阿司匹林对缺氧诱导人HTR-8/SVneo滋养细胞凋亡及sFlt-1、HIF-1α表达的影响

目的：探讨阿司匹林对缺氧诱导人HTR-8/SVneo滋养细胞凋亡及可溶性类fms酪氨酸激酶-1(sFLT-1)、低氧诱导因子1α(HIF-1α)表达的影响。方法：人HTR-8/SVneo滋养细胞分为正常对照组、缺氧模型组(2%O₂、5%CO₂、93%N₂)、阿司匹林低(0.05mmol/L)、中(0.1mmol/L)、高剂量组(0.2mmol/L);培养结束后，MTT法测定细胞活力，流式细胞仪测定细胞凋亡水平及细胞周期，血清培养基基质胶培养测定细胞血管形成能力，RT-PCR法及蛋白印记法测定细胞sFlt-1、HIF-1α水平。结果：缺氧模型组OD值、存活率、血管形成能力、HIF-1α mRNA和蛋白表达均低于正常对照组及阿司匹林各剂量组，但随着阿司匹林剂量增上述各指标逐渐降低；缺氧模型组凋亡率、G1期、sFlt-1 mRNA和蛋白表达均高于正常对照组和阿司匹林各剂量组，但随着阿司匹林剂量增加凋亡率、G1期、sFlt-1 mRNA和蛋白表达逐渐升高(均P<0.05)。结论：低剂量阿司匹林可促进缺氧环境下HTR-8/S...     

叶酸对缺氧大鼠神经干细胞Notch信号通路相关基因mRNA表达的影响

目的研究叶酸对缺氧大鼠神经干细胞(NSCs)增殖及Notch信号通路相关基因mRNA表达的影响。方法无血清培养基原代培养新生大鼠NSCs,细胞分为对照组(Control),缺氧组(Hypoxia),叶酸组(Folate)和叶酸缺乏组(Folate-D)。除Control组外,其余3组缺氧6h。增殖第7日收集细胞,MTT法检测细胞活力,实时荧光定量PCR检测Notch1、Hes1/5、Mash1和Ngn1/2基因mRNA表达。结果 Folate组细胞活力高于Hypoxia组,Folate-D组细胞活力低于其他3组(P<0.05);Folate组Notch1、Hes1/5mRNA表达高于Hypoxia组,Folate-D组该3个基因mRNA表达低于其他3组(P<0.05);Folate组Ngn1/2mRNA表达低于Hypoxia组(P<0.05);Mash1mRNA表达在各组间差别无统计学意义(P>0.05)。结论叶酸能促进缺氧损伤NSCs增殖,上调Notch信号通路中Notch1和Hes1/5基因表达。     

牡蛎提取物在高温诱导皮层神经干细胞凋亡中的保护作用

目的探讨牡蛎提取液在高温所致神经干细胞凋亡中的保护作用。方法取孕13d小鼠胚胎大脑皮层细胞培养,采用免疫荧光法检测巢蛋白(nestin)的表达以鉴定神经干细胞,将培养3代的神经干细胞随机分为4组:正常对照组(对照组Ⅰ)和牡蛎保护组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(分别加入2.5、5、10mg/ml的牡蛎提取液),同时设立培养液对照组(对照组Ⅱ,其中无细胞)、培养液+牡蛎提取液对照组(对照组Ⅲ,其中无细胞),各牡蛎保护组及对照组均经过高温处理。用MTT法检测神经干细胞的增殖活性,用蛋白质印迹方法检测神经干细胞凋亡相关蛋白p53的表达。结果(1)原代和传代培养的神经球中,均有细胞表达nestin抗原。(2)牡蛎保护组Ⅱ(0.9410±0.0442)和牡蛎保护组Ⅲ(0.9914±0.0562)中细胞的MTT值明显高于对照组Ⅰ(0.8773±0.0416)。(3)与对照组Ⅰ相比,牡蛎保护组Ⅱ和牡蛎保护组Ⅲ中p53的表达明显下降。结论牡蛎提取液对高温所致神经干细胞的凋亡具有一定的保护作用。     

血红素加氧酶1对人脊髓星形胶质细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的探讨血红素加氧酶1(heme oxygenase, HO-1)过表达对人脊髓星形胶质细胞(human astrocytes of spinal cord, HA-sp)缺氧/复氧损伤的保护作用。 方法通过给予HA-sp氯化钴(250 μl/L CoCl₂)刺激模拟缺氧,然后再去除CoCl₂刺激,建立细胞缺氧/复氧损伤模型。采用免疫印迹(western blot, WB)方法,从蛋白水平上检测不同刺激条件下HA-sp中HO-1的表达。采用四甲基偶氮唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT)方法,分析单纯给予缺氧/复氧刺激后以及上调HO-1表达的同时给予缺氧/复氧刺激后HA-sp的存活率变化。 结果缺氧/复氧刺激条件下,HA-sp中HO-1蛋白过表达。利用锌原卟啉(ZnPPIX)抑制缺氧/复氧刺激条件下HO-1过表达后,HA-sp在缺氧/复氧刺激条件下存活率明显降低(P<0.01);与单纯给予缺氧/复氧刺激后HA-sp的存活率相比,用钴原卟啉(CoPP)上调HA-sp中HO-1表达的同时给予缺氧/复氧刺激,细胞存活率明显升高(P<0.01)。 结论利用CoPP上调HA-sp中HO-1的表达,具有抗细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。     

依达拉奉对海马神经元缺血缺氧损伤后线粒体膜电位的影响

目的探讨缺血缺氧损伤后依达拉奉对海马神经元线粒体膜电位的影响。方法原代培养海马神经元细胞，建立缺血缺氧损伤模型，分为正常细胞组、缺血缺氧组、依达拉奉干预组（分别给予1、10、100、300umol／L依达拉奉干预）和阳性参照药维生素C干预组，将各组海马神经元细胞用线粒体膜电位敏感性染料Rhodamine-123进行染色后，激光共聚焦显微镜分别检测线粒体膜电位。结果与缺血缺氧损伤组比，加入100umol／L和300umol／L依达拉奉可以显著提高损伤海马神经元的线粒体膜电位，达到正常神经元线粒体膜电位的82％和87％。100umol／L和300umol／L依达拉奉组之间对线粒体膜电位的的稳定作用没有统计学差异（P〉0．05）。结论缺血缺氧损伤后海马神经元线粒体膜电位下降，依达拉奉能够促进线粒体膜电位的恢复，起到神经保护作用。     

牛磺酸对缺氧所致神经胶质细胞凋亡的抑制作用

目的探讨牛磺酸对缺氧引起的神经胶质细胞凋亡的抑制作用方法原代培养神经胶质细胞并制作细胞缺氧模型,实验分为空白对照组、缺氧模型组、缺氧+牛磺酸组。细胞缺氧6 h后加入牛磺酸3 mmol/L继续培养24 h和48 h。采用Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR检测凋亡相关基因表达水平。结果缺氧组48 h早期凋亡率为(2.48±0.92)%,中晚期凋亡率为(2.97±0.75)%,均显著高于对照组的(1.02±0.44)%(P<0.05);牛磺酸48 h组早期凋亡率为(1.39±1.03)%,中晚期凋亡率为(1.62±0.1)%,均显著低于缺氧组(P<0.05)。缺氧组Bax mRNA相对表达量均显著高于对照组和牛磺酸组(P<0.01);牛磺酸48 h组Bcl-2 mRNA相对表达量比缺氧组升高2倍(P<0.01);牛磺酸组HIF-1αmRNA表达量均比缺氧组升高显著(P<0.01)。结论牛磺酸有助于抑制缺氧所致的神经胶质细胞早期和中晚期凋亡率。     

刺梨多糖对神经干细胞谷氨酸损伤的保护作用

目的:研究刺梨多糖(RoseroxburghiiTrattpolysaccharide,RRTP)对神经干细胞谷氨酸损伤的保护作用。方法:采用离子交换柱层析和凝胶柱层析纯化得到RRTP;取出大鼠胚胎的纹状体进行神经干细胞培养,神经干细胞谷氨酸损伤模型模拟神经元的缺血缺氧性损伤。实验分正常对照组,谷氨酸损伤组和RRTP不同浓度试验组。观察谷氨酸损伤后各组神经干细胞死亡率和乳酸脱氢酶漏出率。结果:不同浓度RRTP的试验组神经干细胞损伤有不同程度的减轻。高浓度RRTP试验组神经干细胞死亡率和乳酸脱氢酶漏出率较低,与谷氨酸损伤组比较有显著性差异(P<0.01)。结论:RRTP对神经干细胞损伤有明显的保护作用。     

利用稳定表达神经营养因子的神经干细胞治疗脊髓损伤的实验研究

目的 利用转基因技术将大鼠NT-3基因转入神经干细胞,获得稳定表达NT-3的细胞株,注入脊髓损伤大鼠模型的损伤部位进行治疗,观察外源细胞对脊髓的修复情况.本研究为脊髓损伤的干细胞治疗提供新的实验依据,为采用转基因技术提高脊髓损伤治疗效果奠定理论基础.方法 ①取孕14天大鼠胚胎皮层细胞,磁珠分选Nestin阳性(神经干细胞特异性标记)细胞群进行体外细胞培养至形成细胞克隆.将大鼠NT-3高表达载体转入神经干细胞,G418筛选出稳定表达NT-3的细胞继续培养.Western Blot检测证实得到的细胞可以稳定表达NT-3.②40只成年雌性Wistar大鼠麻醉后撞击锤损伤脊髓成脊髓损伤后九天,实验组大鼠每只注入5 μL细胞(稳定表达NT-3)悬液(10000 个/μL),对照1组动物每只注入5μL细胞培养基,对照2组动物每只注入5μL未经转染处理的细胞悬液(10 000个/μL),皮肤缝合后放回动物房常规饲养.③移植后一周起,采用斜板试验和BBB (Basso-Beattie-Bresnahan)评分观察大鼠后肢运动功能恢复情况.结果 ①神经干细胞可以稳定高表达(NT-3);②高表达NT-3的神经干细胞移植后可以改善实验性脊髓损伤大鼠模型各项检测指标,对脊髓损伤具有潜在的治疗价值.结论 NT-3转染神经干细胞后对于实验动物的脊髓损伤治疗效果显著提高,是提高临床脊髓损伤疗效的潜在可行途径.     

无机砷暴露对人脐带间充质干细胞的增殖及分化的影响

目的 探究无机砷(iAs)暴露对人脐带间充质干细胞的增殖及分化的影响,为iAs的发育毒性研究提供实验依据。方法 以具有多向分化潜能的人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)为细胞模型,用不同浓度的亚砷酸盐(NaAsO₂)染毒hUCMSCs 24 h,检测细胞活力;用5μmol/L的NaAsO₂染毒hUCMSCs 24 h,做细胞生长情况检测、多能性标志蛋白CD45、CD105及多能性标志基因Oct4、Nanog的检测,彗星实验检测DNA损伤情况、细胞分化实验检测;染毒后hUCMSCs的向成脂、成骨和成软骨分化及其特异性基因PPARγ、ALP、COMP表达量的检测。采用独立样本t检验进行两组间均数差异的比较,采用单因素方差分析进行多组间均数的比较。结果 随着NaAsO₂浓度的升高,hUCMSCs存活率逐渐降低(F=13.650,P<0.001);5μmol/L的NaAsO₂染毒hUCMSCs,对其细胞增殖的没有显著影响(t=0.507,P=0.615);多能性标志蛋白CD45、CD105仍有表达,多...     

脑源性神经营养因子对皮质酮诱导新生大鼠海马神经元凋亡的保护作用

目的 探讨脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)对皮质酮诱导新生大鼠海马神经元凋亡的保护作用。 方法 原代培养新生大鼠海马神经元,并分成对照组、皮质酮组、皮质酮+BDNF组,皮质酮造模浓度为100 μM,分别采用浓度为0.1、1、10、25、50、100 ng/ml的BDNF干预,造模及干预时间均为24 h。CCK8法测定细胞活力,分析BDNF的最佳作用浓度,流式细胞术和 Hoechst荧光染色检测细胞的凋亡情况,免疫印迹(Western-blotting)法检测细胞Caspase-3、Caspase-9的表达水平。 结果 与对照组比较,皮质酮组神经元凋亡率由(10.7±1.2)%上升为(33.9±3.5)%(t=18.707,P<0.01),胞体透亮,部分细胞核碎裂,凋亡特征明显,Caspase-3、Caspase-9表达显著上调(t₁=27.098,P₁＜0.01;t₂=24.311,P₂＜0.01);BDNF作用后,细胞活力显著上升,在浓度为1 ng/ml时与皮质酮组比较差异有统计学意义(t=3.562,P＜0.05),分析得出BDNF最佳浓度为48 ng/ml;BDNF(48 ng/ml)干预完成后,细胞凋亡率较皮质酮组下降至(18.7±2.1)%,差异有统计学意义(t=11.478,P＜0.01),细胞形态基本恢复正常,Caspase-3、Caspase-9表达明显下调(t₁=17.341,P₁=0.002;t₂=14.993,P₂=0.005)。 结论 BDNF能有效拮抗皮质酮诱导的海马神经元凋亡,保护神经元细胞。     

原代黄素化卵泡颗粒细胞氧化应激模型的建立与评价

目的 建立过氧化氢(H₂O₂)诱导的原代黄素化卵泡颗粒细胞氧化应激模型。方法 收集2019年10月至12月于保定市妇幼保健院生殖医学科行体外受精患者取卵后废弃的卵泡液,经密度梯度离心收集卵泡颗粒细胞,进行培养。不同浓度H₂O₂处理颗粒细胞12 h,采用最大半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)建立颗粒细胞氧化应激损伤模型。以未加H₂O₂的颗粒细胞为对照组,通过测定模型组丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)水平、雌二醇(estradiol, E₂)分泌量和细胞周期,评价模型组是否建模成功。结果 使用IC50浓度H₂O₂=65μmol/L,建立颗粒细胞氧化损伤模型。与对照组比较,模型组的MDA含量升高、SOD水平下降、E₂分...     

新生鼠体外神经干细胞培养、分化及鉴定

目的 探索新生SD大鼠神经干细胞体外分离培养基鉴定的方法。方法 分离新生SD大鼠海马组织, 无血清培养技术培养神经干细胞, 免疫组织化学技术检测其巢蛋白的表达;并用溴脱氧尿嘧啶核苷掺入试验, 免疫荧光双标技术观测神经干细胞的增殖状况;诱导神经干细胞分化, 分别用神经元特异性烯醇化酶抗体和胶质纤维酸性蛋白抗体进行免疫组织化学技术鉴定分化细胞。结果 获得大量悬浮生长的单克隆神经球, 并可以分化为神经元和星形胶质细胞。结论 成功培养的新生SD大鼠神经干细胞具有增殖、自我更新和多分化潜能, 为体外基础和临床研究奠定基础。     

三七总皂甙对缺氧缺血性脑损伤新生鼠内源性神经干细胞增殖分化的影响

目的:观察三七总皂甙对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生鼠内源性神经干细胞增殖分化的影响,探讨其促进神经发生的作用。方法 :将72只7日龄新生SD乳鼠随机分为假手术组、HIBD组及HIBD的三七总皂甙治疗组,用改良的Rice-Vannucci法制作HIBD模型。注射三七总皂甙干预治疗,用5一溴脱氧尿苷(BrdU)标记处于增殖状态的神经干细胞,免疫单标及双标免疫荧光技术观察三七总皂甙对HIBD海马区BrdU免疫活性及BrdU/NSE(Neuron specific enolase,NSE)、BrdU/GFAP(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)双标免疫活性的影响,并计数分析。结果:HIBD的海马区存在BrdU阳性细胞分布;应用三七总皂甙的HIBD海马区BrdU阳性细胞数及双标阳性细胞明显增多(P<0.01)。结论:三七总皂甙能诱导HIBD新生鼠内源性神经干细胞增殖、分化,提示其具有促进神经发生的能力。     

人脐血间充质干细胞移植联合mNGF治疗脑瘫大鼠的实验研究

目的研究经侧脑室内注入人脐血间充质干细胞(hUCB-MSCs)联合鼠神经生长因子(mNGF)对脑瘫大鼠治疗效果。方法采集足月新生儿脐带血100ml,分离、培养、纯化人脐血间充质干细胞并进行检测和鉴定。将七日龄SD大鼠100只随机分为正常组10只、实验组(缺血缺氧性脑瘫模型)90只,实验组随机分为5组:脑瘫模型组(CP组)、磷酸盐缓冲溶液(PBS)移植组、mNGF移植组、hUCB-MSCs移植组及hUCB-MSCs联合mNGF移植组。造模成功后1周,将hUCB-MSCs、mNGF分别注入左侧侧脑室,假移植组注射PBS液,移植后第1周、2周、3周,观察5溴-2脱氧尿核苷(BrdU)标记的脐血MSCs的存活、迁移,移植后第4周,对每组大鼠的神经行为学能力进行评估并检测大鼠脑组织胶质纤维酸性蛋白抗体(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达及观察脑组织的形态学变化。结果 1)人脐血MSCs主要分布在左侧侧脑室、额叶、顶叶皮质及白质,随时间进展,向四周脑组织转移,Brdu、NSE、GFAP阳性细胞逐渐减少,差异有统计学意义(P0.05);2)行为学评价:与模型组及假移植组比较,单移植组、联合移植组的足印潜伏期、迷宫逃避潜伏期缩短,足印重复间距及后足滑脱次数减小,联合移植组优于单移植组,差异有统计学意义(P0.05);3)HE染色:MSCs和mNGF单移植组大鼠细胞形态及脑组织结构破坏较脑瘫组有所改善;联合移植组恢复情况更好,细胞形态恢复较单移植组好。结论外源性脐血MSCs联合mNGF经侧脑室移植,可改善脑瘫大鼠的远期行为及脑损害。     

5-氮杂胞苷对大鼠骨髓间充质干细胞增殖与分化的影响

目的:探讨5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-aza)对体外骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)细胞增殖与分化潜能的影响。方法:从Wistar大鼠骨髓中获得MSCs,培养传代,透射电镜下观察诱导前后细胞形态变化;MTT法检测5-aza对MSCs生长的影响;免疫细胞化学方法检测Actin(α-Sarcomeric)、Desmin、Myoglobin、NSE、GFAP的表达。结果:5-aza对MSCs有抑制作用,在透射电镜下观察可见有心肌样细胞和神经元样细胞的形态变化。免疫细胞化学检测结果表明,MSCs经5-aza诱导14dactin、desmin、myoglobin、NSE和GFAP的表达均较对照组显著增高,P0.01。结论:5-aza对MSCs细胞生长有抑制作用,MSCs被5-aza诱导分化成心肌样细胞和神经元样细胞。     

氯化锂对缺氧后神经干细胞PI3K/Akt信号通道活性的影响

目的 探讨氯化锂对缺氧后神经干细胞(NSCs)磷脂酰肌醇-3-羟激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通道活性的影响。方法 分离培养新生SD乳鼠(SD)NSCs,建立缺氧NSCs模型。正常对照组NSCs加无血清培养基,单纯缺氧组仅缺氧,生理盐水干预组缺氧后加生理盐水,三组氯化锂干预组分别加入氯化锂至所需的浓度。免疫组织化学技术检测各组Akt /P-Akt阳性细胞表达。结果 缺氧NSCs形态不规则,胞体肿胀,甚至出现细胞膜破裂,数量减少,折光性减弱;缺氧NSCs死亡数较未缺氧NSCs明显增多、活性明显降低(P均<0.05)。1 mM氯化锂干预组P-Akt表达较单纯缺氧组、生理盐水干预组及5 mM氯化锂干预组强,较3 mM氯化锂干预组弱。3 mM 氯化锂干预组P-Akt表达较1 mM 、5 mM氯化锂干预组强。3 mM氯化锂干预组P-Akt阳性细胞数较单纯缺氧组、生理盐水干预组、1 mM、5 mM氯化锂干预组明显增多(P<0.05)。结论 氯化锂激活缺氧后NSCs PI3K/Akt信号通路。     

mtDNA4977bp缺失分析评价肿瘤细胞辐射敏感性的研究

目的 探讨mtDNA4977bp缺失用于肿瘤细胞辐射敏感性检测的可行性。方法 选取三种不同肿瘤细胞株:肝癌细胞(HepG₂)、食管癌细胞(EC-9706)和乳腺癌细胞(MCF-7)。采用MTT法检测肿瘤细胞经γ射线照射后的存活分数(SF);巢式PCR法检测肿瘤细胞的mtDNA4977bp缺失率。结果 MTT法:2Gy、4Gy和8Gy照射后,HepG₂和EC-9706的SF显著低于MCF-7,表明HepG₂和EC-9706细胞具有更高的辐射敏感性。PCR法:1Gy和4Gy照射后3种肿瘤细胞mtDNA4977bp缺失率差异无统计学意义,8Gy照射后HepG₂和EC-9706mtDNA4977bp缺失进一步增加,而MCF-7的缺失率下降,显著低于HepG₂与EC-9706细胞的缺失率,提示HepG₂和EC-9706细胞的辐射敏感性高于MCF-7细胞。结论 mtDNA4977bp缺失作为新的生物学指标,有希望更加客观准确地评价肿瘤细胞的辐射敏感性。     

mtDNA4977bp缺失预测肿瘤细胞辐射敏感性的体外研究

目的 探讨mtDNA4977bp缺失检测分析法用于预测肿瘤细胞辐射敏感性的可能性。方法 采用巢式PCR法检测人肝癌细胞(HepG₂)和人前列腺癌细胞(PC-3)经不同剂量X射线照射后的mtDNA4977bp缺失率。结果 经照射后检测到辐射可诱发mtDNA4977bp缺失,HepG₂细胞和PC-3细胞的mtDNA4977bp缺失率具有剂量依赖性,HepG₂细胞在各剂量点的缺失率显著高于PC-3细胞(P(0.05),提示HepG₂细胞的辐射敏感性高于PC-3细胞。结论 简便快捷的检测mtDNA4977bp缺失有可能成为预测肿瘤细胞辐射敏感性的方法。     

大鼠胚胎脑新皮质神经干细胞的体外分离培养方法研究

目的建立大鼠胚胎脑新皮质神经干细胞的体外分离培养方法。方法从孕14天SD大鼠胚胎脑分离新皮质,通过机械吹打改善细胞分散状态、优化无血清培养基条件,从而改进神经干细胞的培养方法。利用神经干细胞标志蛋白(nestin和SOX2)、增殖和克隆成球能力以及多向分化能力测试三方面对神经干细胞进行鉴定。结果以该法培养的神经干细胞nestin蛋白呈强阳性表达,SOX2阳性表达率达99%以上,BrdU掺入阳性,培养3天后细胞量为接种量的10.55倍,6日克隆成球率为(33.00±4.40)%。经相应特异性标志蛋白检测证实神经干细胞经诱导分化后可形成神经元(MAP2)、星形胶质细胞(GFAP)和少突胶质细胞(O4)。结论获得的神经干细胞纯度和细胞产出率高,具有强自我更新和多向分化能力。