葛根素对极低频电磁场下人胚胎眼巩膜成纤维细胞增殖活性及Ⅰ型胶原蛋白表达的影响

目的 研究葛根素对极低频电磁场(ELF-EMFs)作用下人胚胎眼巩膜成纤维细胞(HFSFs)增殖活性及Ⅰ型胶原蛋白(COL1A1)表达的影响.方法 实验研究.体外培养HFSFs,根据是否暴露于0.2 mT电磁场分为暴露组和非暴露组,暴露组又分为不同终浓度葛根素组(0.0、0.1、1.0、10.0 μmol/L).MTT比色法检测不同暴露时间(0、12、24、48 h)暴露组和非暴露组HFSFs增殖活性,及各浓度葛根素组HFSFs暴露于0.2 mT电磁场24 h时增殖活性;用Real-time PCR和Western-Blot检测非暴露组和暴露于0.2 mT电磁场24 h时各浓度葛根素组HFSFsmRNA转录水平和COL1A1蛋白表达.2组间比较采用独立样本t检验,各组整体比较采用单因素方差分析,组间多重比较采用LSD-t检验.结果 暴露组各时间点HFSFs增殖活性差异有统计学意义(F=4.560,P＜0.05),暴露于0.2 mT磁场24 h开始即出现HFSFs增殖受抑(t=5.000,P＜0.01);与非暴露组相比,暴露组细胞内COL1A1蛋白表达下调(t=7.956,P＜0.01),同时mRNA转录也下调(t=17.364,P＜0.01),而1.0 μmol/L葛根素开始使HFSFs增殖活性增强(P,＜0.01),0.1 μmol/L葛根素即使暴露组HFSFs内COL1A1蛋白(P,＜0.05)和mRNA表达上调(P＜0.05),且浓度越高变化越明显.结论 葛根素可逆向改变ELF-EMFs引起的HFSFs增殖活性下降、细胞内COL1A1 mRNA和蛋白表达下调,可能对巩膜基质重塑具有预防作用.     

极低频电磁场作用下人胚胎眼巩膜成纤维细胞的分子病理改变

背景 极低频电磁辐射产生的热效应与人类癌症的关系及其对眼表的影响已有较多研究.但眼球暴露于极低频电磁场(ELF-EMFs)下是否会导致巩膜的病理改变,从而影响近视的发生、发展目前鲜见报道. 目的 研究ELF-EMFs作用下人胚胎眼巩膜成纤维细胞(HFSFs)的分子病理改变及其在近视发生发展中的可能机制.方法 对HFSFs进行体外培养和传代,根据细胞是否暴露于50 Hz电磁场分为暴露组和对照组,应用实时定量聚合酶链反应( real-time PCR)法检测不同磁场强度(0、0.1、0.2、0.5、1.0 mT)、不同暴露时间(0、6、12、24、36、48 h)下HFSFs中Ⅰ型胶原蛋白(COL1A1)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)的基因表达水平变化,同时应用CCK-8法检测两组HFSFs的细胞增生情况,并以细胞免疫荧光法对HFSFs中COL1A1和MMP-2蛋白的表达进行确认.结果 与对照组相比,暴露组在磁场强度0.2 mT下作用6h可见HFSFs中COL1A1 mRNA的表达下调,差异有统计学意义(对照组:0.099±0.008,暴露组:0.050±0.004;P=0.009),且表达量随着磁场强度的增加而减少;在磁场强度0.1 mT下暴露24 h,HFSFs细胞中的MMP-2 mRNA表达上调,差异有统计学意义(对照组:0.009±0.001,暴露组:0.018±0.003:P=0.038),并随着暴露时间的延长表达增强.磁场强度0.2 mT下暴露24 h,HFSFs细胞增牛的吸光度(A450)值明显下降,差异有统计学意义(P=0.009);免疫荧光分析也显示暴露组HFSFs细胞中COL1A1表达下调,MMP-2表达上调.结论 ELF-EMFs暴露可在一定范围内影响体外培养的HFSFs的增生及COL1 A1的合成,可能是诱导巩膜发生病理性重塑进而导致近视发生、发展的危险因素之一.     

MMPs激动剂和抑制剂对人巩膜成纤维细胞MMP-1／2以及I型胶原表达的作用研究

目的研究基质金属蛋白酶（MMPs）家族MMP-1、MMP-2激动剂和抑制剂对人巩膜I型胶原表达的作用,探讨MMP-1和MMP-2在人巩膜胶原代谢中的作用。方法应用人巩膜成纤维细胞系作为研究模型,用荧光定量检测MMPs激动剂醋酸氨基苯汞（APMA）及抑制剂对人巩膜成纤维细胞MMP-1和MMP-2活性的影响;实时荧光定量反转录聚合酶链反应以及免疫印迹蛋白定量法检测比较激动剂组与抑制剂组对MMP-1／2以及I型胶原mRNA和蛋白表达的变化;最后用siRNA干扰敲除MMP-1、MMP．2或MMP-1／2后,检测巩膜成纤维细胞I型胶原蛋白水平的变化。结果MMPs激动剂引起MMP．1／2活性显著增加,I型胶原mRNA和蛋白表达下降,MMPs抑制剂引起MMP．1／2活性显著下降,相应的I型胶原mRNA和蛋白表达增加（均P〈0．01）。激动剂可引起MMP．1mRNA表达增加（P〈0．01）,对MMP-2mRNA表达无明显影响（P〉0．05）,而抑制剂能引起MMP．2mRNA表达下降（P〈0．01）,但对MMP．1mRNA表达无显著影响（P〉0．05）。应用siRNA干扰方法敲除MMP-1、MMP-2或两者同时被敲除后,MMP-1蛋白表达均显著降低（均P〈0．01）,MMP-2除在MMP-1siRNA干扰敲除组无明显变化外（P〉0．05）,其余各组均显著下降（均P〈0．01）;I型胶原的表达在各敲除组中显著增加,当MMP-1和MMP．2均干扰敲除时,I型胶原的表达增加最为显著（均P〈0．01）。结论在人巩膜成纤维细胞系中,MMP-1／2激动剂和抑制剂均能引起MMP-1／2活性改变及相应的MMP-1／2蛋白表达变化,并最终导致I型胶原表达的变化;MMP．1和MMP-2是调控人巩膜I型胶原重塑的关键因子。     

正常中国人非高度近视眼前极和后极部巩膜内层组织中I型胶原蛋白的表达水平

目的通过对比分析正常中国人眼前极和后极部内层巩膜组织细胞外基质中I型胶原蛋白的分布特点，探讨其分布的差异对人巩膜组织抗拉伸力的影响，为寻求病理性近视的发病机制提供客观依据。方法应用非穿透小梁切除术获取15例自愿捐献角膜的健康正常人眼的前、后极部巩膜组织（不伴有病理性近视），用Western blot的方法检测各组巩膜组织的I型胶原蛋白，并测定各样本β-actin和I型胶原蛋白电泳条带灰度值，以β-actin电泳条带为参照，求出各样本I型胶原蛋白电泳条带灰度值和β-actin电泳条带灰度值比值。结果在100kD处可见I型胶原的蛋白条带，正常人眼后极部I型胶原蛋白的表达水平明显低于前极部，差异有显著统计学意义（P〈0．01）：结论正常人眼前极部和后极部I型胶原纤维蛋白的分布存在差异，后极部明显低于前极部。     

bFGF对实验性近视眼巩膜成纤维细胞增殖的影响

目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)对豚鼠镜片诱导型近视眼(1ens-in duced myopia,LIM)后极部巩膜成纤维细胞增殖程度的影响,从而探讨bFGF在近视眼的发病机制中的作用.方法 2周龄豚鼠10只随机选取一眼用镜片诱导方法制备动物近视模型(实验眼,LIM),对侧为自身对照(对照眼,SC).造模45 d,实验前后均检测每只豚鼠双眼屈光状态、眼轴长度.用组织块培养法培养豚鼠后极部巩膜成纤维细胞,并传2代.用免疫组织化学法对培养的细胞进行鉴定.将每只眼培养的细胞分为空白组(A组)、1 ng·mL-1bFGF组(B组)、10 ng·mL-1bFGF组(C组)、100 ng·mL-1bFGF组(D组),利用MTT法检测各组细胞增殖的程度.结果 镜片诱导前豚鼠双眼屈光度无明显差异,经过45 d镜片诱导,实验眼形成明显近视,实验眼与对照眼比较,诱导出(-6.70±1.93)D的相对近视,眼轴相对延长了(1.53±0.31)mm,实验前后变化差异有统计学意义(P＜0.05).所培养细胞经免疫细胞化学鉴定为成纤维细胞.实验组中B组与A组之间细胞增殖差异无统计学意义,C组、D组和A组之间差异有统计学意义,C组、D组细胞数量分别增长24.9%、14.2%;对照组中B组与A组之间细胞增殖差异无统计学意义,C组、D组和A组之间差异有统计学意义,C组、D组细胞数量分别增长27.4%、12.5%.结论 凹透镜诱导可引起豚鼠明显轴性近视.bFGF可以有效促进豚鼠巩膜成纤维细胞的增长,其中10 ng·mL-1的促增长作用最强,但对实验眼和对照眼来说,其促增长作用无明显差异.     

极低频电磁场辐射干扰后小鼠成纤维细胞转录组测序的生物信息学分析

目的:通过高通量测序技术分析极低频电磁场(ELF-EMFs)辐射干扰小鼠成纤维细胞后转录组的变化情况,并筛选出可能参与ELF-EMFs调控成纤维细胞生长的相关通路及基因。方法:将小鼠NIH/3T3细胞分为电磁辐射组和正常对照组,电磁辐射组细胞置于0.2 mT、50 Hz的电磁辐射系统中,正常对照组置于同等条件未通电的相...     

极低频电磁辐射下HFSF中MMP-2的表达及作用

目的研究极低频电磁场（ELF-EMF）作用下人胚胎眼巩膜成纤维细胞（HFSF）中基质金属蛋白酶-2（MMP-2）活性与蛋白表达的变化以及ELF-EMF对I型胶原（Collagen I）合成的影响。方法实验研究。根据是否暴露于50 Hz、0.2 mT电磁场或加入MMP-2特异性抑制剂（sc-204092）,将实验细胞分为对照组、辐照组和抑制剂组。明胶酶谱法检测各组HFSF中MMP-2酶活性的变化;Western Blot法检测各组HFSF中MMP-2、Collagen I蛋白水平的变化。采用单因素方差分析进行数据分析。结果3组HFSF细胞中MMP-2酶活性、MMP-2、Collagen I蛋白表达比较差异均具有统计学意义（F=14.96、139.88、63.46,P均<0.01）;辐照组较对照组MMP-2酶活性和蛋白表达升高（P<0.05）,Collagen I蛋白表达下降（P<0.01）;抑制剂组较辐照组MMP-2酶活性和蛋白表达下降（P<0.01）,Collagen I蛋白表达升高（P<0.05）。结论ELF-EMF可能通过影响体外培养的HFSF中MMP-2的酶活性和蛋白表达来调节Collagen I的合成。     

胶原相关整合素对人巩膜成纤维细胞增殖和胶原合成的影响

目的 观察胶原相关整合素对人巩膜成纤维细胞增殖和胶原合成的影响.方法 首先进行人巩膜成纤维细胞原代培养与鉴定,RT-PCR检测胶原相关整合素α1、α2、β1亚单位mRNA表达,Western blot法检测胶原相关整合素α1、α2、β1亚单位蛋白表达,CCK-8检测胶原相关整合素α1β1和α2β1对人巩膜成纤维细胞增殖的影响,实时荧光定量PCR检测胶原相关整合素α1β1和α2β1对人巩膜成纤维细胞Ⅰ型胶原mRNA表达水平的影响.结果 成功进行了人巩膜成纤维细胞的原代培养.人巩膜成纤维细胞存在胶原相关整合素α1、α2、β1亚单位mRNA及蛋白水平的表达.胶原相关整合素α1β1 1 mg·L-1和4 mg·L-1抗体组细胞存活率分别为(86.3±4.5)％和(74.3±6.8)％,与对照组的100％相比,细胞存活率均显著下降,差异均有统计学意义(均为P＜0.05),且呈浓度依赖性的抑制作用.胶原相关整合素α2β1抗体在1mg ·L-1时有抑制作用,细胞存活率为(89.3±12.1)％,但与对照组的100％相比差异无统计学意义(P＞0.05),4mg· L-1抗体组细胞存活率下降为(74.5±6.6)％,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).胶原相关整合素α1β1(4 mg·L-1)抗体组Ⅰ型胶原mRNA表达明显减低,是对照组的0.48倍(P＜0.05).胶原相关整合素α2β1抗体1 mg·L-1组和4 mg· L-1组Ⅰ型胶原mRNA表达分别是对照组的0.94倍和0.87倍,与对照组相比差异均无统计学意义(均为P ＞0.05).结论 人巩膜成纤维细胞存在胶原相关整合素α1、α2、β1亚单位的表达.胶原相关整合素α1β1和α2β1影响人巩膜成纤维细胞的增殖.胶原相关整合素α1β1参与人巩膜成纤维细胞胶原的合成.     

人巩膜成纤维细胞体外三维胶原基质培养系统的构建及其生物力学特性

背景 眼轴的过度伸长和巩膜组织的扩张是高度近视发病机制研究的热点之一,建立合理的人巩膜成纤维细胞(HSFs)培养体系模型有助于进一步探讨HSFs在高度近视形成过程中与胶原基质相互作用的生物学机制. 目的 构建HSFs与Ⅰ型胶原的三维培养系统,微观模拟在体巩膜,建立巩膜重塑模型.方法 采集新鲜供体巩膜组织,采用组织块培养法分离和培养HSFs,采用免疫荧光技术检测细胞中波形蛋白和角蛋白的表达以鉴定细胞;获取8周龄SPF级雄性SD大鼠鼠尾腱制备鼠尾胶原,400μl胶原加入50μ1NaOH(0.1 mol/L)溶液中混匀,加入80μl 10倍培养液,混匀,溶液pH值约为7.加入1 100μl终浓度1×106/ml细胞悬液混合形成凝胶培养系统,于倒置相差显微镜下观察HSFs的增生情况和细胞形态,采用IPP-5软件对三维培养的含细胞胶原收缩面积进行测量以分析三维胶原系统的物理特性;采用生物力学试验机对三维胶原系统的生物力学特性进行测定.结果 培养的HSFs波形蛋白呈阳性表达,角蛋白表达阴性.未接种培养细胞的无成纤维细胞SD鼠鼠尾胶原凝胶透明,实验期间性状无明显变化,而含HSFs的三维胶原凝胶随着细胞培养时间的延长细胞数量增加,倒置相差显微镜下可观察到数十层成纤维细胞相互交错呈网状排列,培养后7 ～14d凝胶块呈乳白色,凝胶面积保持在正常的10％左右,三维培养系统中的HSFs接种后24 h细胞产生多向性突起,呈双极形或纺锤形.HSFs胶原凝胶复合物的弹性材料蠕变曲线呈非线性(0 ～ 100 s)部分与线性(100 ～600 s)部分,前者是胶原凝胶在短暂应力的作用下本身的弹性变化,后者是胶原凝胶在定力的作用下随拉伸时间的延长而出现的蠕变变化. 结论 鼠胶原凝胶对培养的HSFs有良好的生物相容性,HSFs胶原凝胶可形成三维复合物,可呈现机械性生物学特性,是研究成纤维细胞与细胞外基质之间以及细胞之间相互作用的良好模型,可用于巩膜重塑的模拟研究.     

缺氧对巩膜成纤维细胞内质网应激反应的激活作用及其对巩膜重塑的影响

目的　探讨缺氧对巩膜成纤维细胞（HFSF）内质网应激反应的激活作用及其对巩膜重塑的影响。方法　取HFSF随机分为缺氧0 h组、缺氧12 h组、缺氧48 h组。缺氧0 h组细胞正常培养,缺氧12 h组及48 h组细胞分别在含氧体积分数2%的三气培养箱中缺氧处理12 h及48 h。采用Western blot 检测肌醇需求酶l (IRE1α)、P-IRE1α、COL1A1、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、BAX及BCL-2蛋白表达情况,免疫荧光染色检测HFSF中α-SMA蛋白含量,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,CCK-8检测细胞增殖情况。结果　Western blot检测结果显示:与缺氧0 h组相比,缺氧12 h组IRE1α、α-SMA蛋白表达均升高,COL1A1蛋白表达降低,差异均有统计学意义（均为P<0.05）,其余蛋白表达变化不明显,差异均无统计学意义（均为P>0.05）;与缺氧0 h组相比,缺氧48 h组IRE1α、P-IRE1α、MMP-2、α-SMA、BAX蛋白表达均升高,COL1A1、BCL-2蛋白表达均降低,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;与缺氧12 h组相比,缺氧48 h组COL1A1、BCL-2蛋白表达降低,BAX蛋白表达升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）,其余蛋白表达变化不明显,差异均无统计学意义（均为P>0.05）。免疫荧光染色结果显示:缺氧12 h组及缺氧48 h组α-SMA蛋白荧光强度均较缺氧0 h组增高,且缺氧48 h组较缺氧12 h组α-SMA蛋白荧光强度升高更明显。流式细胞仪检测结果显示:缺氧0 h组、缺氧12 h组、缺氧48 h组细胞凋亡率分别为（0.617±0.032）%、（2.187±0.212）%、（4.130±0.395）%;缺氧12 h组及缺氧48 h组细胞凋亡率均高于缺氧0 h组,差异均有统计学意义（均为P<0.05）,且缺氧48 h组细胞凋亡率高于缺氧12 h组,差异有统计学意义（P<0.05）。CCK-8检测结果显示:缺氧12 h组及缺氧48 h组D₄₅₀均低于缺氧0 h组,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;缺氧48 h组与缺氧12 h组相比,差异无统计学意义（P>0.05）。结论　缺氧激活HFSF内质网应激反应,并且可能通过调节胶原代谢、促进细胞转分化及凋亡来参与巩膜重塑。