同种异体脱钙骨基质的组织工程学特性

背景:由骨衍生的支架材料无论形态学和力学特征,具有合成材料无可比拟的优势,脱钙骨基质具有和自体骨最接近的三维结构,同时以Ⅰ型胶原为主,胶原是细胞黏附和生长的良好支架.目的:从组织工程学角度研究同种异体脱钙骨基质的生物学特性,探讨其作为软骨组织工程支架材料的可行性.方法:据Urist描述的方法制备青紫蓝兔同种异体脱钙骨基质,扫描电镜观察脱钙骨基质的超微结构,测定其孔径、孔隙率和降解率,测定同种异体脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞的黏附率,兔体内植入法评价同种异体脱钙骨基质的组织相容性.结果与结论:脱钙骨基质呈多孔海绵状三维结构,孔径在210-320 um之间,孔隙率为92%,体外降解12周降解率达90%以上,脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞共培养第2,4,6天的黏附率分别为(51.50±2.30)%,(94.13±2.14)%和(87.24±1.75)%.兔体内植入6周后脱钙骨基质周围界面未引起明显的炎症和排斥反应,并形成软骨样结构和少量骨组织.说明脱钙骨基质具有适宜的三维多孔结构,降解时间和软骨形成时间同步,同种异体脱钙骨基质与种子细胞黏附率高,与细胞组织相容性好,能满足软骨组织工程对支架材料的要求,是理想的软骨组织工程的支架材料.     

异种生物衍生骨支架材料的制备及性能

背景：异种骨来源丰富,价格低廉,处理相对简单容易,处理后骨支架保留原有骨的微结构,具有良好的促成骨、骨传导及骨诱导活性。目的：检测自制生物衍生骨支架材料的理化性质及体外细胞相容性。方法：通过脱蛋白、脱脂、脱钙,深低温冻存制备猪源性松质骨支架材料。组织学检测松质骨处理前后的变化,扫描电镜观察材料结构及计算孔隙直径,采用液体置换法检测支架材料的孔隙率,体外降解速度,能谱分析及体外复合兔骨髓间充质干细胞的细胞相容性。结果与结论：处理后的松质骨支架材料具有三维多孔结构,孔隙直径150.8-306.7μm,孔隙率84.5%-89.7%。材料在前6周降解速度稍慢,6周后材料降解率曲线基本呈线性且降解速度明显加快,10周时材料接近完全降解,降解率达92.8%。松质骨支架材料孔隙大小适合骨髓间充质干细胞的黏附和增殖。表明生物衍生骨支架材料性能良好,细胞相容性良好,适用于构建组织工程骨。     

丝素蛋白/壳聚糖复合支架材料的细胞相容性

背景：大量研究表明丝素蛋白、壳聚糖为天然高分子材料,具有良好的细胞生物相容性。目的：探讨丝素蛋白/壳聚糖复合支架材料与诱导的兔骨髓间充质干细胞的生物相容性。方法：将兔骨髓间充质干细胞分离培养、诱导后,与丝素蛋白/壳聚糖三维支架材料体外共培养,以材料的细胞毒性、细胞增殖活力、材料细胞黏附率及扫描电镜等检测评价材料的细胞相容性。结果与结论：经诱导后的骨髓间充质干细胞在支架材料上黏附、生长良好,保持正常的分裂增殖速度;随时间的增加,细胞黏附率增加,材料组较对照组黏附率强,差异有显著性意义（P〈0.05）。扫描电镜观察发现细胞接种48h后细胞生长良好,与支架黏附紧密,增殖分裂活跃。说明丝素蛋白/壳聚糖三维支架材料具有良好的细胞相容性。     

同种异体脱钙松质骨基质材料复合自体骨髓间充质干细胞修复全层关节软骨缺损

背景：到目前为止，还没有一种十分有效的方法治疗关节软骨缺损。许多治疗方法都只能缓解临床症状，而不能有效促进软骨的再生，也不能恢复软骨表面的承重功能。目的：观察脱钙骨基质复合骨髓间充质干细胞修复兔膝关节全层软骨缺损的疗效。设计、时间及地点：随机对照动物实验，分别于2005—01／03在兰州大学第二医院骨科研究所和2008-05／08在桂林医学院中心实验室完成。材料：取新西兰兔四肢骨干骺端及椎体松质骨，脱钙制备脱钙松质骨基质材料；体外分离培养同种新西兰兔骨髓间充质干细胞种植于脱钙骨基质支架上体外培养。36只新西兰兔随机分成骨髓间充质干细胞复合同种异体脱钙骨填充组（简称复合组）、同种异体脱钙骨填充组及空白对照组，每组12只。方法：在髁间窝髌面上用直径4mm的钻头钻孔深约3mm造成膝关节全层软骨缺损模型。复合组双侧股骨髁间窝软骨缺损处植入脱钙骨基质吸附体外分离培养的自体骨髓间充质干细胞复合物；同种异体脱钙骨填充组单纯植入脱钙骨基质；空白对照组不作任何植入。主要观察指标：分别于植入后4，8，12周取材进行组织学及免疫组化染色观察，根据关节软骨组织学计分标准进行评分。结果：36只新西兰兔均进入结果分析。复合组所修复组织为透明软骨样修复：而同种异体脱钙骨填充组和空白对照组为纤维性修复。植入后12周复合组大体评分及组织学评分明显低于同种异体脱钙骨填充组和空白对照组（P〈0．05）；同种异体脱钙骨填充组低于空白对照组（P〈0．05）。结论：运用软骨组织工程的原理，以脱钙骨基质为支架材料的自体骨髓间充质干细胞移植是一种修复软骨缺损的行之有效的方法。     

脱细胞支架复合兔骨髓间充质干细胞构建组织工程血管

背景:目前临床使用的小口径(<6 mm)人工血管因生物相容性差、远期通畅率低,效果并不理想.因此,学术界一直致力于寻找具有正常血管生物学功能的血管代用品,组织工程血管的构建与功能研究已成为目前热门研究课题.目的:将兔骨髓间充质干细胞与脱细-胞血管支架动态复合培养体外构建组织工程血管,通过体内移植实验,探讨该组织工程血管的组织相容性及通畅率.设计、时间及地点:随机对照实验,细胞学、组织病理学观察,于2006-01/2008-06在南京大学医学院附属鼓楼医院实验室完成.材料:通过去污剂-酶消化法制备兔腹主动脉脱细胞支架;采用密度梯度离心法结合贴壁分离培养法,分离扩增兔骨髓间充质干细胞,将扩增后的干细胞静态种植于脱细胞支架后置于生物反应器中动态培养构建组织工程血管.方法:60只兔随机均分为3组,剪取一段腹主动脉长约1.0 cm,再将移植血管以8/0聚丙烯线间断外翻吻合到腹主动脉上.组织工程血管组:受体为对应抽取骨髓干细胞的实验兔,以组织工程血管为移植血管;脱细胞血管支架组:以脱细胞处理的同种异体腹主动脉为移植血管;同种异体血管组:以同种异体新鲜腹主动脉作为移植血管.主要观察指标:对培养的骨髓间充质干细胞进行免疫组化鉴定;血管移植后3个月行数字减影血管造影、病理切片、扫描电镜等观察移植效果.结果:兔骨髓间充质干细胞在体外培养8 d后形成漩涡状排列,免疫组化结果符合间充质干细胞表型特征:将间充质干细胞与脱细胞支架置于生物反应器培养12 d后,种子细胞在血管腔内黏附生长;血管移植3个月后,组织工程血管组、脱细胞血管支架组通畅率分别为90%,80%,均优于同种异体血管组(25%).移植3个月后苏木精一伊红染色及扫描电镜结果显示,组织工程血管组形成清晰的内、中、外膜3层结构,形态接近正常动脉,内皮细胞覆盖完整;脱细胞血管支架组血管内表面内皮细胞覆盖不完整,伴有附擘血栓形成,内膜轻度增生,伴炎性细胞浸润:同种异体血管组内膜极度增厚、坏死,管腔明显狭窄,伴不同程度的血栓机化.结论:将兔骨髓间充质干细胞复合脱细胞血管支架上,可获得一种具有良好生物相容性和通畅率的生物人工血管.     

丝素蛋白/壳聚糖复合支架材料的细胞相容性

背景:大量研究表明丝素蛋白、壳聚糖为天然高分子材料,具有良好的细胞生物相容性.目的:探讨丝素蛋白/壳聚糖复合支架材料与诱导的兔骨髓间充质干细胞的生物相容性.方法:将兔骨髓间充质干细胞分离培养、诱导后,与丝素蛋白/壳聚糖三维支架材料体外共培养,以材料的细胞毒性、细胞增殖活力、材料细胞黏附率及扫描电镜等检测评价材料的细胞相容性.结果与结论:经诱导后的骨髓间充质干细胞在支架材料上黏附、生长良好,保持正常的分裂增殖速度;随时间的增加,细胞黏附率增加,材料组较对照组黏附率强,差异有显著性意义(P<0.05).扫描电镜观察发现细胞接种48 h 后细胞生长良好,与支架黏附紧密,增殖分裂活跃.说明丝素蛋白/壳聚糖三维支架材料具有良好的细胞相容性.     

兔骨髓间充质干细胞与异体脱细胞耳软骨支架的体外复合

背景：耳软骨作为脱细胞基质可选择的支架,进行脱细胞处理可去除了软骨细胞的抗原性,从而与种子细胞具有良好的相容性。目的：体外提取、培养兔骨髓基质干细胞,并与异体脱细胞耳软骨支架复合,观察其生物相容性。方法：提取兔骨髓间充质干细胞行体外培养,诱导为软骨细胞,以胰蛋白酶-曲拉通联合法获得脱细胞软骨支架,将两者于体外复合,10d后复合支架固定行组织学染色及扫描电镜观察。结果与结论：兔骨髓间充质干细胞体外诱导14d可形成软骨细胞,Ⅱ型胶原免疫细胞化学示胞浆呈棕黄色;兔耳软骨脱细胞基质呈乳白色,组织学染色及扫描电镜观察示经脱细胞后支架孔隙均匀,结构完整,仍保存大量酸性黏多糖及胶原成分。其孔径长度（33.70±4.33）μm,孔隙率（65.23±7.35）%。复合支架组织学染色及扫描电镜示两者黏附良好,并伴有多量基质分泌。说明兔骨髓间充质干细胞诱导为软骨细胞与异体脱细胞耳软骨有良好的生物相容性。     

骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质的生物相容性

背景:在尿路缺损修复中,骨髓间充质干细胞-膀胱脱细胞基质复合物有望形成上皮层、肌层及血管化。目的:观察骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质的生物相容性。方法:将第4代兔骨髓间充质干细胞按1.0×109L-1种植于同种异体兔膀胱脱细胞基质支架上,以单独培养骨髓间充质干细胞为对照。绘制两组细胞生长曲线图,对比观察两条生长曲线有无差异。结果与结论:骨髓间充质干细胞在膀胱脱细胞基质表面能够很好的贴附、分裂生长,且细胞生长曲线与对照组相似,说明骨髓间充质干细胞在膀胱脱细胞基质表面生长良好,相容性较好。     

异种脱蛋白松质骨支架构建组织工程骨用于脊柱横突间融合

背景:异种脱蛋白松质骨来源广泛且具有独特的生物学特性,若能解决其免疫原问题,将有望利用异种脱蛋白松质骨开发出一种新型植骨材料.目的:探讨异种脱蛋白松质骨作为骨组织工程支架的性能,及其在山羊脊柱横突间融合中的作用.设计、时间及地点:细胞-支架学体内实验,于2008-02/10在黑龙江省纤维化生物治疗重点实验室完成.材料:6～8月龄健康雄性山羊12只,由牡丹江医学院动物中心提供.方法:取成年猪股骨远端松质部分,通过理化方法制成脱蛋白松质骨支架,对其形态结构、组成成分、生物力学特性以及材料对种子细胞生物学行为的影响进行检测分析.羊髂骨穿刺取骨髓,梯度密度离心法分离获得第3代骨髓间充质干细胞.将支架材料复合一定量的自体骨髓间充质干细胞、重组人骨形成蛋白2构建组织工程骨.12只羊建立L3、4双侧横突间植骨模型,修复组于左侧植入组织工程骨,对照组于右侧植入相同体积的自体髂骨.主要观察指标:分别于植入后4,8,12周行X射线片和组织学观察对比分析.结果:采用脱蛋白处理后的松质骨可见大小不等、相互交通、开放孔隙的网架结构:孔径200～500 μm,孔隙率60%左右,其无机成分为羟基磷灰石,有机成分为胶原,力学性能保存良好,细胞相容性良好.X射线片结果显示:植入第4周,横突桥接处部分区域模糊,以内侧明显,此时修复组材料密度略低于对照组;第8周上下桥接部间隙变小,大量连续骨痂生成;12周后完全融合,两组材料密度接近.移植区组织学观察结果显示:修复组植入后第4周以多点方式形成新骨,第8周岛状生成的骨组织贯穿整个移植材料,12周编织骨交错排列,髓腔形成,成骨活性接近自体髂骨移植;对照组植入后4周有较多新骨形成,8周时出现大量胶原纤维,周边成骨明显,至12周纤维组织减少,成骨活跃.结论:以异种脱蛋白松质骨为支架材料,复合骨髓间充质干细胞、重组人骨形成蛋白2构建组织工程骨,体外X射线衍射分析及力学测试与体内成骨实验均证明其具有良好的组织相容性和较强的成骨能力,是一种良好的组织工程骨支架材料.     

物理联合化学或化学方法处理去抗原异种松质骨支架与骨髓间充质干细胞的细胞相容性

背景：研究证明去抗原异种松质骨支架具有良好的理化性能和三维立体多孔结构,但应用于临床还需要考虑其安全性和生物相容性。目的：比较物理联合化学及化学方法处理去抗原异种松质骨支架与羊骨髓间充质干细胞的细胞相容性。方法：用梯度密度离心法分离培养羊骨髓间充质干细胞,四甲基偶氮唑盐比色法检测物理联合化学及化学方法处理去抗原异种松质骨支架材料对骨髓间充质干细胞增殖的影响。取第3代骨髓间充质干细胞,接种在两种支架上共同培养,倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞在两种支架材料上的形态、黏附、生长和增殖情况。结果与结论：物理联合化学组细胞毒性为0或1级,细胞能在材料上良好地黏附、增殖、生长,细胞活性未受到支架材料的影响。化学组细胞毒性为3级,细胞在材料上生长受到抑制,支架孔隙内无细胞黏附。提示经过物理联合化学处理的去抗原异种松质骨支架材料与羊骨髓间充质干细胞具有良好的生物相容性;单纯经过化学处理的支架材料生物相容性较差,不符合生物材料安全性标准。