重组人肝再生增强因子原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 用聚合酶链反应法（ＰＣＲ）和基因重组技术构建重组人肝再生增强因子原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达。方法 利用ＰＣＲ方法从我们构建的ＰＵＣ１９－ｈＡＬＲ质粒中扩增出带ＮｄｅⅠ和ＢａｍＨⅠ酶切位点的ｈＡＬＲ编码区ＤＮＡ。ＰＣＲ产物和质粒ｐＥＴ１１ａ分别被相应内切酶消化,然后被Ｔ４ ＤＮＡ连接酶连接以获取重组表达质粒。重组表达质粒ｐＥＴ１１ａ－ｈＡＬＲ经电转化入大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中,在Ｉ     

肝再生增强因子在肝癌细胞中的表达及意义

目的研究肝再生增强因子(ALR)对肝癌细胞和原代大鼠肝细胞增殖作用的影响及在肝细胞癌(HCC)中的表达。方法将不同种属的ALR分别与原代大鼠肝细胞和人肝癌细胞株QGY和HepG2共同培养后，用^3H-胸腺嘧啶核苷掺入法测定这些细胞的增殖情况。并应用免疫组织化学法对9例正常肝组织和21例HCC组织中ALR的表达进行了研究。结果不同种属的ALR在体外均能刺激人肝癌细胞株QGY和HepG2增殖，并呈剂量依赖关系，但对原代大鼠肝细胞均无刺激增殖作用。在正常肝组织中ALR不表达，但在HCC肝组织中ALR均表达，且ALR的表达程度与HCC分化程度和大小均无关。结论ALR可能在HCC的发生发展中起着重要作用。     

肝再生增强因子在肝再生中的作用

肝脏是人体少有的能够快速再生的器官之一，很多病理状态都可引起肝细胞再生，其复杂的生理功能受到多种生长因子的调节。已知的可以促进肝细胞再生的生长因子有：肝细胞生长因子（HGF）、     

人肝再生增强因子小干扰RNA表达质粒的构建和鉴定

目的 检测人肝癌细胞株HepG2细胞有无人肝再生增强因子(hALR)的表达，构建针对人肝再生增强因子基因编码区的小干扰RNA(siRNA)表达质粒pSIALR-A及其阴性对照质粒pSIALR-B，观察其对人肝再生增强因子表达的影响。方法 用免疫细胞化学法观察HePG2细胞表达hALR的情况。将构建成功的pSIALR-A和pSIALR-B分别转染HepG2细胞，转染后48h，用免疫细胞化学法及逆转录聚合酶链反应法观察人肝再生增强因子蛋白及mRNA的表达。结果 HePG2细胞有人肝再生增强因子的表达。成功构建了针对人肝再生增强因子基因编码区的siRNA表达质粒pSIALR-A，并发现它能明显抑制人肝再生增强因子的表达，而随机序列的siRNA却无此作用。结论 人肝再生增强因子的siRNA具有明显和特异性的抑制人肝再生增强因子的表达作用。     

肝再生增强因子研究进展

肝再生增强因子是一种新型的肝细胞刺激因子。本文从分子生物学特性、生物活性与作用机制等方面对肝再生增强因子的研究进展进行综述。     

大鼠肝再生增强因子在酵母菌中的表达及生物活性研究

目的构建大鼠肝再生增强因子(rALR)酵母重组表达质粒,在毕赤酵母菌GS115中进行表达.表达产物经超滤方法纯化后在体外进行生物活性研究. 方法以重组质粒pcDNA3.1-rALR为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增rALR编码区的DNA,构建重组质粒pPIC9K-rALR,然后电转化至毕赤酵母菌GS115中,在甲醇诱导下进行表达.表达产物经1.5% SDS-PAGE电泳和western blot鉴定后进行超滤纯化.用3H-TdR掺入法检测重组大鼠ALR(rrALR)体外刺激QGY和HepG2人肝癌细胞株和原代大鼠肝细胞的增殖情况. 结果重组质粒经酶切及PCR证实rALR编码区DNA正确插入质粒载体中.重组大鼠ALR被GS115菌以外分泌方式表达,其DNA分子量约为1.5×104,与理论预期值相符,western bolt鉴定发现rrALR能与抗人ALR多克隆抗体发生特异性反应,说明人和大鼠ALR抗原性上存在部分交叉.超滤纯化获得大量高纯度的rrALR.在所测定的剂量范围内,rrALR在体外以剂量依赖方式刺激QGY和HepG2肝癌细胞株增殖,但对原代大鼠肝细胞无刺激增殖作用. 结论 rrALR在毕赤酵母菌GS115中获得分泌性高效表达,rrALR在体外以剂量依赖方式刺激QGY和HepG2肝癌细胞株增殖,但对原代大鼠肝细胞无刺激增殖作用,表明肝癌细胞和正常肝细胞表达的ALR受体不同.人和大鼠ALR在生物学活性和抗原性上存在交叉.     

肝再生增强因子的作用机制

人和动物血清中存在着促进肝再生的蛋白质因子 ,早期的研究中统称为肝刺激物质 (ＨＳＳ) [1,2 ] 。研究表明 ,肝再生增强因子 (ＡＬＲ)是ＨＳＳ的主要成分[1] 。有关ＨＳＳ主要功能性成分及其作用机制的研究 ,不仅有助于了解肝脏再生的生物学机制 ,而且有助于新型治疗方法的探索。1　肝再生增强因子的基因及蛋白质结构1994年Ｈａｇｉｙａ等[3 ] 首次克隆的大鼠ＡＬＲ的ｃＤＮＡ序列以及以后克隆的小鼠[4 ] 、大鼠[5,6] 和人[7～ 9] 的ＡＬＲ的ｃＤＮＡ基因序列 ,都认为不同种属的ＡＬＲ都是由 12 5个氨基酸残基组成的 ,其开放读码框架 (ＯＲ…     

肝再生增强因子在肝脏中的作用

肝再生增强因子（ALR）除了促进肝再生,保护肝损伤之外,可能在肝脏的器官形成和发育中也发挥着重要作用。介绍了ALR在肝脏中的生物学功能和机制研究的最新进展,并归纳总结了ALR在肝脏疾病的诊断和治疗中的应用。指出ALR可能通过线粒体途径调控肝细胞的凋亡,从而参与肝脏的修复和再生。未来ALR可能作为肝衰竭患者肝再生及预后评估的候选分子,并有望成为临床治疗严重肝病和肝衰竭的有效药物。     

肝再生增强因子研究进展

肝再生过程的启动与调控机制一直是人们关注的热点。1975年LaBrecque等首次证实了一种能特异性刺激哺乳动物肝细胞DNA合成的物质：肝刺激物（hepatic stimulatory substance,HSS）。     

重组人肝再生增强因子的克隆、表达及纯化

目的通过构建原核表达系统，在大肠埃希菌中表达重组人肝再生增强因子（hALR）蛋白，为各种急慢性肝损伤及肝衰竭的治疗提供新的治疗方法奠定基础。方法利用正常人肝组织提取总RNA，经一步法逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）获取hALR cDNA全序列，构建原核表达载体hALR—pET28a（＋）转化大肠埃希菌（BL21），诱导表达重组hALR蛋白，以组氨酸为标签进行蛋白纯化。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western Blot鉴定重组蛋白。结果经双酶切和DNA测序证实hALR cDNA正确插入表达载体pET28a（＋），成功表达并纯化得相对分子质量为23000的重组蛋白，低温诱导表达使可溶蛋白明显增加，与预期结果相符。结论成功表达和纯化获重组hALR蛋白。     

鼠人肝再生增强因子的cDNA克隆及序列分析

目的克隆大鼠及人肝再生增强因子的ｃＤＮＡ．方法按文献报道大鼠及人肝再生增强因子核苷酸序列设计合成引物．利用ｍＲＮＡ抽提试剂盒分别从乳鼠及人胎肝组织中提取ｍＲＮＡ，再逆转录聚合酶链反应扩增出需要的ｃＤＮＡ片段，经克隆入ｐＧＥＭＴ质粒后以Ｔ７ＤＮＡ聚合酶序列分析试剂盒测定ｃＤＮＡ的序列．结果经ＲＴＰＣＲ反应顺利扩增到４７０ｂｐ的鼠肝再生增加因子ｃＤＮＡ及３８４ｂｐ的人肝再生增强因子．结论所得到的ｃＤＮＡ序列与文献报道一致     

肝再生增强因子对细胞周期素依赖性激酶1基因表达的影响

目的研究人肝再生增强因子(ALR)对细胞周期素依赖性激酶1启动子(CDK1p)转录调节的作用,探讨ALR的生物学作用机制。方法根据GenBank中CDK1p序列的分析设计引物,应用聚合酶链反应(PCR)扩增人CDK1基因启动子基因序列,并克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建CDK1启动子报告基因表达载体pCAT3-CDK1p,以该质粒转染HepG2细胞系,并同时与pcDNA3.1(-)-ALR共转染HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果 pCAT3-CDK1p组CAT表达活性明显高于pCAT3-basic组,差异有统计学意义,pCAT3-CDK1p与pcDNA3.1(-)-ALR共转染组的CAT表达活性明显低于pCAT3-CDK1p组,差异有统计学意义。结论 CDK1启动子有顺式激活下游基因的活性,ALR对CDK1基因有下调作用。     

Cloning and sequence analysis of the rat augmenter of liver regeneration (ALR) gene: expression of biologically active recombinant ALR and demonstration of tissue distribution.

A full-length cDNA clone encoding a purified augmenter of liver regeneration (ALR) factor prepared from the cytosol of weanling rat livers was isolated. The 1.2-kb cDNA included a 299-bp 5' untranslated region, a 375-bp coding region, and a 550-bp 3' untranslated region. It encoded a protein consisting of 125 amino acids. The molecular weight of ALR calculated from the cDNA was 15,081, which is consistent with the size estimated by SDS/PAGE under reducing conditions. The molecular weight of the purified native ALR estimated by SDS/PAGE under nonreducing conditions was approximately 30,000; thus ALR apparently has a homodimeric structure. The recombinant ALR produced by expression of the cDNA in COS cells was tested in vivo in the canine Eck fistula model and found to have potency equivalent to the purified native ALR. The 125-aa sequence deduced from the rat ALR cDNA shows 50% homology to the amino acid sequence of the gene for oxidative phosphorylation and vegetative growth in the yeast Saccharomyces cerevisiae.     

重组人肝再生增强因子可促进实验性肝纤维化基质分解素-1的基因表达

目的：了解重组人肝再生增强因子（hALR)对实验性肝纤维化基质分解素－1（MMP3）基因表达的影响。方法：建立四氯化碳（CCl4)中毒性及人血白蛋白免疫损伤性两种大鼠肝纤维化模型,在造模的同时给予不同剂量的重组hALR。在不同的时间点留取大鼠肝组织标本,提取总RNA,用RT－PCR测定MMP3的基因表达水平。结果：在两种模型中,hALR治疗组大鼠肝组织MMP3的基因表达水平在模型形成的不同阶段均明显高于模型组;高剂量hALR组大鼠肝组织MMP3的基因表达水平均明显高于低剂量组。结论：重组hALR可能有促进大鼠实验性肝纤维化MMP3基因表达的作用。     

重组人肝再生增强因子抑制实验性肝纤维化明胶酶A基因表达

目的　了解重组人肝再生增强因子 (hALR)对实验性肝纤维化明胶酶A(MMP2 )基因表达的影响。方法　建立CCl4中毒性及人血白蛋白免疫损伤性两种大鼠肝纤维化模型 ,在造模的同时给予不同剂量 (10 ,5 0 μg·kg-1·d-1)的hALR。在不同的时间点留取大鼠肝组织标本 ,提取总RNA ,用逆转录定量聚合酶链反应 (RT PCR)测定MMP2 的基因表达水平。结果　在两种模型中两个剂量hALR预防组大鼠肝组织MMP2 的基因表达水平在模型形成的不同阶段均明显低于模型组 ;高剂量hALR组大鼠肝组织MMP2 的基因表达水平均明显低于低剂量组。结论　重组人肝再生增强因子可能有抑制大鼠实验性肝纤维化MMP2 基因表达的作用     

大鼠肝再生增强因子基因组DNA的克隆化与序列分析

根据大鼠肝再生增强因子(Augmenter of liver regeneration,ALR)cDNA序列设计特异性引物,采用多聚酶链反应(PCR)法自Wistar大鼠基因组DNA中扩增出大鼠ALR基因组DNA,全长为1508nbp,结构为3个外显子和2个内含子,外显子长度分别为18bp、197bp和163bp,各编码6个、64个和55个氨基酸残基,长度与小鼠、人类ALR的外显子一致。     

大鼠肝再生增强因子假基因的克隆化与序列分析

目的 研究大鼠肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration,ALR）在大鼠基因组织中的存在方式。方法 以大鼠基因组DNA为模板,根据ALP cDNA序列设计引物,用多聚酶链反应（PCR）扩增产物,连入pGEM Teasy Vector后测序。结果 PCR法扩增出两条产物,其一经测序发现为ALR的假基因,预测氨基酸序列与ALR的同源性为88.8%。结论 作为肝细胞再生过程中重要的生长刺激因子,大鼠ALR存在假基因,提示可能存在ALR多基因家族。为研究ALR分子的进货规律提供了依据。     

重组肝再生增强因子对大鼠肝纤维化的保护作用

目的　观察重组肝再生增强因子 (rALR)对大鼠肝纤维化的保护作用。方法　构建表达ALR的质粒 ,将得到的rALR用于CCl4 致肝纤维化的大鼠 ,观察rALR对肝纤维化动物模型肝功能、血清细胞外基质水平及肝组织纤维化程度的影响。结果　rALR可显著改善CCl4 肝纤维化模型大鼠肝功能 ,降低血清细胞外基质水平和肝组织纤维化程度。结论　rALR对实验大鼠肝功能具有显著的改善作用 ,对抗肝纤维化亦有一定的作用。