来源于干细胞的树突细胞激活免疫细胞对同源白血病干细胞的杀伤作用

目的:探讨白血病干细胞(LSC)来源的树突细胞(DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共同培养对自身LSC的杀伤作用.方法:提取慢性粒细胞白血病加速期(CML-AP)患者的骨髓单个核细胞(BMMC),再应用CD34+CD38CD44+标记BMMC,流式分选仪分选出LSC并扩增、诱导出DC.取同源的单个核细胞诱导出CIK.用流式细胞技术检测DC和CIK细胞免疫表型、DC的p-糖蛋白(P-gp)耐药蛋白表达.荧光原位杂交(FISH)技术检测BCR/ABL融合基因在LSC及DC中的表达,乳酸脱氢酶释放法测定效应细胞对靶细胞的杀伤效应.结果:CIK与DC共培养后,CD40、CD80、CD83及人类白细胞抗原(HLA-DR)的构成均高于共培养前;CD3、CD3CD8、CD3CD56的成熟表型表达率高于共培养前,差异有统计学意义(P＜ 0.05或P＜0.01).干细胞来源DC的P-gp表达阳性率为(60.61±12.38)％.3种效靶比对应的杀伤率差异有统计学意义(P＜0.01),随着效靶比的增加,细胞杀伤作用增强.结论:白血病干细胞来源DC功能正常,与CIK共培养对自身LSC有杀伤作用.     

恶性腹腔积液来源的树突状细胞与CIK共培养后对结肠癌细胞体外杀伤作用的研究

目的探讨恶性腹腔积液来源的树突状细胞（DC）与CIK细胞共培养后对SW620结肠腺癌细胞的体外杀伤作用。方法分离15例结肠癌患者的腹腔积液培养获得成熟DC,分离健康人外周血培养获得CIK细胞,DC细胞与CIK细胞共培养,流式细胞仪鉴定表型,MTT法检测各组对结肠癌细胞的体外杀伤作用。结果恶性腹腔积液中存在DC前体细胞,经体外细胞因子诱导培养后可获得成熟的DC细胞,高表达HLA—DR、CD80、CD83、CD86分子。DC与CIK共培养对SW620结肠腺癌细胞的杀伤作用较单独CIK组有明显差异（P〈0．05）。结论腹腔积液中存在DC前体细胞在体外诱导培养可获得功能正常的成熟DC细胞,与CIK共培养后可增强其体外杀伤毒性。     

树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞体外抗肺癌的实验研究

目的探讨树突状细胞（DC）联合细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）在体内外能否有效的抗肺癌。方法正常人外周血单个核细胞经不同细胞因子作用后培养成DC和CIK细胞,单个核细胞经贴附塑料平皿获得单核细胞,加入GM—CSF,IL-4及TNF—a诱导获得DC,悬浮细胞加入IFN—g,24h后IL-1a,IL-2及CD3McAb诱导获得CIK,将A549制备成肿瘤细胞冻融物．作为肿瘤抗原刺激DC,并将DC与CIK细胞联合培养（DC＋CIK,负载抗原的DC＋CIK）,以CIK细胞单独培养作为对照。CytotoxicityTOX96体外杀伤实验测定体外细胞毒活性。结果在培养的第15d．与负载抗原的DC共同培养的CIK与CIK细胞单独培养细胞相比,增殖速率明显提高[（23．4±2．3）倍vs（16．7±2．7）倍,P〈0．05],CD3＋CD56＋细胞表达水平也明显提高,[（64．3±3．6）％vs（43．9±2．1）％,P〈0．05],同时负载抗原的DC的CIK对A549细胞的体外下细胞毒活性增强。结论DC与CIK细胞共培养后可提高CIK细胞的增殖速率,提高CIK细胞表型的表达水平,增强CIK抗肺癌的活性．将来可作为一种临床有效的过继免疫治疗策略。     

脐血来源树突状细胞增强CIK细胞对肺癌细胞株的杀伤作用

目的探讨肺癌细胞株A549肿瘤冻融抗原负荷脐血来源树突状细胞(DCs)与CIK细胞混合培养后对A549细胞杀伤活性的影响作用。方法取对数生长期的A549细胞制备肿瘤抗原(Ag),用脐血单个核细胞(CBMC)分别制备DCs和CIK细胞;用负荷Ag的DCs和CIK细胞共培养,诱导Ag-DC-CIK细胞。用流式细胞术检测DC免疫表型,MTT法检测CBMC、CIK、Ag-CIK和Ag-DC-CIK对A549肿瘤细胞株的杀伤活性。结果脐血DCs高表达CD86、CD40,中度表达CD83和CD80,低表达CD11c。实验组细胞(Ag-DC-CIK)对A549细胞的杀伤能力(62%)明显高于对照组(P<0.01),结论肿瘤抗原负荷的DCs能增强CIK细胞对靶细胞的杀伤活性,为DCs的免疫治疗提供了新的思路。     

耐药乳腺癌裸鼠模型免疫治疗初探

目的 耐药乳腺癌表现为治疗效果差,转移率高,死亡率高的一种恶性程度极高的肿瘤性疾病。有研究表明,细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）在树突细胞（DC）辅助下,对耐药肿瘤细胞的杀伤能力可能超过T细胞。本实验利用DC与CIK联合培养,比较在不同条件下对乳腺癌多药耐药细胞株的杀伤效应。 方法 分离健康人外周血获得单个核细胞,分别诱导为树突细胞（DC）和CIK细胞,将人类乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR细胞的冻融物抗原冲击DC（AP-DC）,分别将DC与CIK细胞共培养（AP-DC+CIK 、DC+CIK）,CIK细胞单独培养作对照。用流式细胞仪分析细胞表型,酶联免疫吸附法（ELISA）测定分泌IL-12、TNF-α、IFN-γ和IL-2水平,MTT法测定细胞毒效应。结果 DC和CIK细胞共孵育,使CIK细胞的CD3CD56双阳性细胞的比例及分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2的水平增高,DC的成熟表型和分泌IL-12的水平增加,其中均以AP-DC+CIK组增高最为明显,和其他组间比较差异有统计学意义。对乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR的细胞毒效应,AP-DC+CIK组杀伤效应最强, 与DC+CIK组和CIK组比较差异均有统计学意义;结论 经耐药肿瘤抗原负载的DC与CIK共同作用后,其对耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR的抗瘤免疫能力最强,为临床治疗耐药肿瘤带来希望。     

树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞体内外抗肺癌的实验效应研究

目的探讨树突状细胞（DC）联合细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）在体内外对肺癌的影响。方法正常人外周血单个核细胞经不同细胞因子作用后培养成DC和CIK细胞,单个核细胞经贴附塑料平皿获得单核细胞,加入GM-CSF,IL-4及TNF-a诱导获得DC,悬浮细胞加入IFN-g,24h后IL-1a,IL-2及CD3McAb诱导获得CIK,将A549制备成肿瘤细胞冻融物,作为肿瘤抗原刺激DC,并将DC与CIK细胞联合培养（DC＋CIK,负载抗原的DC＋CIK）,以CIK细胞单独培养作为对照。用流式细胞仪分析细胞表型,自体混合淋巴细胞反应和异体混合淋巴细胞反应检测其刺激T细胞的的增殖活性。Cytotoxicity TOX96体外杀伤实验测定体外细胞毒活性,同时用A549细胞系建立荷瘤裸鼠模型研究其体内抗肺癌活性。结果在培养的第15d,与负载抗原的DC共同培养的CIK与CIK细胞单独培养细胞相比,增殖速率明显提高[（23.4±2.3）倍vs（16.7±2.7）倍,P〈0.05],CD3＋CD56＋细胞表达水平也明显提高,[（64.3±3.6）%vs（43.9±2.1）%,P〈0.05],同时负载抗原的DC的CIK对A549细胞的体外下细胞毒活性增强,体内实验显示,与单独培养的CIK细胞相比,与负载抗原的DC共同培养的CIK,可明显抑制接种瘤细胞的裸鼠成瘤率,DC＋CIK与负载抗原的DC＋CIK在抗六效应上没有明显差异。结论 DC与CIK细胞共培养后可提高CIK细胞的增殖速率,提高CIK细胞表型的表达水平,增强CIK体内抗肺癌的活性。将来可作为一种临床有效的过继免疫治疗策略。     

CIK细胞体外诱导培养及对不同肿瘤细胞株的细胞毒作用

目的体外诱导培养细胞因子诱导的杀伤性细胞（CIK）,研究其增殖、免疫表型变化及对不同肿瘤细胞系的杀伤作用。方法从外周血中分离单个核细胞,多种细胞因子进行诱导,扩增培养CIK细胞,细胞计数检测其增殖能力,流式细胞仪检测细胞免疫表型,MTT法检测CIK细胞对人红白血病细胞系K562、人B淋巴瘤细胞系BJAB、人肺癌细胞系A549、人乳腺癌细胞系MCF-7、人肝癌细胞系HepG2的细胞毒性作用。结果 CIK细胞在第5天开始进入快速增殖阶段,20 d后增殖为原种植细胞数的182倍,免疫表型为CD3+（97.83±1.03）%、CD3+CD8+（77.12±1.60）%、CD3+CD56+（27.58±2.02）%。CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD56+的比例随着培养时间的延长增殖迅速（P＜0.01）;培养第13天,细胞杀伤效靶比为40∶1的情况下对细胞系进行杀伤,K562为（88.89±7.22）%、BJAB为（75.42±9.52）%、A549为（63.19±5.67）%、MCF-7为（43.53±6.31）%、HepG2为（42.63±7.69）%,CIK细胞对以上细胞系均有明显的杀伤活性。结论通过细胞因子的诱导培养,可以在体外大量增殖CIK细胞,CIK细胞对不同肿瘤细胞株有很强的杀伤作用,具有很高的临床应用价值。     

树突状细胞诱导的淋巴因子激活的杀伤细胞对肺癌细胞系A549的体外杀伤作用

目的:探讨负载肺癌抗原的树突状细胞(dendritic cells,DC)诱导淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞对肺癌细胞A549的杀伤作用.方法:采用肺癌患者外周血单个核细胞(PBMC)经rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-a诱导和肿瘤冻融抗原刺激诱导获得的DC与LAK细胞按1:20比例共培养2 d,获得Ag-DC-LAK细胞作效应细胞,分别用Ag-Dc-LAK、DC-LAK、Ag-LAK和LAK对肺癌细胞系A549细胞进行杀伤实验.结果:以30μg/mL蛋白的肿瘤抗原负载的DC其表型CD1a、CD80、CD86、HLA-DR均显著升高(P<0.05),高于单纯细胞因子诱导成熟的DCs表型,由其刺激增殖的LAK细胞对肺癌细胞A549杀伤率为(71±5)%,明显高于对照组(P<0.05).结论:经肿瘤抗原刺激诱导成熟的DC可有效传递抗原,增加T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用.     

耐药乳腺癌免疫治疗的实验研究

目的:探讨耐药乳腺癌抗原负载的树突细胞(DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)联合培养后对同种乳腺癌荷瘤小鼠的可能治疗机制.方法:分离健康人外周血获得单个核细胞,分别诱导为DC和CIK细胞,将人类乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR细胞的冻融物抗原冲击DC(AP-DC),分别将DC与CIK细胞共培养(AP-DC+CIK组、DC+CIK组),将细胞经尾静脉注入裸鼠体内,观察不同组荷瘤标本中MDR1的表达、肿瘤细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达.结果:AP-DC+CIK组、DC+CIK组、CIK组及生理盐水组MDR1/β-actin比值分别为0.14、0.57、0.81及0.98.生理盐水组、CIK组、DC+CIK组和AP-DC+CIK组平均凋亡指数差异有统计学意义(P＜0.001).各组Bcl-2及Bax蛋白表达的OD值差异有统计学意义(P＜0.01),Bcl-2/Bax值AP-DC+CIK组＜DC+CIK组＜CIK组＜生理盐水组.结论:经耐药乳腺癌抗原负载的DC与CIK共同作用后,诱导同种乳腺癌细胞凋亡强于单纯DC与CIK共同作用后及单独CIK的治疗效果.     

脐带血与外周血来源树突细胞体外刺激特异抗白血病T细胞免疫应答

目的：比较脐血（CB）及外周血（PB）单个核细胞（MNC）体外诱导生成树突状细胞（DC）的产量;并将此DC负载白血病抗原,检测两者诱导的特异性细胞毒T细胞（CTL）对白血病细胞的杀伤活性。方法：取CB及健康成人PB各8份,以淋巴细胞分离液分离获得MNCs,培养体系中加入重组人粒单核细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）,重组人白细胞介素4（rhIL-4）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）,并在培养第5天,加入HL-60细胞经反复冻融提取的抗原,致敏DC。培养过程中,观察树突状细胞形态,流式细胞仪（FCM）检测表型。培养第12天收获成熟DC,CB组分别与8例PB来源T淋巴细胞共培养;PB组与自体T淋巴细胞共培养,诱导产生白血病特异性CTL,乳酸脱氢酶法（LDH法）测定溶靶细胞活性。结果：（1）CB与PB来源DC均表现出成熟DC典型形态和免疫表型特征,2组DC相关分化抗原CD1a、CD83、CD86、CD80和人类白细胞相关抗原DR（HLA-DR）的表达较培养前增高,2组比较差异无统计学意义（P〉0.05）。（2）CB组DC产量高于PB组,差异有统计学意义（P〈0.01）。（3）以白血病抗原冲击的DC所刺激的T淋巴细胞对白血病靶细胞显示出明显的杀伤活性,按照各效靶比进行两者的比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：利用细胞因子体外诱导CB及PB来源MNCs均能产生大量成熟DC,且功能相同;前者DC产量更高,来源丰富,可能成为急性白血病免疫治疗中DC的丰富来源。     

负载抗原DC与CIK共培养对富集培养乳腺癌CTCs杀伤作用研究

[Abstract]ObjectiveTo study the kill activity of the whole tumor cell antigen (Ag) pulsed dendritic cell (DC) coculture with cytokine induced killer cell (CIK) for breast cancer circulating tumor cells (CTCs).Methods Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from breast cancer patients with CTCs using a blood cell separator instrument. The epidermal cell adhesion molecule (EpCAM ) (+) breast cancer CTCs enriched by MACS were cultured in vitro. The nested RT-PCR, cell immunofluorescence imaging (CK8/18), and immunohistochemistry (CK8/18and CK19) methods, were used for the detection and identification of the cells. EpCAM (-) cells were routinely induced to DC and CIK, which were grouped into Ag-DC-CIK group, DC-CIK group, DC group and CIK group. The cytotoxic activity of co-cultured DC-CIK against breast cancer CTCs was detected by flow cytometry and MTT assay. The cell morphology was observed by light microscopy and transmission electron microscopy.ResultsThe target band of CK19mRNA can be detected by nested RT-PCR. The expressions of CK8/18and CK19of EpCAM (+) cells in vitro were positive by immunofluorescence staining and immunohis?tochemical staining. The proliferative activity of co-cultured DC-CIK was higher than that of CIK (P＜0.001). The positive rates of CD1α+, CD83+CD86+, CD83+CD11C+, CD86+CD11C+DCs and CD3+CD8+, CD3+CD56+CIKs were significantly higher in Ag- DC- CIK group than those of DC- CIK group, DC group and CIK group (P＜0.05). The apoptosis of breast cancer CTCs was induced in Ag-DC-CIK, DC-CIK and CIK3groups, and apoptotic rates were (56.83±3.07)%,(31.43±1.77)% and (24.70±1.51)%, showing significant differences between them (P＜0.05). Transmission electron microscopy showed the typical micro-structure of breast cancer CTCs induced apoptosis.ConclusionMACS in combination with cell immunological methods can improve significantly the detective sensitivity of breast cancer CTCs. The co-cultured Ag-DC-CIK is highly effective immune cells,which shows a high er proliferation and cytoxicty against breast cancer CTCs. This may be used as a clinically immunotherapy means of anti-breast cancer recurrence and metastasis.     

特异性抗原致敏的DC-CIK细胞对B16黑色素瘤多途径抑瘤作用的研究

目的探讨特异性抗原致敏的树突状细胞(dentritic cells,DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer,CIK)细胞对B16黑色素瘤的作用。方法采用特异性肿瘤抗原致敏的DC与CIK细胞共同培养,分析其免疫表型,计算抑瘤率;流式细胞(FCM)检测癌细胞增殖周期中G0/G1期、S期、G2/M期细胞比率和细胞凋亡指数(apoptosis Index,AI)、细胞增殖指数(proliferation Index,PI)的变化;透射电镜观察形态学变化;并用MTT法检测其对肿瘤细胞的杀伤力。结果特异性抗原致敏的DC-CIK细胞组抑瘤率高于DC-CIK组和CIK组;FCM检测G0/G1期细胞比率、AI显著升高,S期无明显变化,G2/M期细胞比率、PI显著下降;特异性抗原致敏的DC-CIK细胞组杀伤活性明显升高(P<0.05)。结论特异性抗原致敏的DC-CIK细胞对B16黑色素瘤的抑瘤作用明显高于DC-CIK细胞和单纯CIK细胞。     

中晚期非小细胞肺癌化疗联合DC-CIK细胞免疫治疗的临床效果评价

目的 观察中晚期非小细胞肺癌患者采用化疗联合树突细胞-细胞因子诱导杀伤细胞(DC-CIK)免疫治疗的临床效果.方法 选择2013年4月—2016年1月收治的中晚期非小细胞肺癌患者78例,按治疗方法分为观察组39例(紫杉醇+顺铂化疗联合DC-CIK细胞免疫治疗)和对照组39例(单纯紫杉醇+顺铂化疗).采用酶联免疫吸附法检测血清肿瘤标志物细胞角蛋白19血清片段211(CYFRA211)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)的表达.采用流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群、CIK细胞及Treg细胞的数量和比例,采用实体瘤疗效评价标准评估临床疗效,采用卡氏功能状态评分评估生存质量改善情况.结果 治疗后两组血清CYFRA211、CEA和CA125水平明显低于治疗前(P<0.05),且观察组明显低于对照组(P<0.05).治疗后对照组CD3+、CD4+、CD8+、CIK细胞的阳性细胞率明显低于治疗前(P<0.05),Treg细胞的阳性细胞率明显高于治疗前(P<0.05).治疗后观察组CD3+、CD4+、CD8+、CIK细胞的阳性细胞率明显高于治疗前和对照组(P<0.05),Treg细胞的阳性细胞率明显低于治疗前和对照组(P<0.05).观察组生活质量提高率、有效率和疾病控制率明显高于对照组(P<0.05).结论 化疗联合DC-CIK细胞免疫能提高中晚期非小细胞肺癌患者的临床治疗效果,并且能显著改善患者的免疫功能和生活质量.     

负载干细胞抗原的DC联合CIK细胞对乳腺癌荷瘤鼠肿瘤杀伤研究

目的：研究不同乳腺癌细胞抗原负载的DC-CIK细胞对于乳腺癌荷瘤鼠体内肿瘤的杀伤效果及其与Wnt通路的关系。方法：分离乳腺癌细胞系MCF-7/ADR中的干细胞并制备冻融抗原,以此冲击由正常人外周血提取的单个核细胞诱导培养的DC-CIK细胞,注入已建立的MCF-7/ADR乳腺癌荷瘤鼠模型中,并且与普通抗原冲击的DC-CIK细胞,未经抗原冲击DC-CIK细胞,单纯CIK细胞,及生理盐水组建立实验组及对照组,观察此5组中小鼠肿瘤细胞生长情况,通过原位末端标记法（TUNEL）检测各组肿瘤组织凋亡情况,免疫组化法检测bcl-2,Bax及β-catenin表达情况。结果：实验组和对照组小鼠肿瘤体积在治疗后存在差异,同组小鼠肿瘤体积体积在治疗前后也存在差异,对照组小鼠肿瘤体积最大（3.6245±0.09264）cm3,经干细胞抗原冲击的DC-CIK治疗组肿瘤体积最小（1.2342±0.13116） cm3,其tunel染色阳性率最高,bax表达阳性最强,bcl-2,β-catenin表达较其他组最弱。结论：经乳腺癌干细胞抗原冲击的DC-CIK细胞对乳腺癌荷瘤鼠的肿瘤组织较强的杀伤效果,其机制可能是Wnt/β-catenin信号通路中的β-catenin表达降低,并引起bax表达增高,bcl-2表达降低,从而引起肿瘤细胞凋亡。     

DC-GPC3联合CIK 细胞的体外抗肝癌作用

摘要： 目的 探讨磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 （GPC3） 基因转染的树突状细胞 （DC-GPC3） 与细胞因子诱导杀伤细胞（CIK） 共培养 （DCIK-GPC3） 后, 对 CIK 的生物活性及体外抗肝癌细胞作用。方法 流式细胞术检测 DCIK-GPC3、 DC-CIK 及 CIK 各组效应细胞免疫表型, MTT 法检测各组效应细胞培养上清液中白细胞介素 （IL） -2 生物活性, 酶联免疫吸附试验 （ELISA） 检测细胞培养上清液中 IL-2、 干扰素 γ （IFN-γ） 浓度。乳酸脱氢酶释放实验分别检测各组效应细胞对肝癌 HepG2 细胞的细胞毒活性。结果 DCIK-GPC3 表面高表达 CD3+ CD8+ 和 CD3+ CD56+ 双阳性细胞, 与 DCIK 及 CIK 比较差异有统计学意义 （P＜0.05）; CIK、 DCIK、 DCIK-GPC3 培养上清液中 IL-2 生物活性、 浓度以及 IFN-γ 浓度均依次升高, 组间多重比较差异有统计学意义 （P＜0.05）; 在 20∶1 及 50 ∶1 效靶比, CIK、 DCIK、 DCIK- GPC3 对 HepG2 细胞的细胞毒活性依次升高, 组间多重比较差异均有统计学意义 （P＜0.05）。结论 CIK 与 DC- GPC3共培养可获得更强的体外杀伤肝癌细胞活性, 为DCIK-GPC3用于临床免疫治疗提供了理论和实验依据。     

化疗联合CIK输注对晚期NSCLC患者T细胞哑群及生存的影响

目的：探讨化疗联合细胞因子诱导的杀伤细胞（ cytokine induced killer ,CIK）治疗晚期非小细胞肺癌（ non small cell lung cancer,NSCLC）患者的近期疗效。方法将61例确诊的晚期非小细胞肺癌患者给予化疗联合CIK治疗,观察治疗前后外周血中T细胞亚群及细胞因子的变化和临床疗效,并观察其对1年总生存率和无进展生存期的影响。结果 CIK回输后患者CD3、CD8、CD56的比例较治疗前明显上调（P＜0．05）,且CIK输注可明显提高患者Th1类细胞因子IFN-γ和TNF-α的水平（P＜0．05）。治疗总体有效率为47．3％,临床获益率为67．3％。该研究患者的中位总生存期为10．3个月,1年生存率为22．9％,而无进展生存期7．2个月,1年无进展生存为14．0％。结论化疗CIK治疗能提高患者的免疫功能及生活质量,有望成为非小细胞肺癌有效的过继免疫治疗方法。