＡｇ;提取转染细胞的ＤＮＡ与ＲＮＡ,进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ与Ｎｏｒｈｅｒｎ印迹杂交检测细胞内ＨＢＶＤＮＡ与ＨＢＶＲＮＡ。结果转染ＨｅｐＧ２细胞,ＨＢｓＡｇ与ＨＢｅＡｇ均有     

TCR Vβ8+IL-2/pcDNA3.1亚克隆重组质粒的构建

目的：构建TCRVβ8＋IL－2／pcDNA3．1亚克隆重组质粒。方法：先将TCRVβ8克隆入克隆载体pUC19，分别酶切IL－2pUC19和TCRVβ／pUC19，将IL－2连接到TCRVβ8／pUC19重组质粒上，然后将TCRVβ8＋IL－2基因从TCRVβ8＋IL－2／pUC19重组质上酶切下，克隆入pcDNA3．1表达载体上。结果和结论：经测序正实成功地构建了TCRVβ8＋IL－2/pcDNA3．1亚克隆重组质粒。     

一种简便有效的枯草杆菌质粒克隆方法

目的　在用枯草杆菌质粒克隆并表达白喉毒素突变型DT del14 8时 ,出现A70 0T突变 ,导致Ile2 0 9Leu氨基酸取代 ,为纠正这一突变 ,设计一种简便有效的枯草杆菌质粒克隆方法。方法　首先对含I2 0 9L突变的载体PSM6 0 4 DT del14 8 I2 0 9LDNA进行计算机限制内切酶谱分析 ,以位于PflMⅠ及HindⅢ间的唯一切点的限制内切酶KpnⅠ消化 ,然后去磷酸化 ,热灭活相应酶 ,加入不含I2 0 9L突变的大肠杆菌质粒PET15b DT del14 8,再以PflMI、HindⅢ消化 ,浓缩后进行连接、转化、筛选克隆 ,最后DNA序列分析。结果　经限制内切酶消化及序列分析 ,所有转化子均含目的基因片段。载体DNA仅需 30 0ng ,转化效率达 4 5× 10 2 转化子 / μg ;结论　方法简便、有效、快捷 ,成本低、成功率高 ,值得推广和借鉴     

淋球菌质粒DNA的克隆

淋球菌质粒ＤＮＡ的克隆游力，赵跃然，李天玲，王芸，李震，袭著英，孙广莲（山东省医学科学院基础医学研究所）关键词淋病奈瑟菌；质粒；脱氧核糖核酸；克隆；分子淋球菌培养难度大且易发生变异，故传统的诊断方法对淋病确诊有一定困难。以淋球菌特异质粒（４．２ｋｂ）...     

Zeste同源蛋白2增强子通过调节巨噬细胞趋化影响牙髓炎症反应

目的:探讨表观遗传调控子zeste同源蛋白2增强子(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)在牙髓炎过程中的表达变化及其对巨噬细胞的趋化作用。方法:以10 g/L脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激大鼠牙髓,建立大鼠牙髓炎模型。采用免疫组织化学染色检测牙髓炎进展过程中EZH2的表达变化,采用免疫荧光双染法检测EZH2与CD68的表达及两者的共定位,利用CCK-8细胞增殖-毒性试剂盒检测不同浓度(1、10、20、40、100 μg/L)EZH2重组蛋白对人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)及人白血病单核细胞系(human leukaemia-derived monocytic cell line,THP-1)细胞增殖的影响,从而筛选出EZH2重组蛋白刺激hDPCs及THP-1细胞的适宜浓度。采用Transwell迁移实验检测EZH2重组蛋白处理的hDPCs上清液对THP-1细胞迁移作用的影响。结果:HE染色结果表明,在LPS诱导的大鼠牙髓炎模型中,随着LPS刺激时间延长,牙髓炎症反应逐步加重。免疫组织化学结果显示,在LPS诱导牙髓炎8 h内,EZH2表达下降,但在刺激 1、3、7 d后,EZH2表达随刺激时间延长逐步上调。与对照组相比,LPS刺激大鼠牙髓3 d时EZH2与CD68表达显著升高,并且可以检测到两者在巨噬细胞中的共表达。CCK-8结果提示,EZH2重组蛋白刺激hDPCs及THP-1细胞的适宜浓度为20 μg/L。与对照组上清液相比,加入EZH2重组蛋白刺激hDPCs后的上清液可以显著促进巨噬细胞趋化。结论:EZH2参与了牙髓炎发展过程,并促进巨噬细胞的趋化,提示EZH2在牙髓炎发展过程中有重要调控作用。     

前列腺特异性膜抗原启动子增强子调控UPRT基因真核质粒的构建及表达

目的 构建前列腺特异性膜抗原启动子增强子靶向性调控的UPRT基因真核表达重组质粒(pPSMAenhaocer／promoter-UPRT)。方法 采用PCR技术从大肠杆菌JMpPSMAenhaocer／promoter-UPRT109基因组中扩增UPRT基因，通过分子克隆技术将其克隆到包括前列腺特异性膜抗原启动子增强子靶向性调控的pEGFP-1的质粒。利用重组质粒pPSMAenhaocer／promoter-UPRT)转染LNcap细胞，MTT法检测5-氯尿嘧啶(5-FU)对转染LNcap细胞存活率的影响。结果 质粒pPSMAenhaocer／promoter-EGFP双酶切去除EGFP，连接上UPRT基因，成功构建pPSMAenhaocer／promoter-UPRT,并转染LNcap细胞。使LNcap细胞对5-FU的杀伤敏感性大大提高。结论 pPSMAenhaocer／promoter-UPRT的构建和表达，为进一步研究UPRT基因对5-FU的靶向性杀伤前列腺癌细胞增强作用和对前列腺癌自杀基因系统(CD／5一FC系统)的放大效应奠定了基础。     

一种简捷的质粒DNA提取及纯化方法

介绍一种快速获取高纯度质粒ＤＮＡ方法,在碱裂解法快速获取质粒ＤＮＡ粗制品的基础上,利用一种不溶解蛋白质而溶解ＤＮＡ的溶液ＴＥＳ纯化质粒ＤＮＡ,同时对本法所提取的质粒的ＤＮＡ的回收率、纯度及可能的用途进行验证。此法简易,所得样品纯度高,可以直接用于转化、酶切和基因克隆。     

A型流感病毒株核蛋白基因的克隆与重组质粒的构建

目的克隆A型流感病毒株Swine/Henan/703/2001(H3N2)的核蛋白(NP)基因序列并构建重组质粒。方法采用逆转录聚合酶链式反应技术从病毒株基因组中扩增出编码核蛋白的基因序列,克隆至pGEM-TEasy载体,经蓝白筛选、菌落PCR及酶切鉴定挑取阳性克隆并测序。结果利用RT-PCR扩增到目的基因片段,并将其克隆至T载体。结论成功构建重组质粒pGEM-TEasy-NP,为NP相关功能及流感疫苗的进一步研究奠定实验基础。     

单纯疱疹病毒2型感染细胞蛋白27重组真核表达质粒的构建及表达

目的构建单纯疱疹病毒2型(HSV-2)感染细胞蛋白27(ICP27)基因与pcDNA3.1(+)真核表达质粒的重组质粒pcDNA3.1(+)/ICP27。方法通过RT-PCR方法从HSV-2培养物中提取RNA制备ICP27的编码基因UL54DNA,将其与载体pcDNA3.1(+)连接。通过双酶切和测序鉴定重组质粒是否构建成功,Western blot法鉴定重组质粒在真核细胞COS-7中表达。结果重组质粒pcDNA3.1(+)/ICP27构建成功,可在COS-7中表达。结论成功构建了可在真核细胞内表达的pcDNA3.1(+)/ICP27重组质粒,为下一步研究该重组质粒作为DNA疫苗的免疫学效应奠定了基础。     

乙型肝炎病毒(adw_2)亚型全基因组的分子克隆

应用基因克隆技术,使高纯度的HBV DNA(adw_2)的EcoRI酶切片段分别与经同种限制性内切酶切割的PBR322和pUC18质粒DNA片段重组,转化到相应的E.coli受体菌中,经筛选和鉴定,得到了含有完整HB V(adw_2)基因组的分子克隆。     

丙型肝炎病毒C,E2,NS3区基因嵌合重组载体的构建

【目的】构建包含丙型肝炎病毒（HCV）C区、E2区及NS3区的嵌合重组载体。【方法】设计合成3对寡核苷酸引物,用PCR法从HCV重组质粒pHCVc、pBE2和pGMXNS3-5中特异扩增出编码HCVC区、E2区和NS3区抗原的部分基因片段（501、603和900bp）,分别用HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后,逐个定向连接到质粒pcDNA3中,转化宿主菌XL1-Blue,分别用上述内切酶酶切及DNA测序鉴定重组质粒。【结果】酶切鉴定示所切下的片段大小均与预计相符,测序结果与文献报道序列及预计结果一致,证实符合表达框架。【结论】成功构建了HCV嵌合重组质粒pcDNA3-C-E2-NS3。