人miR-1908慢病毒载体构建及在人脂肪前体细胞中的表达验证

目的 构建人miR-1908慢病毒表达载体,包被病毒并检测其在人脂肪前体细胞中过表达效果。方法 以人脂肪细胞基因组DNA为模板,PCR高保真扩增包含miR-1908区域上下游各100bp左右的基因组DNA,亚克隆入慢病毒表达载体,与包装质粒共转染HEK-293T细胞,包装病毒,收取病毒上清,纯化后感染人脂肪前体细胞,36 h开始观察荧光标记,72 h收取细胞,抽提RNA,Realtime PCR检测慢病毒感染下miR-1908的相应表达量。结果 成功构建人miR-1908慢病毒表达载体,包装获得的病毒感染人脂肪前体细胞的效率可达到70%以上,miR-1908过表达水平可接近2倍。结论 本研究成功构建了人miR-1908慢病毒过表达载体,包被的慢病毒可以在人脂肪前体细胞中实现过表达效果,为后续功能研究奠定了基础。     

miR-33b表达载体构建及表达活性检测

目的:构建miR-33b真核表达载体及其表达活性检测。方法:人工合成miR-33b成熟cDNA序列,以GV251为载体,构建miR-33b真核表达载体,并对重组克隆进行测序确保载体构建成功;采用脂质体转染法将miR-33b表达载体导入人胃癌细胞MKN-28中,通过倒置荧光显微镜观察转染效率,再利用实时定量RT-PCR检测miR-33b的表达,以检测外源基因的表达活性。结果:成功构建了miR-33b真核表达载体;转染细胞后采用倒置荧光显微镜观察表明载体中GFP的表达活性较好;实时定量RT-PCR结果表明,相较于对照组细胞,miR-33b转染组中miR-33b表达显著增加,且具有显著性差异(P0.05)。结论:成功构建miR-33b真核表达载体,并为进一步研究miR-33b参与胃癌发生发展机制奠定基础。     

婴幼儿呼吸道合胞病毒肺炎外周血单核细胞miR-146a和miR-155的表达及与炎症反应关系

目的 探讨婴幼儿呼吸道合胞病毒(RSV)肺炎外周血单核细胞(PBMCs)miR-146a和miR-155的表达及与炎症反应关系。方法 选取2017年1月－2019年1月三峡大学第三临床医学院葛洲坝集团中心医院收治的84例RSV肺炎患儿作为研究组,根据病情严重程度分为轻度组和重度组。选取同期体检健康婴幼儿80例作为对照组,采集受试者外周血并分离单核细胞,采用实时荧光定量PCR检测单核细胞中miR-146a和miR-155水平,采用酶联免疫吸附法检测血清肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)水平,Pearson法分析两组受试者miR-146a、miR-155水平与炎症因子水平的相关性。结果 重度组患儿PBMCs中miR-146a水平明显低于轻度组与对照组(F=31.907,P＜0.05),轻度组与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);重度组患儿PBMCs中miR-155水平显著高于轻度组、对照组(F=143.127,P＜0.05),轻度组高于对照组(P＜0.05);研究组患儿血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平均高于对照组(t=36.627、39.350、22.743、10.617,P＜0.05)。RSV肺炎患儿miR-146a与TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8表达呈负相关(r=-0.473、-0.502、-0.396、-0.337,P＜0.05),miR-155与TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8表达呈正相关(r=0.451、0.394、0.359、0.382,P＜0.05)。结论 RSV肺炎患儿PBMCs中miR-146a低表达,miR-155高表达,并与患儿疾病严重程度及炎症反应相关。     

登革病毒诱导人单核细胞miR-146a表达的机制研究

目的 探究登革病毒感染引起miR-146a高表达所依赖的天然免疫信号通路。方法 通过RNAi技术沉默登革病毒感染后激活的信号通路的上游蛋白,或采用信号分子抑制剂阻断登革病毒感染后激活的信号通路的下游因子,然后通过real-time PCR检测miR-146a的表达变化。 结果 DENV2感染引起的miR-146a的表达沉默IPS-1后减少了60%,而TLR3的沉默对miR-146a的表达无影响;采用特异性的抑制剂抑制NF-κB、IKK、p38和JNK后均可下调miR-146a的表达,而ERK的抑制对miR-146a的表达无明显影响。 结论 登革病毒感染诱导miR-146a的表达依赖于上游RIG-I/MDA5-IPS-1以及下游的p38、IKK/JNK和NF-κB,而不依赖于上游的TLR3和下游的ERK。miR-146a可能成为预防和治疗登革病毒感染的一个新靶标,最终为临床治疗和预防登革出血热提供一个新的视野。     

脓毒症患儿血浆miR-146a、miR-223表达及其临床意义

目的 探讨脓毒症患儿血浆miR-146a、miR-223表达及其临床意义.方法 选取脓毒症患儿65例,其中一般脓毒症32例,重症脓毒症33例,以健康儿童40例为对照组.比较各组血浆miR-146a、miR-223、IL-6、IL-10和TNF-a的表达情况及相关性;分析miR-146a、miR-223对脓毒症的诊断价值...     

原发性及复发性翼状胬肉中miR-200b及miR-200c表达差异研究

目的探讨miR-200b及miR-200c在原发性及复发性翼状胬肉中表达差异情况。方法采用qRT-PCR检测原发性翼状胬肉组织(n=29)、复发性翼状胬肉组织(n=27)及对照组织(n=26)中miR-200b及miR-200c的表达水平。结果q RT-PCR检测结果显示,miR-200b及miR-200c在原发性翼状胬肉组织和复发性翼状胬肉组织中的表达水平均显著低于对照组织,差异均有统计学意义(P0.001);mi R-200b及miR-200c在复发性翼状胬肉组织中的表达水平显著低于原发性翼状胬肉组织,差异有统计学意义(P0.001)。结论 miR-200b及miR-200c在翼状胬肉组织中的表达下调,可能是新的早期诊断复发性翼状胬肉的分子标志物。     

miR-146a在子痫前期患者中的表达及临床意义

目的 探究miR-146a在正常产妇与子痫前期(preeclampsia,PE)患者胎盘组织中表达差异以及对子痫前期发病机制的影响.方法 选取临沂市中医医院2019年10月至2020年9月收治的PE患者24例作为PE组,另选取同期于本院分娩的24例健康妊娠妇女作为对照组.运用荧光实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)测量...     

负载ERRα基因片段慢病毒构建及表达

目的 构建编码人雌激素相关受体α(hERRα)的慢病毒载体,并测定其滴度,观察hERRα基因在体外的表达情况及其对人肺癌细胞A549增殖的影响。方法 采用PCR扩增hERRα基因片段,插入转移载体pW-PXLD,用磷酸钙法将pWPXLD-hERRα、psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞包装慢病毒,浓缩后测定病毒滴度,再将病毒感染A549细胞,用蛋白印迹方法测定感染病毒的A549细胞中hERRα的表达。选择合适滴度的病毒感染A549细胞,采用cell-titer的方法检测感染病毒的A549细胞的活力。结果 测序结果显示成功构建了重组质粒pWPXLD-hERRα,测定浓缩后的病毒滴度为1.8×10⁸TU/mL,蛋白印迹方法检测到慢病毒感染的A549细胞中hERRα呈阳性表达;cell-titer glo检测结果表明过表达hERRα能促进细胞增殖。结论 成功构建了负载hERR基因片段的慢病毒,hERRα能在感染的A549细胞中高效表达,并促进感染病毒的A549细胞增殖。     

miR-146a在宫颈癌中表达水平及与临床病理参数和预后的关系

目的探讨miR-146a在宫颈癌中表达水平及与临床病理参数和预后的关系,为宫颈癌患者的早期诊断、治疗提供理论及实践依据。方法选取2011年3月-2014年7月在兰州军区总医院安宁分院确诊的宫颈癌患者98例为观察组,同时选择该院门诊体检正常宫颈妇女72例为对照组,逆转录聚合酶链式反应法、酶联免疫吸附法及免疫组化方法测定miR-146a mRNA及蛋白的表达。结果观察组患者miR-146a mRNA及蛋白水平均明显高于对照组妇女,miR-146a阳性表达率高于对照组妇女,差异均有统计学意义(P0. 05)。miR-146a表达水平与年龄差异无统计学意义(P0. 05);与病理分型、病理学分级、TNM分期、浸润深度、淋巴血管间隙浸润、淋巴结转移相关性明显,且病理学分期越高、TNM分期越高、浸润深度越深、有淋巴血管间隙浸润、有淋巴结转移的患者miR-146a表达率越高,差异有统计学意义(P0. 05)。miR-146a阴性患者3年生存率及生存期均明显高于miR-146a阳性患者,差异有统计学意义(P0. 05)。结论 miR-146a在宫颈癌表达量高于正常宫颈组织,miR-146a在宫颈癌的发生发展过程中起促进作用,miR-146a低表达能获得较好的预后。     

PAX2慢病毒表达载体的制备及鉴定

目的 构建大鼠PAX2慢病毒表达载体,以期在大鼠肾脏中高效、稳定表达.方法 设计引物引入Age I酶切位点,使用PCR方法从质粒pcDNA3.1-PAX2中扩增小鼠PAX2基因的编码区序列,对所扩增出的目的片段回收纯化.用In-Fusion技术将Age Ⅰ内切酶消化后目的片段交换连接入Age Ⅰ酶切的pGC-FU载体,构建PAX2慢病毒表达载体pGC-FU-PAX2.酶切验证并测序正确后,将质粒pGC-FU-PAX2与慢病毒辅助包装载体共转染293T细胞,Western-blot验证PAX2在转染293T细胞中表达.结果 通过PCR扩增获得了PAX2基因,将PAX2克隆到慢病毒转移质粒pGC-FU中,并在293T细胞中包装产生慢病毒颗粒.结论 成功构建了PAX2慢病毒表达载体,为进一步从分子水平探讨PAX2功能奠定了基础.     

miR-146a在黏膜免疫中的调控作用

黏膜免疫是机体整个免疫网络的重要组成部分,又是具有独特结构和功能的独特免疫体系,其在抵抗感染方面起着极其重要的作用,是机体抵抗感染的第一道免疫屏障。近年来,越来越多的研究显示,微小RNA(miRNAs)具有强大的免疫调控功能,其中miR-146a作为协调免疫反应和炎症信号最重要的miRNAs之一,在包括免疫反应在内的多种生物过程和途径中发挥关键作用。本文综述了miR-146a与黏膜免疫的相关研究进展。     

NOB1基因shRNA慢病毒载体的构建及其对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响

目的:构建针对NOB1基因的shRNA慢病毒载体,并在卵巢癌SKOV3细胞上鉴定其沉默效率,观察其对细胞增殖能力的影响。方法:将筛选的NOB1基因特异性siRNA靶点,合成短发卡结构shRNA,并与pLVTHM慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,包装shRNA慢病毒颗粒,随后将其感染卵巢癌SKOV3细胞;采用Real-timePCR和Westernblot的方法检测靶基因在mRNA和蛋白水平的沉默效率,MTT和克隆形成实验观察NOB1基因沉默对SKOV3细胞增殖的作用。结果:构建的shRNA慢病毒颗粒感染SKOV3细胞后,NOB1基因的mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组下降73.5%,蛋白表达显著抑制,同时MTT实验显示细胞增殖能力显著降低,克隆形成实验表明细胞克隆形成能力明显减弱。结论:成功构建的NOB1基因shRNA慢病毒表达载体能够在卵巢癌SKOV3细胞上有效沉默靶基因,验证了NOB1基因具有影响卵巢癌细胞恶性增殖的能力。     

miR-338-3p和miR-518b在绒毛膜羊膜炎患者胎盘组织的表达及IL-6基因多态性

目的探讨miR-338-3p、miR-518b在绒毛膜羊膜炎患者胎盘组织中的表达及白细胞介素-6(IL-6)基因多态性。方法选择襄阳市中心医院2017年12月-2019年12月收治的胎膜早破并绒毛膜羊膜炎产妇50例为研究组,选择同期医院收治的胎膜早破未合并绒毛膜羊膜炎产妇50例为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链式反应技术检测两组患者胎盘组织中miR-338-3p、miR-518b相对表达水平;采用SNaPshot技术对IL-6基因rs1800796位点单核苷酸多态性(SNP)进行检测。结果研究组胎膜组织中miR-338-3p、miR-518b在mRNA相对表达水平高于对照组(均P<0.001);随着绒毛膜羊膜炎炎症严重程度的增加miR-338-3p、miR-518b在mRNA相对表达水平逐渐升高(P<0.05);两组患者基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡;研究组基因型、等位基因频率与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05);以CC基因型为参照,经Logistic回归分析校正混杂因素后,IL-6基因rs1800796位点携带GC+GG基因型者绒毛膜羊膜炎发病风险为CC基因型的2.154倍(P<0.05);IL-6基因rs1800796不同基因型miR-518b mRNA相对表达水平差异具有统计学意义(P<0.05),miR-338-3p无此趋势。结论miR-338-3p和miR-518b参与了胎膜早破产妇发生绒毛膜羊膜炎的病理过程,其中miR-518b可能通过调节IL-6基因rs1800796位点的方式参与此过程,其机制有待进一步探究。