广东地区汉族人MBL基因GGC54GAC点突变的初步筛查

目的对广东地区汉族人群的甘露聚糖结合凝集素结构基因第一外显子第54位密码点突变(GGC54GAC)进行初步筛查.方法提取外周血白细胞DNA进行相应片段的PCR扩增,再对产物进行单链构象多态性分析.结果在166人中查出野生型纯合子147例,占88.55%,GGC54GAC突变杂合子19例,占11.45%,未发现GGC54GAC突变纯合子.结论广东地区汉族人群MBL基因GGC54GAC突变频率为0.057.     

广东地区汉族人MBL基因点突变的研究

目的：研究我国汉族人群甘露聚糖结合凝集素（MBL）结构基因外显子1第52、54、57位密码点突变（CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA）。方法：收集广东地区汉族普通人群的血标本，提取白细胞基因组DNA，以PCR扩增目的基冈片段，应用荧光探针杂交可视技术检测其MBL基因的点突变。结果：从202份样本中，检出GGC54GAC点突变纯合子6例和杂合子44例（等位基因频率为0．139），GGA57GAA点突变杂合子1例（频率为0．002），未发现CGT52TGT点突变（频率为0）。结论：广东地区汉族人群MBL基因点突变的频率较高，为防治MBL缺损病提供了一定的实验依据。     

甘露聚糖结合凝集素基因多态性与血清蛋白表达水平的关系

目的了解汉族儿童甘露聚糖结合凝集素(MBL)第一外显子54密码子的基因多态性以及与血清MBL蛋白水平的关系。方法用ELISA方法检测71例儿童血清MBL水平,用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性分析(PCR-RFLP)方法对第一外显子54密码子基因多态性进行分析,比较不同基因型的血清蛋白质表达水平,并测定部分PCR产物的核苷酸序列。结果汉族人群MBL基因第1外显子54密码子3种基因型为GGC/GGC(77.5%)、GGC/GAC(18.3%)、GAC/GAC(4.2%),等位基因GGC(0.87)出现频率较GAC(0.13)高;低MBL水平基因型为GGC/GGC(12.5%)、GGC/GAC(75.0%)、GAC/GAC(12.5%),GGC/GAC基因型及等位基因GAC(0.50)频率较正常MBL组(0.03)高(P<0.005);GGC/GGC基因型的血清MBL的水平比GGC/GAC基因型明显增高[(3.67±2.10)μg/ml,(0.10±0.05)μg/ml,P<0.001],GGC/GGC基因型汉族人群血清水平较巴布亚新几内亚人[Papua NewGuinea,(2.45±0.82)μg/ml]明显增高(P<0.001);发现MBL第一外显子15、21、58、61密码子的突变。结论第一外显子第54密码子表现不同基因多态性分布,并对应不同的血清MBL水平。主要是GGC/GAC导致低血清MBL水平,但可能存在除52、54、57密码子外的第一外显子其他部位的基因多态性导致血清MBL蛋白质表达的种族差异。     

中国汉族、维吾尔族人群甘露聚糖结合凝素基因多态性的检测

分别收集广东省汉族和新疆维吾尔族自治区维吾尔族一般人群血标本,提取白细胞基因组DNA,以多聚酶链反应扩增目的基因片段,应用荧光探针杂交可视技术检测其甘露聚糖结合凝集素(MBL)基因54位密码点突变(GGC54GAC)。从138份汉族样本中检出GGC54GAC突变型纯合子4例,占2.9%,杂合子30例,占21.74%;120份维吾尔族标本中,检出突变型纯合子3例,占2.5%,杂合子34例,占28.33%。因此,汉族和维吾尔族人群MBL基因GGC54GAC突变的频率分别为0.138和0.167,两民族间无明显差异。     

MBL突变体在CHO细胞中表达及其产物分析

采用PCR技术,从质粒pMBLm54中获得含GGC54GAC点突变的甘露聚糖结合凝集素(MBL)基因,将其插入真核表达载体构建重组表达载体pcDNA4/HisMax C-MBLm54,DNA测序验证序列正确后将其电转染入CHO细胞。以Zeocin筛选并维持培养转染后CHO细胞,获得2株稳定高效表达目的蛋白的单克隆细胞株。采用Ni~(2+)-NTA agarose层析柱纯化表达产物,获得54Asp突变MBL蛋白,SDS-PAGE和Western blot分析表明,54Asp突变MBL蛋白主要为相对分子质量为60000的成分,而重组野生型MBL蛋白则主要是相对分子质量为200000和>200000的分子。配体结合试验发现,天然MBL和重组野生型MBL能与甘露聚糖结合,而54Asp则否。结果表明,54Asp突变MBL蛋白不能形成正常的MBL结构单位和寡聚体,并进而影响其配体结合活性。     

CGT52TGT和GGA57GAA甘露聚糖结合凝集素突变体的构建

目的 构建CGT52TGT和GGA57GAA2种甘露聚糖结合凝集素(MBL)基因突变体。方法 设计2对引物52F／52R和57F／57R(R中引入了点突变)，以含汉族人野生型MBL cDNA的重组质粒pGEM-mbl为模板，采用TaKaRa MutanBEST突变试剂盒进行定点突变，以PER和测序分析进行鉴定。结果 分别用52F／52R和57F／57R为引物对进行PCR，均得到1个约3800bp的DNA片段，自身连接后获得重组质粒。以SP6／T7P为引物对进行PCR，获得约900bp的扩增产物。序列分析表明，2种克隆分别除其第52、57位密码变为TGT、GAA外，其余与野生型MBL cDNA完全相同。结论 构建成功CGT52TGT和GGA57GAA MBL基因突变体，为深入探索MBL基因突变引起调理吞噬缺损的机理和MBL分子的结构-功能关系提供了分子模型。     

甘露聚糖结合凝集素基因点突变与类风湿关节炎的关系

收集类风湿关节炎(RA)患者和正常对照人群血标本,提取白细胞基因组DNA,以PCR扩增目的基因片段并应用荧光探针杂交可视技术检测MBL基因CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA点突变,分析MBL基因点突变与RA及其严重程度的关系。72例RA患者中,检出54位密码点突变杂合子29例和纯合子3例、57位密码点突变杂合子1例,其54、57位密码突变的基因频率分别为0.243和0.007;95例正常对照样本中,检出54位密码点突变杂合子22例和纯合子2例、57位密码点突变杂合子1例,其54、57位密码点突变的基因频率分别为0.137和0.005;两者比较,其54位密码点突变有显著差异(x~2=6.78,P0.05)。有关节侵蚀破坏的43例RA患者中,检出54位密码点突变杂合子21例和纯合子3例,其基因频率为0.314;29例无关节侵蚀破坏的RA患者中,仅有8例54位密码点突变杂合子,基因频率为0.138;两者比较存在显著差异(x~2=6.45,P0.05)。因此认为,MBL基因点突变是RA的易感因素并与疾病的严重程度有关。     

精神分裂症患者MBL基因ExonI 54位密码子点突变频率与血清水平的研究

目的探讨精神分裂症患者血清MBL水平与基因突变的相关性,了解MBL在患者免疫病理机制中的作用。方法应用ELISA法检测血清MBL水平;利用PCR产物直接测序的方法检测MBL基因外显子Ⅰ第54位密码子(MBL-54)的点突变频率。结果精神分裂症患者血清MBL水平(1367.218±1277.429ng/mL)明显低于对照组(1987.781±976.748ng/mL)(t=2.888,P=0.047)。MBL-54基因型GGC/GGC突变频率(55.77%)低于对照组(69.23%)(χ^2=2.010,P=0.224);GGC/GAC型突变频率(42.31%)高于对照组的(28.85%)(χ^2=2.298,P=0.315);GGC/GAC型的患者血清MBL水平(1034.52±529.72ng/mL)明显低于对照组(2195.81±1275.38ng/mL)(t=3.336,P=0.0039)。结论精神分裂症患者血清低水平的MBL可能与MBL-54基因型GGC/GGC突变率减低,GGC/GAC突变率升高的综合作用相关,MBL可能是患者体内CIC滞留或清除障碍的分子机制之一。     

突变型人PRKAG2基因的克隆及其表达载体构建

目的构建含有定点突变的人PRKAG2基因表达载体。方法首先应用Trizol法抽提健康人全血mRNA,通过实时聚合酶链反应(RT-PCR)克隆得到野生型人PRKAG2 cDNA;继而通过聚合酶链反应(PCR)定点突变的方法获得突变型人PRKAG2基因,命名为G100S,最后应用酶切连接的方法得到重组载体pEGFP-G100S。结果Trizol法提取人细胞mRNA,经RT-PCR合成cDNA第一条链,特异性引物PCR扩增得到PRKAG2基因片段,目的片段条带在1 761 bp左右。分段克隆得到的G100S片段分别为300 bp与1 500 bp左右。转化Top10感受态细菌,PCR筛选阳性菌落5个克隆有3个克隆可见1 800 bp左右的阳性片段,筛选得到pEGFP-G100S重组阳性克隆。测序证实重组载体pEGFP-G100S构建成功。结论构建的含定点突变人PRKAG2基因重组载体pEGFP-G100S为进一步研究基因PRKAG2 G100S突变的功能奠定了基础。     

突变型和野生型MBL基因在COS7细胞中的瞬时表达

采用PCR技术,从质粒pMBLm52、pMBLm54和pMBLm57中分别获取含CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA点突变的人甘露聚糖结合凝集素(MBL)突变体全长编码区cDNA序列,将其分别插入质粒pcDNA4/HisMax C中,构建成相应的3种真核表达载体。将各突变型MBL基因的真核表达载体和野生型MBL基因真核表达载体以脂质体法分别转染COS7细胞。72 h后,以双抗体夹心ELISA技术检测各细胞培养上清中目的蛋白的含量分别为0.980μg/ml、0.971μg/ml、0.900μg/ml和1.047μg/ml;用One-way ANOVA分析这些目的蛋白的含量无显著性差异(P>0.05)。因此,MBL结构基因的点突变并不影响MBL蛋白的合成与分泌。     

Mannose-binding lectin gene polymorphisms are not associated with susceptibility to severe early childhood caries

Our purpose was to investigate a possible relationship between severe early childhood caries (S-ECC) and polymorphism of the mannose binding lectin gene and investigate the role of allele variant as a possible factor in the susceptibility to S-ECC. Sixty-two Chinese children with S-ECC and 68 caries-free control children were included in this study. Genomic DNA was extracted from buccal epithelial cells of each individual. The identification of MBL B allele was performed by restriction fragment length polymorphism using Ban I restriction enzyme. The frequency of MBL mutant genotype (GGC/GAC and GAC/GAC) was more frequent among children with S-ECC compared with control groups, but did not significantly differ between two groups (x² = 2.82, p > 0.05). There was no significant difference in the allele frequency of codon54 wild type (allele A) between two groups (x² = 2.76, p > 0.05). The present study did not find evidence of MBL codon54 polymorphisms being associated with S-ECC in the population studied, but a larger sample size is necessary to confirm the present results.     

人CGT52TGT MBL突变体在CHO细胞中的表达及其产物分析

目的: 初步探索MBL基因CGT52TGT点突变引起调理吞噬缺损的机制。方法: 采用PCR技术, 从质粒pMBLm52中获取含CGT52TGT点突变的MBL基因, 将其插入真核表达载体pcDNA4 /HisMaxC中构建重组表达载体。经测序验证后, 电转染入CHO细胞。以800mg/LZeocin筛选转染后的CHO细胞30d; 随后的30d中, 维持Zeocin的浓度在200mg/L, 以获取稳定转染的细胞。以RT PCR分析其mRNA的表达情况。表达产物经Ni NTAagarose纯化后, 以非还原SDS PAGE和Westernblot对表达产物进行初步鉴定。结果:以PCR扩增的MBLm52基因片段长约750bp, 将其插入表达载体构建重组真核表达载体pcDNA4 /HisMaxC MBLm52, 测序验证序列正确后将其电转染入CHO细胞。从细胞培养上清中获得的纯化的表达产物, 主要为相对分子质量(Mr)约60 000的分子, 寡聚化程度明显低于重组人野生型MBL和从人血浆中分离的MBL。结论: MBL基因CGT52TGT点突变可能并不影响其表达产物向胞外分泌的过程, 但突变后产生的Cys可能形成新的二硫键, 影响MBL结构单位和/或寡聚分子的形成, 推测该突变MBL蛋白不能发挥正常的功能。     

人MBL-CLR表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素（MBL）胶原样区（CLR）蛋白。方法：应用PCR技术,从含中国人野生型MBLcDNA的质粒pGEM-MBL中扩增CLR基因片段,将其克隆至pET32a原核表达载体后,转化E.coliBL21（DE3）感受态菌株诱导表达CLR蛋白。通过Ni^2＋-NTA琼脂糖柱层析纯化目的蛋白,以SDS-PAGE、Western blot和ELISA法进行鉴定。结果：从重组质粒pGEM-MBL中扩增到长约180bp的DNA片段。构建的重组表达载体经BamHⅠ和HindⅢ酶切后出现约5900bp和180bp的片段,测序结果同预期的结果完全一致。重组质料在大肠杆菌中诱导表达后,纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳出现Mr约为30000、60000和120000的3条带。Western blot分析表明,3条蛋白带均可与抗His抗体起反应,3条蛋白带对应于融合蛋白的单体和寡聚体。ELISA检测证实,纯化的蛋白能与鼠抗重组人MBL蛋白抗体结合。结论：获得可表达人MBL-CLR的大肠杆菌菌株和重组的人MBL-CLR-Trx融合蛋白,为MBL分子结构、功能关系的进一步研究提供了条件。     

pcDNA3.1+-MBL 真核表达载体构建及其在不同哺乳动物细胞株中的表达

目的　比较人甘露聚糖结合凝集素 (MBL)基因在不同哺乳细胞株中的表达效率。方法　应用PCR从含有中国人野生型MBLcDNA的质粒pGEM MBL中扩增目的基因片段 ,将其克隆至pcDNA3.1 表达载体 ,经酶切及测序鉴定后 ,以电穿孔法转染CHO、HEPG2和HEK2 93细胞 ,以RT PCR、ELISA分析其在 3株细胞中的表达情况。结果　从pGEM MBL中扩增得到约 75 0bp的MBLDNA片段 ,构建成重组表达载体pcDNA3.1 MBL ,经酶切出现 75 0bp片段 ,测序鉴定与预期的完全一致。将其转染进细胞后 ,经G4 18选择转染子并克隆化培养 ,RT PCR和ELISA分析显示 ,在CHO和HEK2 93细胞中及培养上清液中分别有较高的MBLmRNA和蛋白表达 ,而HEPG2细胞表达较低。结论　人MBL在CHO和HEK2 93细胞中的表达效率较高 ,为今后在哺乳动物细胞中高效表达人MBL积累了经验     

人α-防御素-1(α-HNP-1)基因真核表达载体的构建及在大鼠骨髓间充质干细胞中的转染表达

目的构建人α-防御素-1(α-HNP-1)基因的真核表达载体,并且转染大鼠骨髓间充质干细胞。方法提取人外周血粒细胞中的总RNA,反转录为cDNA作为模板,采用PCR的方法扩增得到人α-防御素-1(α-HNP-1)的基因片断。将扩增产物连接入pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,蓝白筛选,对PCR及酶切鉴定含有目的片断的克隆进行测序。经测序证实无误后,将获得的pGEM-T-HNP-1重组质粒上的α-HNP-1基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)上,构建HNP-1的真核表达载体pcDNA3.1-HNP-1。将真核表达载体pcDNA3.1-HNP-1用脂质体法转染原代大鼠骨髓间充质干细胞,用免疫组化法检测α-HNP-1的表达。结果获得预期大小为303bp的RT-PCR产物;经PCR、酶切鉴定和DNA测序分析证实重组质粒载体pcDNA3.1-HNP-1构建正确;免疫组化法显示转染细胞呈阳性反应。结论成功构建HNP-1基因的真核表达载体,并且在大鼠骨髓间充质干细胞中能成功表达。     

人MASP1 N端片段原核表达载体的构建及其表达

目的:在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL)相关丝氨酸蛋白酶1(MASP1)N端片段.方法:采用PCR技术从含人MASP1 cDNA的质粒pGEM-MASP1中扩增MASP1-N端基因片段,将其插入原核表达载体pGEX4T-1,转化BL21(DE3)感受态菌诱导表达MASP1-N端蛋白,通过GSTrap亲合层析柱纯化目的蛋白,以SDS-PAGE和Westernblot进行鉴定,并以ELISA分析了目的蛋白与重组MBL-CLR、重组MBL的结合活性.结果:从pGEM-MASP1中扩增得到约860 bp的基因片段,构建成重组载体经酶切出现约4 900 bp和860 bp片段,测序结果与预期的完全一致.纯化蛋白经SDS-PAGE可见Mr60000蛋白带,该蛋白可与抗GST抗体反应并能与重组人MBL-CLR、重组人MBL蛋白结合.结论:获得了表达人MASP1 N端片段的大肠杆菌菌株和重组人MASP1 N端片段/GST融合蛋白,为MASP1分子的进一步研究提供了条件.